Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

1. Sammlung, Lagerung und Vorbereitung von Serum-und bronchoalveolären Lavage

1. Serum, entnommen aus unbehandelten Blutproben, indem sie die Blutgerinnung bei 4 ° C, und speichern Serum als Aliquots bei -20 ° C erwärmen lassen. Bronchoalveolären Lavage (BAL) sollte auch als Aliquots bei -20 ° C gelagert werden Hinweis: Die Lagerung von Serum und BAL als Aliquots das Potenzial für den Abbau der Ziel-Antigen, das durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben während einer Wiederholung des Tests begrenzt.
2. Tauwetter Proben und mischen Sie die Serum und BAL-Proben gründlich durch Vortexen und Zentrifugation für 1 min bei 14.000 Umdrehungen pro Minute.
3. Für die Routineprüfung der menschlichen Serumproben, verdünnt das Serum 1:1 (v / v) mit Gewebekulturmedium (TCM). TCM besteht aus RPMI-1640-Medium, 10% (v / v) fötalem Kälberserum, 1% (v / v) von 200 mM L-Glutamin-Lösung, und Natriumazid (0,02% w / v) als Konservierungsmittel. Das Medium wird im Voraus vorbereitet und können bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert werden. Tragen Sie 100 ul der DILUTed Serum auf die LFD.
4. Für menschliche BAL-Flüssigkeiten, und für BAL-Flüssigkeiten aus Tiermodellen, gelten 100 ul Probe ordentlich auf die LFD, ohne Vorbehandlung.
5. Für Serum von Tiermodellen, verdünnte Serum 1:2 (v / v) mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, enthaltend 4% (w / v) EDTA, Wärme für 3 min in einem kochenden Wasserbad, Zentrifuge für 5 min bei 14.000 rpm und Einsatzes von 100 ul des reinen Überstands an die LFD-Gerät.

2. Anwendung von Serum und BAL auf die Lateral-Flow Geräte-

1. Lagern Sie die Lateral-Flow-Geräten bei Raumtemperatur (23 ° C). Bei dieser Temperatur sind Geräte für 12 Monate stabil. Entfernen Sie die Geräte aus den Beuteln und Ort auf einer ebenen Fläche.
2. Mit einer sterilen Pipettenspitze, gelten 100 ul vorbehandelten Serum oder ordentlich BAL-Probe zur Freisetzung Port des Geräts.
3. Lassen Sie die Assay für 15 Minuten bei Raumtemperatur, zu welchem ​​Zeitpunkt die Ergebnisse der Prüfungen aufzuzeichnen ausgeführt werden soll. Hinweis: Innerhalb von Sekunden wird die Flüssigkeit an sich seinde durch Kapillarwirkung entlang der Nitrocellulose-Membran im Beobachtungsfenster zu migrieren.

3. Aufnahme und Interpretation LFD Ergebnisse

1. Die LFD besteht aus einem internen Steuerleitung (angedeutet durch den Buchstaben C auf dem Kunststoff-Gehäuse) und eine Testlinie (gekennzeichnet mit dem Buchstaben T). Die Steuerung sollte in jedem Fall unabhängig von Aspergillus-Antigen werden im Serum oder BAL-Probe. Dies zeigt, dass der Test korrekt ausgeführt werden.
2. Wenn die Aspergillus-Antigen im Serum oder BAL-Probe, wird die Testlinie auch innerhalb 15 Minuten der Probe Anwendung angezeigt. Da die Intensität der Testlinie ist proportional zu der Menge von Aspergillus-Antigen in der Probe vorhanden, die Testlinie kann schwach positiv (+) angezeigt wird, eine moderate positiv (+ +) oder als stark positiv (+ + +) . Jedoch eine beliebige positive Testleitung, unabhängig von Intensität, deutet dies auf der Aspergillus-Antigen in der Probe. In the Abwesenheit von Aspergillus-Antigen, wird keine Testlinie erscheinen, und das Ergebnis wird als negativ aufgenommen (-).

4. Repräsentative Ergebnisse

Repräsentative Beispiele für negative, schwach positive, mäßig positive und stark positive Ergebnisse mit LFD BAL und Serum-Proben sind in Abbildung 1 dargestellt.

Ergebnisse der Antigen-positiven Tests LFD (schwache und starke) oder negativ LFD Tests mit BAL-Flüssigkeiten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach Anspruch EORTC / MSG diagnostischen Kriterien diagnostiziert werden in Tabelle 1 gezeigt. In dieser Tabelle sind die entsprechenden klinischen und mykologischen (Galaktomannan und Kultur) Daten und Ergebnisse einer Aspergillus-spezifischen PCR-Test in St. Bartholomews Krankenhaus ⁸ entwickelt, für jeden Patienten. Die Diagnose der Krankheit wurde am Wirtsfaktoren (Neutropenie, verlängerter Einsatz von Kortikosteroiden, Behandlung mit anderen anerkannten T-Zell-immunos Basisuppressants), klinische Kriterien und GM Positivität für BAL (hier als GM-Index-Wert> 0,8 definiert). Unter den 2002 EORTC / MSG-Richtlinien ^10, Patienten, 12, 13 und 16 wurden mit "möglich" IA auf der Basis von Host-Faktoren und klinischen Kriterien oder GM Positivität diagnostiziert. Nach den revidierten (2008) EORTC / MSG-Richtlinien ^2, Wirtsfaktoren und GM Positivität allein oder Host-Faktoren und klinischen Kriterien allein würde nicht darauf hin, "möglich" invasiven Pilzinfektion, es sei denn durch Belege aus klinischen Daten und Mykologie bzw. begleitet. Patient 6 wurde mit "wahrscheinlich" IA unter beiden Richtlinien 2002 und 2008 wegen der Wirtsfaktoren, größere und kleinere klinische Merkmale und GM Positivität diagnostiziert. Beachten Sie, dass, während weder die LFD noch PCR-Assays zur Zeit in EORTC / MSG-Richtlinien enthalten sind, gibt es starke Übereinstimmung zwischen den beiden Assays und der kommerziellen Galaktomannan Test auf das Vorhandensein von Aspergillus-Antigen und Nukleinsäure in der BAL-Probe s der Patienten 6 und 12. Zusätzliche Ergebnisse von Studien, die die Wirksamkeit der LFD und PCR-Test bei der Diagnose von IPA kann in Johnson et al ⁸ zu finden.

Abbildung 1. Negativ (Steuerleitung nur) und positiven (Kontroll-und Testlinie) Ergebnisse der Tests mit LFD Serum und BAL. Die Intensitäten der Testlinie Reaktionen sind proportional zu den Konzentrationen der Ziel-Antigen im Serum und BAL-Proben. Reaktionen typischerweise im Bereich von schwach (+) durch moderate (+ +) bis stark (+ + +). Unabhängig von Testlinie Intensität würden alle drei Serum-positiven Reaktionen zeigen Lungenaspergillosen Krankheit aufgrund der Anwesenheit von zirkulierenden Aspergillus-Antigen im Blut. Positiv BAL Reaktionen (schwach, mittel oder stark) würde anzeigen, Keimen der Sporen und Entwicklung von potentiell pathogenen Hyphen in der Lunge.

^Ein Knötchen oder Halos auf einer Computertomographie ist suggestive der Pilzinfektion
² Candida glabrata in der BAL würde als Verunreinigung angesehen werden, da es die zweithäufigste Hefe als Teil der normalen menschlichen Flora ⁹ isoliert ist
³ Ein Index von> 0,8 in der GM EIA Test der BAL ist bezeichnend für Aspergillus-Infektion
⁴ auf den 2002 EORTC / MSG diagnostischen Kriterien für 'Basierend possible "," wahrscheinlich "oder" bewiesen "invasive Pilzerkrankung ^10
5 auf den überarbeiteten (2008) EORTC / MSG diagnostischen Kriterien für "möglich", "wahrscheinlich" oder "bewiesen" invasive Pilzerkrankung ² Basierend

Tabelle 1. Die Ergebnisse der Tests von LFD BAL-Proben von akuter myeloischer Leukämie Patienten mit wahrscheinlicher IPA und Kontrolle von AML-Patienten (keine Anzeichen einer Infektion) und EORTC / MSG Diagnose einer Infektion.

Wir haben nichts zu offenbaren.