TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung Vibrio cholerae On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Summary

Eine schnelle Methode, um das Genom zu ändern V. cholerae Beschrieben. Diese Änderungen umfassen das Löschen von einzelnen Genen, Gen-Cluster und genomische Inseln sowie die Integration von kurzen Sequenzen (zB Promotorelemente oder Affinitäts-tag-Sequenzen). Das Verfahren basiert auf der natürlichen Transformation und FLP-Rekombination.

Abstract

Mehrere Methoden stehen zur Verfügung, um zu manipulieren bakteriellen Chromosomen ^1-3. Die meisten dieser Protokolle beruhen auf der Einbringung von konditional replizierende Plasmide (z. beherbergen pir-abhängigen oder temperaturempfindlichen Replikons ^1,2). Diese Plasmide sind in bakteriellen Chromosomen auf Homologie-vermittelte Rekombination integriert. Solche Insertions-Mutanten werden häufig direkt in der experimentellen Einstellungen verwendet. Alternativ kann Selektion auf Plasmid Exzision durch seinen Verlust gefolgt durchgeführt werden, die für Gram-negative Bakterien häufig der Zähler wählbare Levansucrase Enzyms durch die sacB Gen ⁴ codiert wird. Die Excision kann entweder wieder die vor dem Einsetzen Genotyp oder führen zu einem Austausch zwischen dem Chromosom und dem Plasmid-kodierten Kopie des modifizierten Gens. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass es zeitraubend ist. Das Plasmid muss zuerst geklont werden, sondern erfordert horizontalen Transfer in V. cholerae (höchstens n otably durch Paarung mit einem E. coli Donor-Stamm) oder künstliche Umwandlung der letzteren, und die Exzision des Plasmids ist zufällig und kann entweder wieder die anfängliche Genotyp oder erzeugen die gewünschte Modifikation, wenn kein positiver Selektion ausgeübt wird. Hier präsentieren wir eine Methode für die schnelle Manipulation der V. cholerae-Chromosom (s) ⁵ (Abbildung 1). Diese TransFLP Verfahren basiert auf der kürzlich entdeckten Chitin-vermittelte Induktion der natürliche Kompetenz in diesem Organismus ⁶ und anderen Vertreter der Gattung Vibrio wie V. basierend fischeri ^7. Natürliche Kompetenz ermöglicht die Aufnahme von freier DNA einschließlich PCR-generierten DNA-Fragmenten. Sobald aufgenommen, rekombiniert die DNA mit dem Chromosom bei Vorliegen einer minimalen von 250-500 bp der flankierenden homologen Bereich ^8. Einschließlich einen Selektionsmarker in-zwischen diesen flankierenden Regionen ermöglicht eine einfache Erkennung von häufig auftretenden Transformanten. t "> Diese Methode kann für verschiedene genetische Manipulationen von V. cholerae verwendet werden und möglicherweise auch andere natürlich kompetente Bakterien. Wir bieten drei neue Beispiele, was man mit dieser Methode zusätzlich zu unseren bereits veröffentlichten Studie auf einzelne Gen-Deletionen und durchgeführt werden Neben der Affinität-tag-Sequenzen ^5. Mehrere Optimierungsschritte über die erste Protokoll von Chitin-induzierte natürliche Transformation ⁶ sind in diesem TransFLP Protokoll aufgenommen. Dazu gehören unter anderem der Austausch von Krabben Granatsplitter durch kommerziell erhältliche Chitin Flocken ^8, die Spende von PCR abgeleiteten DNA als transformierenden Materials ^9, und die Addition von FLP-Rekombination Zielstellen (FRT) ^5. FRT erlauben ortsspezifische Exzision des Selektionsmarkers durch die Rekombinase Flp ¹⁰ vermittelt.

Protocol

Die TransFLP Methode (Abbildung 1) durch drei verschiedene Ansätze exemplifiziert: I) die Deletion von zwei benachbarten Genen Virulenzeigenschaften V. cholerae (zB ΔctxAB), II) die Entnahme einer Pathogenitätsinsel (zB ΔVPI-1), und III) die Integration eines T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotorsequenz stromauf von einer Gen-von-Interesse, das anschließend erlaubt seinen künstliche Expression in dem jeweiligen Stamm Hintergrund (zB T7-tfox) (Abbildung 2).

Ein. Vorbereitung der Chitin Flakes

1. Gewicht 50-80 mg von Chitin Flocken in einem Standard 1,5 ml Plastikröhrchen. Dies kann in Substanz hergestellt werden. Chitin Flocken sind kommerziell erhältlich von Sigma (Kat. Zahl C9213).
2. Autoklavieren der Flocken halten die Deckel der Rohre offen.
3. Schließen Sie sofort die Deckel nach dem Autoklav abgekühlt hat.
4. Shop autoklaviert Chitin Flockenbei Raumtemperatur.

2. Optional: Artificial Transformation von V. cholerae mit Flp-Rekombinase-kodierende Plasmide

1. Bereiten elektrokompetente V. cholerae Zellen unter Verwendung von Standardverfahren ^11. Aliquots speichern kompetenter Zellen bei -80 ° C
2. Fügen Sie 1-2 ul einer regelmäßigen Mini-Präparation von Plasmid pBR-flp ⁵ zum elektrokompetente V. cholerae-Zellen und Übertragen der Mischung in eine Elektroporation Küvette (0,2 cm Spaltbreite).
3. Tragen Sie einen Puls bei 1,6 kV.
4. Fügen Sie 0,9 ml SOC-Medium, übertragen Sie leicht Zelle zu einer Standard-14-ml-Tube. Inkubieren unbewegten für 2,5 bis 3 Stunden bei 30 ° C.
5. Tafel 100 ul und 300 ul auf LB-Platten mit 100 ug / ml Ampicillin und inkubieren bei 30 ° C über Nacht.
6. Entschlacken einzigen Klon und speichern wie Glycerin Lager für zukünftige TransFLP Experimente.

3. Oligonukleotid Design und Polymerase-Kettenreaktion

1. Mindestens sechs Oligonukleotiden erforderlich sind, um die DNA-Region (en) von Interesse als auch die FRT-Kassette flankiert Antibiotikums durch PCR (Abbildung 3) zu amplifizieren. Es empfiehlt sich, auch ein Paar von Oligonukleotiden Priming außerhalb des PCR-Fragment eingefügt. Dies ermöglicht die Überprüfung der Integration und Excision des korrekten FRT-flankiert Antibiotikaresistenz Kassette (z. B. als "CHK-up" und "CHK-down"-Primer in den 3 bis 5 dargestellt).
2. Entwerfen der Oligonukleotide # 2, # 3, # 4 und # 5 mit Sorgfalt. Sie sollten in der Lage sein, ausreichend annealen (zB ~ 28 bp) an die Template-DNA. Der Template-DNA genomische DNA ist (gDNA) zum Primern # 2 und # 5 und FRT-Kan-FRT-enthaltenden Plasmid-DNA, wie pROD17 ¹² und pBR-FRT-KAN-FRT (diese Studie) zum Primern # 3 und # 4 ( 3A).
3. Design Die Primer # 2 bis # 5 ermöglicht eine umfassende Basenpaarung an ihrem 5'-Ende zwischen Nr. 2 / Nr. 3 und Nr. 4 / Nr. 5 bzw. (3A Kasten). Zwei Runden PCR folgen.
4. Führen Sie drei unabhängige PCR-Reaktionen als 1 ^Runde der PCR. Die erste wird amplifizieren die upstream-Region des Gens / DNA-Bereich-von-Interesse mit Hilfe der Oligonukleotide Nr. 1 und Nr. 2. Das PCR sollte in einem Fragment von mindestens 500 bp in der Länge um eine homologe Rekombination in den Zellen ermöglichen führen. Kürzere Fragmente (~ 250 bp) eine ausreichende ⁸ sein, aber werden nicht empfohlen.
5. Parallel führt die zweite PCR, die die FRT-Kassette flankiert Antibiotikum verstärkt. Für die Beispiele hier bereitgestellten wir hauptsächlich verwendet aph (kan ^R). Verwendung Oligonukleotiden # 3 und # 4 für diese Reaktion (Abbildung 3A).
6. Begleitend verstärken die stromabwärts gelegenen DNA-Bereich durch PCR (drittes Beispiel). Das PCR-Fragment sollte ebenfalls mindestens 500 bp in der Länge sein. Durchführen der PCR mit gDNA als Template und Oligonukleotide # 5 und # 6 (Abbildung 3A).
7. Nach Reinigung aller drei PCRFragmente, führen Sie die 2. ^Runde der PCR. Verwenden Sie die gleiche Mischung aus allen drei Fragmente in der ersten Runde als Vorlage erhalten. Die Verstärkung wird durch Oligonukleotide Nr. 1 und Nr. 6 katalysiert. Das resultierende PCR-Fragment (3B) als transformierende DNA in der natürlichen Transformation Experiment (Abbildung 1).

4. Chitin-induzierte Natural Transformation

1. Wachsen V. cholerae Zellen aerob in Vollmedium bei 30 ° C, bis sie eine optische Dichte erreicht bei 600 nm von etwa 0,5.
2. Ernte der Bakterien durch Zentrifugieren. Waschen Pellet einmal in definierten künstlichen Medium (DASW ⁶⁾ vor Resuspendieren der Zellen in 2 Volumina DASW. 1 ml der Kultur auf 50-80 mg steriles Chitin Flocken (erläutert unter Punkt 1). Wenn Bakterien Hafen Plasmid pBR-flp (optional Punkt 2), Add Ampicillin (50 ug / ml) zu der Kultur. Inkubation bei 30 ° C für 16-24 Stunden ohne Bewegung.
3. Add & ge; 200 ng des 2 ^nd-Runde PCR-abgeleiteten Fragment (erläutert unter Punkt 3). Vorsichtig mischen, ohne ausgiebig Ablösen der Bakterien von den Chitin Oberflächen. Inkubieren bei 30 ° C für 24 Stunden ohne Bewegung.
4. Vortex die Kultur ausgiebig für ≥ 30 sec. Verteilt 100-300 ul auf selektiven LB-Medium-Platten (zB Kanamycin oder Gentamicin-haltigen LB-Platten für die bereitgestellten Beispiele hier). Verwenden Sie doppelt selektiven Platten, wenn die Bakterien, die das Plasmid pBR-flp indem Ampicillin gleichzeitig die übrigen Antibiotika beherbergen. Inkubieren Platten bei 30 ° C für 16-24 h oder bis Kolonien sichtbar.
5. Isolieren einzelner Transformanten von selektiven Platten. Solche Transformanten haben den ursprünglichen chromosomalen Locus durch die PCR-Fragment durch eine doppelte Crossover-Ereignis ersetzt. Diese Stämme können direkt für weitere Versuche verwendet werden, falls das Entfernen des Antibiotikums Kassette nicht notwendig ist.

5. Entfernung von Selective Cassette (s) durch Flp-Rekombination

1. Künstlich verwandeln Sie Ihr Transformanten mit Plasmid pBR-flp wie unter Punkt 2 beschrieben, wenn nicht vor dem natürlichen Transformation Assay.
2. Die Bakterien wachsen auf LB-Agarplatten mit Ampicillin bei 37 ° C für 16-24 Stunden. Optionen: Ändern Sie die Temperatur zwischen 2-3 Stunden auf 40 ° C als Ausdruck flp aus dem Plasmid pBR-flp bei höheren Temperaturen ^5,10 de-unterdrückt; Übertragung Bakterien auf frische Platten nach ca. 8 h Inkubation.
3. Test für Antibiotika-Empfindlichkeit (hier für Kanamycin gezeigt; Abbildung 1) durch restreaking die Klone parallel auf Antibiotika-haltigen und Antibiotika-freien Agarplatten. Isolieren einzelner sensitive Kolonien. Frieren Ampicillin-resistente Klon als Glycerin Lager, wenn Sie weiter zu modifizieren die Belastung mit anderen Deletion / Insertion mit TransFLP wollen.

6. Plasmid Curing

1. Wachsen Kultur über Nacht unter aeroben Bedingungen undbei 30 ° C. Verwenden Vollmedium ohne Zusatz von Antibiotika.
2. Optional: Wachsen frische Kultur für 3-6 Stunden durch Verdünnen der Übernachtkultur 1:100 in frischem Antibiotika-freien Mediums.
3. Platte oder Streifen Verdünnung (n) der Kultur auf einfache LB-Agarplatte (en) und Inkubation bei 30 ° C für 8-16 h (bis Kolonien sichtbar sind).
4. Test auf Ampicillin-Sensitivität der Klone durch restreaking die Klone, die parallel auf Antibiotikum-haltigen und Antibiotika-freien Agarplatten (Abbildung 1). Frieren Ampicillin-sensitiven Stamm wie Glycerin Lager.

Results

Repräsentative Ergebnisse der drei Beispiele sind in den 4 bis 6 gezeigt. Der erste Ansatz, der die Streichung der benachbarten Gene ctxA und ctxB soll. Gemeinsam codieren die wichtigsten Virulenzfaktor von V. cholerae, Cholera-Toxin. Wir entwickelten Oligonukleotiden zur TransFLP Verfahren wie oben beschrieben und gemäß 3. Die elterliche Stamm wurden die Zwischenschicht Stamm, die FRT-flankiert Antibiotikaresistenz Kassette in der ursprünglic...

Discussion

Die TransFLP oben beschriebenen Methode und anderswo ⁵ wurde ausgiebig in unserem Labor verwendet. Die Art der genetischen Manipulationen, die durchführbar sind, umfassen unter anderem: Deletion einzelner Gene und Gencluster, Deletion Genominseln (zB VPI-1), Insertion von Sequenzen stromaufwärts eines Gens von Interesse (z. B. Promotorsequenzen) und Einführen Sequenzen am Ende eines spezifischen Gens (zB Codierung Affinitätstags).

Ein Import Voraussetzun...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Chitin Flocken	Sigma	C9213	Autoklavieren erforderlich
OPTIONAL: Micropulser (bei Antibiotika-Kassette sollte durch Flp Rekombinase auf pBR-flp kodiert herausgeschnitten werden)	Biorad	165-2100	Oder vergleichbare electroporators