Ausdauertraining Protokoll und Längs-Performance-Assays für Drosophila melanogaster

Summary

Wir beschreiben die erste Ausdauertraining Protokoll für ein wichtiges genetisches Modell Spezies, Drosophila melanogaster, Und skizzieren verschiedene Assays zur Verbesserung der Mobilität nach dem Training zu verfolgen.

Abstract

Eines der dringendsten Probleme der modernen medizinischen Forschern ist die wogenden Ebenen der Adipositas, mit der der damit verbundenen Erkrankungen wie Diabetes und Herz-Kreislauferkrankungen ^1-3. Ein wichtiges Thema der Forschung in diesen assoziierten gesundheitlichen Problemen betrifft die Rolle der Ausdauersport als vorteilhaft Intervention.

Körperliches Training ist eine preiswerte, nicht-invasive Intervention mit mehreren positiven Ergebnisse, einschließlich der Reduzierung der überschüssigen Körperfetts ^4, erhöhten Insulinsensitivität der Skelettmuskulatur ^5, erhöht entzündungshemmende und antioxidative Reaktionen ^6, und eine verbesserte kontraktile Kapazität in Kardiomyozyten ^7. Niedrige Intensität Übung ist bekannt, dass die mitochondriale Aktivität und Biogenese beim Menschen ⁸ und Mäuse zu erhöhen, mit der transkriptionellen Coaktivator PGC1-α als wichtiges Zwischenprodukt ^9,10.

Despite die Bedeutung von Bewegung als Instrument zur Bekämpfung von mehreren wichtigen altersbedingte Krankheiten, haben umfangreiche longitudinale genetische Untersuchungen durch das Fehlen eines Ausdauertrainings Protokoll für eine kurzlebige Arten genetisches Modell behindert. Die Vielfalt der genetischen Werkzeuge zur Verfügung für den Einsatz mit Drosophila, zusammen mit seiner kurzen Lebensdauer und kostengünstige Wartung, machen ihn zu einem attraktiven Modell für die weitere Erforschung dieser genetischen Mechanismen. In diesem Sinne haben wir eine neue Vorrichtung, wie der Power Tower bekannt, für groß angelegte Übung-Ausbildung in Drosophila melanogaster ¹¹ entwickelt. Der Power Tower nutzt den Fliegen instinktive Verhalten negativ Geotaxis um wiederholt induzieren schnelle Klettern. Jedes Mal, wenn die Maschine hebt, dann fällt er die Plattform von Fliegen, die Fliegen werden induziert, um zu klettern. Fliegen weiterhin so lange wie die Maschine in Betrieb ist oder bis sie zu ermüdet, um zu reagieren zu reagieren. So kann der Forscher mit dieser Maschine zu liefern simultaneous Ausbildung einer großen Anzahl von alters-und genetisch identisch Fliegen. Zusätzlich beschreiben wir damit verbundenen Tests nützlich, um Längs Fortschritt der Fliege Kohorten während des Trainings verfolgen.

Protocol

1. Power Tower Einrichtung und Bedienung

1. Der Power Tower wird auf einem rechteckigen Stück Sperrholz, die auf einem Tisch platziert wird eingespannt. Ein 4,5 min Getriebemotor von Grainger ruht auf vier 2 "x6"-Boards und ein ¾ Zoll Sperrholzplatte. Der Motor, ein AC / DC Regler, eine Sicherung, und ein Ein / Aus-Schalter werden zu einem Zeitpunkt verdrahtet.
2. Zur Kühlung des Motors wird ein Loch 3 Zoll im Durchmesser in einer vertikalen ½-Zoll-Stück Sperrholz geschnitten. Auf der einen Seite, wird ein 3-Zoll-Lüfter mit dem Sperrholz befestigt ist, und auf der anderen, ein 3-Zoll-Durchmesser Metallzylinder befestigt ist.
3. Ein maßgeschneidertes Dreharm mit einer Rolle an dem Ende angebracht ist, um dem Motor verbunden. Der Motor und die angeschlossenen Arm in einer Richtung im Uhrzeigersinn drehen, schieben sich entlang einer Seite eines gebogenen ¾ Zoll Vierkantrohr Lager, die das Sperrholz mit einem Türscharnier befestigt ist. Ein Rad wird auf der Oberseite des Rohrschaftteils unterhalb der Plattform befestigt, damit sie gegen die Plattform, dir ist rollenectly darüber.
4. Der Arm drückt nach unten auf ein Ende des Rohrmaterials und hebt das andere Ende, Anheben eines Zwei-Ebenen-Plattform (1D). Wenn die Rolle auf dem Arm des Rohrgutes löscht es kann der Arm in die Ausgangsposition zurückzukehren, fallen die Plattform zurück (1F).
5. Die Plattformen bestehen aus Regalen, die oben auf Sperrholz angebracht und gesichert durch Bungee-Seile, die auf Augen Schraube verhakt sind. Die Plattformen auf und ab gleiten entlang Schublade Schieberegler, die auf das Sperrholz mit Klammern befestigt werden.
6. Phiolen in den Gestellen angeordnet und durch einen quadratischen Raster Bildschirm, an Ort und Stelle mit Spannseile gehalten wird.
7. Ein Styropor-Polster wird unterhalb der Plattform, um den Schock des Tropfens dämpfen platziert.
8. Die Leistung des Motors eingestellt wird, dass eine vollständige Drehperiode 15 Sekunden lang ist.

2. Übung Protokoll

1. Fliegen werden in einem 25 ° C-Inkubator mit 50% Luftfeuchtigkeit und einer 12-stündigen Licht / da untergebrachtrk-Zyklus. Sowohl körperliches Training und Beurteilung der körperlichen Leistungsfähigkeit sind in einem 25 ° C temperierten Raum durchgeführt.
2. Fliegen werden gesammelt und im Alter passende innerhalb von 1-2 Tagen voneinander. Ein Minimum von 240 Fliegen ist für Längs-Überwachung von Ausdauer und negativen Geotaxis (Klettern) Fähigkeit, zwei physiologische Indikatoren, die die Auswirkungen von Ausdauertraining reflektieren erforderlich. Longitudinal Monitoring ermöglicht Isolierung der induzierte Änderung in Bezug auf Startwerte für jede Kohorte, ohne verwirrende Effekte aus Schwankungen zwischen den Kohorten. Fliegen für weitere Experimente sollten gesammelt als benötigt werden.
3. Nach der Entnahme sind Fliegen in 120 experimentelle Fliegen, die zum Trainingsprogramm und 120 steuern Fliegen, die nicht ausgeübt wird unterworfen werden geteilt. Die Fliegen werden in Fläschchen von 20 gespeicherten fliegt jeder. Die Fläschchen von experimentellen Fliegen gesteckt sind mit festen Celluloseacetat Flugs und die Fläschchen der Kontrolle (nicht ausgeübte) Fliegen gesteckt sind mit weichen sponge Stoppern, die nach unten geschoben werden, um die Fliegen, während auf der Power Tower immobilisieren können. Schwamm wird zur Immobilisierung verwendet, da der adaptive, Platz sparende Bauform in der Nähe der Boden des Fläschchens. Je weicher Schwamm-Material reduziert auch Verletzungen durch die solidere Flugs verursacht.
4. Fliegen auf dem Power Tower werden gespeichert und übte in Fläschchen, die 5 ml von Lebensmitteln, die sie bietet mit einer weicheren Landung als Fliegen, die in leeren Fläschchen ausgeübt werden, enthalten. Das Essen wird in der Regel von 10% Saccharose, 10% Hefe und 2% Agar in Wasser besteht, auch wenn wir nicht beachten Fliegen zu essen oft im Verlauf einer Trainingseinheit. Wenn leere Fläschchen während des Trainings verwendet werden, wird der Prozentsatz der Fliegen, die Verletzungen leiden dramatisch zugenommen.
5. Der Power Tower befindet sich in einem temperierten Raum, die bei 25 ° C gehalten wird betrieben Experimentelle Fliegen werden auf dem Power Tower gebracht und gemacht, um zu klettern. Control-Fliegen sind auch auf der Power Tower gelegt, aber der Schwamm Stopper ist pushed unten in das Fläschchen etwa 3 mm über die Fliegen, um eine Bewegung zu begrenzen. Diese Gruppe dient als Kontrolle für eventuelle Auswirkungen der Power Tower, die keinen Bezug zu trainieren sind. Obwohl einige Zimmer noch existiert für diese Fliegen zu manövrieren, haben wir wiederholt beobachtet, dass Fliegen unter diesen Bedingungen sehr wenig laufen und nicht demonstrieren eine physiologische Reaktion zu trainieren. Es kann auch wünschenswert sein, eine zusätzliche Kontrollgruppe, die nicht auf der Power Tower ist überhaupt angebracht sind.
6. Fliegen sind fünf aufeinander folgenden Tagen ausgeübt Jede Woche, unter Verwendung einer Rampe Zeitplan (Abbildung 2). Während der ersten Woche die Fliegen sind für 2 Stunden pro Sitzung, zwei Wochen für 2,5 Stunden pro Sitzung ausgeübt, und drei Wochen für 3 Stunden pro Sitzung an. Auch wenn andere Therapien getestet wurden, produziert dieses Protokoll konsistente Ergebnisse über Genotypen und unter unterschiedlichen Bedingungen. Dieses Protokoll ist, unterliegt jedoch einer Vielzahl von Variationsmöglichkeiten, die ein bestimmtes Experiment passen könnte.

1. Zeit bis zur Erschöpfung während des Ausdauertrainings ist ein nützlicher physiologischer Indikator, um zu bestätigen und / oder zu quantifizieren körperlichen Leistungsfähigkeit einer bestimmten Kohorte. Fatigue Tests können in Längsrichtung auf Kohorten, die in der Ausbildung Experimente verwendet werden soll durchgeführt werden. Assays können entweder vor dem Training durchgeführt werden, nach dem Abschluss der Ausbildung Protokoll, oder beides. Andere Zwischenzeit Punkte können hinzugefügt werden, wenn Charting inkrementellen Fortschritt während des Trainings gewünscht wird. Die Ermüdung Assay kann auch verwendet werden, um Trainingsausdauer als Reaktion auf andere Behandlungen als die Ausbildung Protokoll, wie Ernährung Veränderung (3B) zu messen.
2. Fatigue-Tests sollten an einem Tag durchgeführt werden, wenn Ausbildung nicht stattfindet. Sowohl die Versuchs-und Kontrollgruppen Fliegen werden auf dem Power Tower in Fläschchen mit je 20 platziert und machte zu klettern, bis ermüdet. Fatigue ist das Versäumnis, auf einen negativen Stimulus Geotaxis mit Klettern sein reagieren anerkanntVerhalten. Ermüdungsverhalten wird durch visuelle Beobachtung bewertet.
3. Ein Fläschchen von Fliegen gilt als "ermüdet", wenn 5 oder weniger Fliegen in der Lage, mehr als 2 Zoll für vier aufeinanderfolgende Tropfen klettern sind. Ermüdete Fläschchen werden von der Power Tower entfernt, während es noch in Betrieb ist, und der Zeitpunkt der Entnahme wird aufgezeichnet. Times of Entfernung kann als verschachtelte Histogramm oder als ein "Time-to-failure" Plot aufgetragen werden. Ein Beispiel für Daten, dargestellt als ein "Time-to-failure" Plot in 3B gezeigt wird.
4. Röhrchen werden bei Intervallen von 10 Minuten für maximal 10 Stunden (3B) überwacht.

4. Übung, Alter, Fähigkeit und Bewegungsapparates

1. Da diese Ausbildung Protokoll beruht auf induzierten Laufverhalten, ist eine primäre Assay zur Quantifizierung von Auswirkungen des Trainings in Längsrichtung messen Veränderung der durchschnittlichen Laufgeschwindigkeit während des Trainings. Im Laufe der Ausbildung werden 120-fly Kohorten ausgeübt und nicht ausgeübte fliegt täglich für ihre Reaktion auf eine negative Geotaxis s getestettimulus. Die RING-Technik in Gargano et al. (2005) wird verwendet, um die Fliegen 'Steigfähigkeit ^{12 zu} messen. Kurz gesagt, misst diese Technik durchschnittliche Körpergröße stieg um ein Fläschchen von Fliegen während einer definierten Zeit nach der Induktion von negativen Geotaxis. Die Höhe geklettert während einer definierten Zeit ist gleichbedeutend mit Steiggeschwindigkeit. Die Messungen werden vor dem Setzen Fliegen an der Maschine für das tägliche Training, um Komplikationen zu vermeiden, von Müdigkeit nach des Tages Lauf durchgeführt.
2. In unserem Standard-Protokoll, werden Fliegen für insgesamt drei Wochen ausgeübt und Steigfähigkeit ist für insgesamt fünf Wochen untersucht: drei Wochen während des Trainings-Training und zwei Wochen nach Beendigung der Übung (Abbildung 2). Dies ermöglicht es dem Experimentator zur Grafik, ob Auswirkungen von Bewegung auf die Mobilität nach Beendigung des Programms anhalten.
3. Vier Fotografien der jeweiligen Kohorte täglichen RING Leistung sind für die Analyse von Steigfähigkeit verwendet. Sechs Flaschen sind in jedem Foto enthalten. Negativ geotaxis induziert wird, und mit einem zeitgesteuerten Kamera wird ein Bild nach einer bestimmten Anzahl von Sekunden aufgenommen. Wir verwenden typischerweise zwei Sekunden, obwohl dies in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen variiert werden kann. Für jedes Foto, jedes Fläschchen wird in vier Quadranten gleicher Höhe geteilt, und Bildverarbeitungs-Software wird verwendet, um zuweisen Jede Fliege eine Partitur auf dem Quadranten es innerhalb des bewilligten Zeitraums erreicht basiert. Fliegen, die die oberste Quadranten erhalten eine Punktzahl von 4, klettern fliegt in die nächst höhere Quadranten erhalten eine 3, fliegt in der zweithöchsten Quadranten erhalten eine 2, und Fliegen in der untersten Quadranten erhalten eine 1. Fliegen, die nicht klettern aus der unteren überhaupt sind eine Punktzahl von 0 gegeben.
4. Für jedes Fläschchen in einem bestimmten Foto wird ein "Kletter-Index" durch Mittelung der Noten aller Fliegen in diesem Fläschchen generiert. Jedes Fläschchen die Indizes der vier Fotografien werden dann gemittelt, um eine endgültige Kletter-Index für diesen Tag geben.
5. Alle negativen Geotaxis Experimente werden durchgeführt Längsdinally. Die Ergebnisse werden auf der ersten "Pre-Übung" Score normiert, um den Effekt der Kohorte Variation in Steigfähigkeit zu reduzieren, und markieren Sie die relative Längenänderung in einer Kohorte die Steigfähigkeit als Ergebnis der Ausübung Ausbildung. Die ursprüngliche Partitur wird vom Durchschnitt der ersten drei Tage Klettern Indizes ermittelt und erhält ein Wert von 1. Nachfolgende Studien werden dann als Prozentsatz des ursprünglichen Index ausgedrückt.

5. Repräsentative Ergebnisse

Wildtyp-Fliegen an einem Langstrecken-Protokoll reagieren mit einer verminderten altersbedingte Abnahme der Steigfähigkeit, die nach dem Ende der Ausbildung bestehen, da es in Längs-RING-Assays auf fünf Wochen alt sind (Abbildung 3A) wider. Diese verzögerte Rückgang der negativen Geotaxis ist ein Standard phänotypischen Reaktion, die als positive Kontrolle zu dienen können, um sicherzustellen, dass Wildtyp-Bewegung wird normalerweise auftritt. Dieser Datensatz wird als ein Beispiel dargestellt, wie dieInduktion der Übung durch den Power Tower Programm kann als Verhaltens-Eingang verwendet werden. Die Fähigkeit verschiedener genetischer oder umweltbedingter Faktoren zu modulieren diesen Effekt kann dann beurteilt werden.

Umgekehrt kann der Power Tower auch als Ausgang in verschiedenen experimentellen Designs verwendet werden. Zum Beispiel kann Genotyp, Ernährung oder anderen variiert werden. Dann kann die Wirkung dieser Variationen auf Sportphysiologie getestet mit dem Power Tower werden. Hier zeigen wir ein Beispiel für diesen Ansatz. Wann fliegt mit einem unterschiedlichen Anteil an Saccharose in ihren Diäten wurden für Zeit, um Müdigkeit, erhöhter Gehalt an Saccharose mit einer erhöhten Ausdauerleistungsfähigkeit (3B) korreliert getestet.

Abbildung 1. Der Betrieb des Power Tower. (AC) Der motorisierte gebeugten Arm mit angehängten Walze dreht sich im Uhrzeigersinn, bis er in Kontakt mit dem gebogenen Vierkantrohr kommt. (D, E) DasArm nach unten drückt auf dem Vierkantrohr gebogen, wodurch die Plattform, die beladen mit Flaschen von Fliegen zu heben ist. (F) Wenn sich der Arm macht den Schlauch der Plattform erlaubt, wieder nach unten fallen wird, zwingt die Fliegen auf den Grund der Rücksendung Fläschchen.

Abbildung 2. Empfohlene Übung Protokoll. Fliegen unterzogen, um die Ausbildung Protokoll werden gebildet, um für fünf Tage üben jede Woche unter einem dreiwöchigen Kur hochgefahren, die schrittweise erhöht die Dauer der Belastung aus den ersten 2 Stunden mit 30 Minuten pro Woche. Standard-Analysen sind Müdigkeit Tests vor und nach dem Trainingsprogramm und RING-Assays von Woche 1 bis Woche 5. Alle Tests werden in zweifacher Ausfertigung auf eine gleiche Anzahl von nicht ausgeübten Fliegen als Negativkontrolle durchgeführt. Andere verschiedene physiologische oder biochemische Tests können durchgeführt als vom Forscher bestimmt werden.

Abbildung 3. Ausdauertraining ändert mehrere Aspekte der Mobilität. (A) Ring-Assays durchgeführt längs über Jahrhunderte in einem einzigen Paar von männlichen Y ¹ W ^67C23 Kohorten. Alter zusammenpassende, genetisch identische ausgeübt und nicht ausgeübten Kontrolle Fliegen wurden täglich durchschnittlich Steiggeschwindigkeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Form eines Index klettern, das der mittleren Steighöhe in der ersten drei Tage der Messung normiert ausgedrückt. Übung ausgebildete Fliegen zeigten eine verminderte altersbedingte Rückgang der negativen Geotaxis Fähigkeit im Vergleich zu gleichaltrigen Geschwistern nicht ausgeübte über Alter (2-Wege ANOVA, p <0,005). (B) Fatigue-Tests für 8 Stunden am durchgeführt gleichaltrigen weiblichen Kanton S Fliegen zeigen einen signifikanten Effekt der diätetischen Saccharosegehalt auf Zeit zur Ermüdung (log-rank, p <0,0001). Vor dem Experiment wurden Fliegen eine Hefe / Saccharose / Agar-Diät gefüttert, mit 10% Gewicht / Volumen yeaSt-Konzentration, und einen unterschiedlichen Anteil der diätetischen Saccharose. Fünf Fläschchen von 20 Fliegen je wurden für jede Diät getestet. Grafik zeigt, wie viele Flaschen noch fünf oder mehr Fliegen läuft zu einem bestimmten Zeitpunkt. Diese Ergebnisse können statistisch und graphisch dargestellt Überlebensrate (oder Zeit bis zum Versagen) erreicht, wobei die "Fehler" für ein Fläschchen, als einem Zeitpunkt, wenn weniger als fünf Fliegen auf negative Geotaxis Stimulus zu reagieren weiterhin definiert behandelt werden. Beachten Sie, dass viele andere mögliche Studiendesigns und der statistischen Aufbereitung möglich sind, und Daten, Behandlung und Messung sollte auf die individuellen Zwecke angepasst werden.

Discussion

Das allgemeine Protokoll hier vorgestellte wurde bei der Dokumentation von physiologischen Wirkungen nach dem Training erfolgreich. Allerdings gibt mehrere Bereiche, in diesem Protokoll unterliegen Änderungen an bestimmten experimentellen Anforderungen anpassen. Zum Beispiel könnte die Länge der Ausbildung und der Anzahl der Anfälle variiert möglicherweise, damit das Programm mehr oder weniger anspruchsvoll, wie gewünscht. Die Höhe des Behälters, in dem negativen Geotaxis Fähigkeit gemessen könnte geändert werden, um den verfügbaren Raum für Verbesserungen zu dokumentieren zu erhöhen. Verschiedene Methoden der Automatisierung der Quantifizierung der Steiggeschwindigkeit kann ebenfalls anwendbar sein. Im Prinzip kann jede Software-Programm geeignet sind, eine Fliege aus dem Hintergrund benutzt, um die Datenerfassung zu beschleunigen werden.

Einige Aspekte des Protokolls sollten nur mit größter Vorsicht geändert werden, jedoch. Zum Beispiel, Vorversuche deuten stark darauf hin, dass mindestens ein Ruhetag pro Woche zu mehr impr erleichtern neigtEs werden Bewegungen als unerbittliche tägliche Übung. Darüber hinaus werden zirkadianen Rhythmen und Temperatur bekannt ist, die Bewegung des kaltblütigen Tieren beeinflussen. Die Tageszeit, zu der Ausbildung stattfindet, kann variiert werden, sondern sollte immer in bestimmten Gruppen konsistent unter Vergleich, um die Möglichkeit der Verwechslung Wirkungen der zirkadianen Rhythmen zu vermeiden. Die Temperaturregelung ist auch wichtig, und wir empfehlen einen dedizierten Raum bei konstanter Temperatur zu Haus Sportgeräte. Schließlich müssen Männchen und Weibchen aufgezogen und getrennt gemessen werden, um das Potenzial der verwirrenden Effekte der Fruchtbarkeit und geschlechtsspezifische Unterschiede in der körperlichen Leistungsfähigkeit zu vermeiden.

Potentielle Anwendungen dieser Methodik werden nur durch die Phantasie des Forschers begrenzt. In Vorarbeiten haben wir diese Methode in drei große Anwendungen eingesetzt:

1. Um die Wirkung von Ausdauertraining auf verschiedene Aspekte der Wildtyp Biologie über Alters zu messen.
2. To Messung der Wirkung von Ausdauertraining auf bestimmte Phänotypen.
3. Um genetischen Faktoren, die erforderlich sind zu screenen, um den Nutzen der Übung auszuführen

Jede dieser Anwendungen umfasst eine Vielzahl von spezifischen Möglichkeiten. Auf der Basis unserer vorläufigen Erfahrung, neigen Mutantenphänotypen mit Übung Ebene so viel variieren, da sie mit einer Diät variieren. Die Verwendung von wirbellosen Modelle zum besseren Verständnis der Beziehung zwischen Ernährung, Bewegung, Alterung und Physiologie ist vielleicht die wichtigste allgemeine Anwendung dieses Protokolls.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Dayton Getriebemotor	Grainger	1LRA6A
Raco Elektrische Box	Grainger	5A052
Raco Abdeckung	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Sicherungen	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Sicherungshalter	Grainger	1DD33
Carling Technologies Schalter	Grainger	2X464
Dayton Control, AC / DC-Geschwindigkeit	Grainger	4X796
Flugs für Narrow Plastikröhrchen	Genesee Scientific	49-102