Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Summary

Wir entwickelten ein neues Protokoll, um die Effizienz der in vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu verbessern. Die differenzierten ES-Zellen erworbenen motorischen Neuronen verfügt wie durch die Expression von neuronalen und motorischen Neurons Marker mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken nachgewiesen.

Abstract

Direkte Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ES)-Zellen in funktionelle Motoneuronen stellt eine viel versprechende Quelle für Krankheiten Mechanismen zu studieren, zu neuer Wirkstoffe zu screenen und zu neuen Therapien für Motoneuronen-Krankheiten wie zum Beispiel Spinale Muskelatrophie (SMA) und Amyotrophe Lateralsklerose entwickeln ( ALS). Viele aktuelle Protokolle verwenden eine Kombination von Retinsäure (RA) und Sonic Hedgehog (Shh) an embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen in Motoneuronen ^4.1 differenzieren. Allerdings ist die Effizienz der Differenzierung mES Zellen in Motoneuronen nur mit mäßigem Erfolg erfüllt. Wir haben eine zweistufige Differenzierung Protokoll Nr. ^5, das verbessert die Differenzierung Effizienz im Vergleich zu derzeit etablierten Protokollen entwickelt. Der erste Schritt besteht darin, die neuralization durch Zugabe von Noggin und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) erweitern. Noggin ist ein knochenmorphogenetisches Protein (BMP)-Antagonisten und in Neuralinduktion gebracht einach der Standard-Modell der Neurogenese und führt zur Bildung der vorderen neuronalen Strukturieren ^6. FGF wirkt synergistisch mit Noggin bei der Induktion von Nervengewebe Bildung durch die Förderung einer hinteren neuronalen Identität ^9.7. In diesem Schritt wurden mES Zellen mit Noggin, bFGF und FGF-8 für zwei Tage grundiert werden, um neuronale Differenzierung in Richtung Linien zu präsentieren. Der zweite Schritt besteht darin, Motoneuronen-Spezifikation zu induzieren. Noggin / FGFs ausgesetzt mES Zellen wurden mit RA und einer Shh-Agonisten, Agonisten Smoothened (SAG), für weitere 5 Tage inkubiert, um Motoneuronen Generation zu erleichtern. Um die Differenzierung von MES in die Motor-Neuronen zu beobachten, verwendeten wir eine ES-Zelllinie von einer transgenen Maus exprimiert eGFP unter der Kontrolle des Promotors Motoneuronen Hb9 ¹ abgeleitet. Mit diesem robusten Protokoll erzielten wir 51 ± 0,8% der Differenzierung Effizienz (n = 3, p <0,01, Student t-Test) ^5. Die Ergebnisse der ImmunfluoreszenzFärbung zeigte, dass GFP +-Zellen die Motoneuronen spezifische Marker, Islet-1 und Cholin Acetyltransferase (ChAT) auszudrücken. Unsere Zwei-Schritt-Protokoll Differenzierung bietet eine effiziente Möglichkeit an MES-Zellen in spinalen motorischen Neuronen zu differenzieren.

Protocol

1. Schritt 1: embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Cell Culture (Timing: 3 Tage)

1. Ausplattieren primäre embryonale Maus-Fibroblasten (PMEF)

1. Coat vier 100-mm Zellkulturschalen mit Gelatine für PMEF Haftung. 8 ml von 0,1% Gelatine-Lösung (StemCell Technologies) zu jeder Schale und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
2. Entfernen Sie das überschüssige Gelatine von Gerichten. Nicht spülen das Geschirr.
3. Verdünnen Sie ein Fläschchen mit Mitomycin C-inaktivierten PMEF (Millipore), die ca. enthält. 5 x 10 ⁶ Zellen in 40 ml PMEF Medien (siehe Rezept in Tabelle 1) und Platte auf vier 10....

Discussion

Die Qualität der mES Zellen ist die kritischen Parameter zur effizienten Erzeugung von Motoneuronen. mES Zellen müssen auf PMEF kultiviert werden, um spontane Differenzierung zu verhindern. Die Zugabe von LIF hilft bei der Erhaltung der die MES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand. Als MES-Zellen teilen sich alle 12 bis 15 h wurde das Kulturmedium verarmt rasch und muss täglich ersetzt werden.

Effiziente Aktivierung des Shh-Weg ist ein kritischer Parameter benötigt, um Motoneuronen Spez.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Endkonzentration
PMEF	Millipore	PMEF-H	NA
PMEF Medium
DMEM	Invitrogen	11965-118	NA
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-Glutamin	Invitrogen	25030-081	1%
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15240-063	1%
mES Medium
DMEM	StemCell Technologies	36250	NA
ES-Zell-Qualifizierte FBS	Invitrogen	16141-079	15%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
Nicht-essentielle Aminosäuren	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleosides	Millipore	ES-008-D	1%
β-Mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
Penicillin / Streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	Millipore	LIF2010	10 ng / ml
Neuronale Differenzierung Medium
DMEM	StemCell Technologies	36250	NA
ES Cult FBS	StemCell Technologies	06905	15%
Nicht-essentielle Aminosäuren	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-thio Glycerin	Sigma-Aldrich	M-6145	1mM
Birne	Invitrogen	PHC1506	50 ng / ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng / ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng / ml
MND Medium (Differenzierung)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	NA
Knockout Serumersatz	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 Ergänzung	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Askorbinsäure	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillin / Streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% in D 2 H 2 O
Fibronektin	StemCell Technologies	07159	5 pg / ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml in D 2 H 2 O
β-Mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
Retinsäure	Sigma-Aldrich	R-2625	1 uM
SAG	EMD Chemicals	566660	1 uM
MND Medium (Motor Neuron Kultur)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	NA
Knockout Serumersatz	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 Ergänzung	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Askorbinsäure	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillin / Streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% in D 2 H 2 O
Fibronektin	StemCell Technologies	07159	5 pg / ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml in D 2 H 2 O
β-Mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
BDNF	R & D Systems	248-BD-005/CF	10 ng / ml
CNTF	R & D Systems	257-NY-010/CF	10 ng / ml
GDNF	R & D Systems	212-GD-010/CF	10 ng / ml
NT-3	R & D Systems	267-N3-005/CF	10 ng / ml

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Endkonzentration
0,1% Gelatine	StemCell Technologies	07903	NA
Poly-DL-ornithin	Sigma-Aldrich	P0421	0,1 mg / ml in D 2 H 2 O
Mauslaminin	Millipore	CC095	2 pg / ml in PBS
0,25% Trypsin / EDTA	StemCell Technologies	07901	NA
Accumax	Millipore	SCR006	NA