Summary
Качество эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) определяется по праву мышах, таких как CF-1. Плюрипотентности, поддерживающих MEFs и условных СМИ (CM), полученные из этих должен содержать оптимальные концентрации Активин, Gremlin и Tgfβ1, необходимых для Активин / Узловые и FGF пути к совместной оперативно поддерживать самообновления и плюрипотентности.
Protocol
1. Выделение эмбриональных фибробластов мыши (MEFs)
В следующих двух шагах выполняются, не связанных с асептических условиях.
- Пожертвуйте беременных мышей (CF1, Харлан, США) на 13 или 14 DPC (день после coitum) от шейки дислокации.
- Проанализируйте из рога матки, кратко промыть в 70% (объем / объем) этанола и место в трубку сокол содержащей PBS без Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen).
Следующие шаги осуществляются в капюшоне культуры ткани в асептических условиях и с помощью стерильных инструментов.
- Поместите рога матки в чашку Петри и отделить каждый эмбрион от плаценты и эмбриональных мешка.
- Проанализируйте головы и красных органов, умойся в PBS и поставить все эмбрионы в чистую чашку Петри. Мелко рубите ткани, используя стерильные лезвия, пока не станет возможным пипетки.
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсин / EDTA (Gibco, Invitrogen), вклюДин 100 Куниц единиц ДНКазы I (USB), в зародыше.
- Передача ткани в 50 мл трубку сокол и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° C. После каждых 5 мин инкубации клеток отделить с помощью пипетки вверх и вниз тщательно.
- Инактивируют трипсин, добавив около 1 объема свежеприготовленного MEF среды.
MEF питательной среды (компоненты, чтобы сделать 500 мл средства массовой информации, смешать все компоненты и фильтр):
450 мл DMEM, 50 мл FBS (10% (об. /)), 5 мл 200 мМ L-глутамина (1/100 (V / V)), 5 мл пенициллина, стрептомицина (1/100 (V / V)). - Центрифуга клеток с низкой скоростью (300 мкг), 5 мин, осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в теплую среду MEF.
- Плиты приблизительно количество клеток, что эквивалентно 3-4 эмбрионов в каждом T150 (ТЭС) колбы покрыты 0,2% желатина (желатин из бычьей кожи, тип B, Sigma) в течение 2 часов. Фибробластов (P0, прохождение 0) являются единственными клетками, которые имеют возможность присоединить к желатин покрытием колбы. В идеале, клеток 80-90% сливной после 24 часов и на данном этапе большая часть P0 клеток замораживается для использования в будущем.
- Разверните оставшиеся T150 колбу (ы) P0 клетки до P3 и P4, то инактивировать и использовать в качестве питателей для replate ЭСК или для получения кондиционной среды (КС).
2. Инактивация и покрытие MEFs (подготовка фидерных клеток)
Все этапы проводятся в капюшоне культуры ткани в асептических условиях.
- Пальто T150 колбы с 0,2% желатина и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Развести митомицина в PBS (1 мг / мл) и фильтр.
- Аспирируйте информации из MEFs и промыть PBS без Ca 2 + Mg 2 +.
- Место 20 мл среды, содержащей 10 мкг / мл митомицина на MEFs.
- Выдержите в течение 2 часов при температуре 37 ° С, митомицин С, содержащие средние затем промыть два раза PBS, trypsinize, центрифуга (в течение 5 мин при 300 мкг) и ресуспендирования клеток в теплой среде.
- Граф клеток и пластины с плотностью 56,000 клеток / см 2 в T150 колб и использовать для СМ производства на следующие 6 дней.
3. Условный средний (СМ) Подготовка
Все этапы проводятся в капюшоне культуры ткани в асептических условиях.
- На следующий день после нанесения покрытия инактивированной MEFs при плотности 56,000 клеток / см 2 заменить MEF среде с чЭСК среды (UM, безусловный среды) (0,5 мл / см 2) дополнить недавно с 4 нг / мл FGF2.
- Соберите см от подачи колбы после 24 ч инкубации и добавить свежую среду чЭСК, содержащий 4 нг / мл FGF2 в кормушки.
- Повторите эту процедуру в течение последующих 6 дней. Каждый день магазин собрал CM при температуре -20 ° C.
- Через 6 дней смешать все порции средней и фильтр (Corning, 0,22 мкм, PAS). Сделайте 50 мл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C.
- Дополнение CM с дополнительными 4 нг / мл FGF2 перед добавлением ЭСК выросли на Матригель. </ LI>
4. Измерение активин в кондиционированной среде (ИФА) 15
- Доведите все образцы и реагенты до комнатной температуры.
- Развести захватить антител (Human \ Мыши \ Крыса Активин MAb, R & D Systems) в PBS с 1% BSA, добавить в планшет (100 мкл / лунку) и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
- Через 24 часа промыть лунки три раза PBST (PBS с 0,05% Твин-20) (300 мкл / лунку), то блок (1% BSA / PBS, 300 мкл / лунку) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- В это время подготовить Активин (R & D Systems) калибровочной кривой, в том числе 7 разведения (концентрация менее 30 нг / мл) и пустой образца. Линейный рабочий диапазон Активин между 0,25 и 32 нг / мл.
- Добавить дубликатов стандартов и образцов в лунки (100 мкл / лунку) и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST).
- Добавить вторичных (биотинилированного) антител (человек / мышь / крыса биотинилированный Активин MAb, R & D Systems) (0.25 мкг / мл в 1% BSA / PBS) и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST), добавьте стрептавидином-HRP (разводят в 1% BSA / PBS, R & D Systems) и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST), добавьте 100 мкл раствора субстрата (Quantikine, R & D Systems) и инкубировать 30 минут при комнатной температуре в темноте.
- Добавить 100 мкл стоп-раствора (Quantikine, R & D Systems) в каждую лунку и аккуратно перемешать.
- Установить микропланшетов читателя (Molecular Devices спектры Max 250, Global медицинской техники, Inc, штат Миннесота) до 450 нм, с длиной волны коррекции на 540 или 570 нм, определить оптическую плотность каждой лунки.
5. Представитель Результаты
Общая схема выделения процедура представлена на рисунке 1. Типичная морфология и ЭСК hiPSCs культивировали при различных условиях представлена на рисунке 2. Морфология MEFs и инактивированных клеток фидерных использованы для подготовки CM представлена на рисунке 3. В общем, камеры должны быть вырожденным 24 часов после изоляции и готова быть заморожены или расширена. Тем не менее, иногда это может занять 2-3 дня до получения сливной культур. СМ должны быть приготовлены из клетки при прохождении 4 и не позже. Это очень важно, потому что первичные клетки могут быть расширены за 4-5 проходов до начала старения.
Цитокинов, Активин, рассматривается как наиболее важный фактор выделяется фидерных клеток для поддержки роста недифференцированных плюрипотентных клеток 14. Измерение уровня активин в см (рис. 4) представляет собой очень удобный количественного анализа для контроля качества MEFs.
Рисунок 1. Схематическое изображение процедуры изоляции MEFs.
Рисунок 2. Типичная морфология недифференцированных ЭСК культивировали в присутствии (A) фидерных клеток (B) кондиционированной среды и (C) определенной среде. Типичная морфология hiPSCs культивировали в присутствии (D, E) клетки фидера.
Рисунок 3. Типичная морфология эмбриональных фибробластов мыши (MEFs). () Прохождение 0 (P0) через два дня после покрытия / изоляции, (B) инактивированная слой подачи при плотности 56,000 клеток / см 2.
Рисунок 4. Иммуноферментного анализа (ИФА) на основе измерения концентрации активин в кондиционированной среде (CM) пр.epared с мышиных эмбриональных фибробластов, полученных из CF1 штаммом мыши. CM была собрана в течение 6 дней, а затем объединяются. CM "1" и СМ "2" относятся к разным партиями средств массовой информации и единой для безусловного СМИ. В функции кондиционирования процесс активин секреции в среду на MEFs, Активин это практически невозможно обнаружить в UM.
Discussion
Процедура MEFs изоляции, представленные здесь позволяет создание стандартизированных условиях культуры ЭСК и hiPSCs. Кроме того, ИФА-системы, используемые для оценки продукции цитокинов фидерных клеток является полезным индикатором качества MEF-производных условно СМИ. Текущий ремонт мыши штамма (CF1) обеспечение поддержки фибробластов необходимо, чтобы избежать от партии к партии изменении медиа-культуры. Кроме того, рекомендуется изолировать от нескольких эмбрионов мышей одновременно получить стабильное качество клеток. Конечно свежевыделенных MEFs может быть заморожен на P0 и P1. Также инактивированной MEFs можно хранить в замороженном состоянии в аликвоты соответствующих сумм в зависимости от требований к клеточной культуре. Обычно около 250,000 клетки должны быть покрыты в одном и 6-луночного планшета для культуры ЭСК и иПК клеток. Создан и оптимизирован метод может быть широко используется, чтобы минимизировать изменчивость между Diff #Аренда экспериментов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Особая благодарность доктору Борису Greber для создания Активин ИФА протокол, опубликованной в Greber соавт. 2007 года. Мы особенно благодарны г-жа Моника Shevack подготовки графическое представление. Мы очень благодарны доктору Хайко Фукса за помощь и ценные советы перед и во время съемок. Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Аджайе, особенно Элизабет Socha для поддержания постоянного притока MEFs и CM. Мы также признаем, наши коллеги на животных средство MPIMG за постоянную поддержку. Эта работа была частично финансируется за счет Общества Макса Планка и [BMBF, грант № 0315717A], партнеров ERASysBio + инициатива поддерживается в ЕС ERA-NET Plus схемы FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
