Summary
稳定同位素标记的工作流程,采用
Abstract
稳定同位素在生物质谱技术是必不可少的工具。从历史上看,稳定同位素18 O已被广泛用来研究蛋白水解酶1-3的催化机制。随着质谱为基础的蛋白质组学,酶催化成立18 O原子从稳定同位素富集的水已经成为一种流行的方法来定量比较蛋白质表达水平(由Fenselau和姚明,宫城县和4饶5和叶审查等 。6),18 O标记构成一个简单的,低成本的替代化学品( 如 iTRAQ的,ICAT)和代谢标记技术( 如 SILAC)。根据使用的蛋白酶的18 O-标记可以导致将多达两个18 O-原子中的C-末端羧基基团的裂解产物3 8。在我们的古(P rotease 一个的 ssisted的升abelingËmploying 18 O-富氧水)改编酶18 O标记,我们采用50%的18 O富集的水,产生独特的同位素特征。结合高分辨率基质辅助激光解吸电离飞行时间飞行串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS / MS),特征同位素信封可以用来识别与高水平的特异性的裂解产品。我们以前使用过的古方法来检测和表征内源性蛋白酶9和监控蛋白水解反应10-11。 ,由于古编码的蛋白裂解反应的本质,实验装置简单,生化ENRIchment步骤裂解产物可以被规避。古方法可以很容易地扩展到(I)课程实验,监测蛋白水解裂解反应的动力学及(ii)分析在复杂的生理条件下的生物样本,分别代表水解。古时间过程的实验有助于确定限速的处理步骤和反应中间体,在复杂的蛋白水解途径反应。此外,古反应,使我们能够识别蛋白水解酶的丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶,能够重新绑定其裂解产物,并促进成立的第二个18 O原子。这种“双标记”酶可用于postdigestion 18 O标记,其中肽是专门标记的羧基氧交换反应。我们的第三个战略扩展标记采用18 O富集的水以外的酶,并使用酸性的pH值条件下,引进18 O稳定同位素标志atures肽。
Protocol
所提出的LEO工作流允许的稳定同位素标记的蛋白质消化和合成肽。这些课程实验( 图1)是适用于比较和定量蛋白质组学的研究,以及蛋白酶的研究。每个工作流程由两个实验的步骤( 图2):A)各自的18 O-稳定的同位素编码的反应(蛋白酶催化肽切割蛋白酶催化羧基氧交换反应,酸催化的羧基氧交换的时间分辨的采样反应)和B)通过质谱法和图形表示的18 O掺入动力学分析。
A.时间过程实验
一,古时间过程:蛋白酶催化蛋白水解分裂标签
- (可选)二硫键的蛋白质(10μM)和肽(250μM)与DTT(终浓度为2.5 mM的减少)在25mM NH 4 HCO 3(两者新鲜制备的)在50℃下孵育30分钟
- (可选)免半胱氨酸用碘乙酰胺烷基化(最终浓度为10毫摩尔)在25mM NH 4 HCO 3在黑暗中在室温下孵育30分钟。
- 根据利益对蛋白酶,蛋白质/肽的解决方案需要清理,以除去残留的缓冲液和烷基化剂。使用PepClean C-18柱(温)的肽清理和VIVASPIN的离心集中器(赛多利斯)蛋白质样品的交换缓冲区。
- 重新溶解/交换在20μl蛋白酶反应缓冲液中的肽/蛋白质(ECE-1:50 mM的MES-KOH,pH值5.5,胰蛋白酶:25 mM的NH 4 HCO 3,pH8.0)中含有1:1(体积/体积)的最终H 2的 18 O(95%,Sigma公司ISOTEC)。
- 蛋白酶到加法之前撤回零时间点样品:将0.5微升的反应混合物和0.5μl的α-氰基-4 - 羟基肉桂酸性基质(10毫克/毫升,50%乙腈,0.1%TFA)。现货样品的Opti-TOF 384的MALDI靶标板(AB SCIEX)留下的溶剂在室温下滴,直到干(约5分钟)。
- 反应溶液中分割成两等份。第一等分试样,将感兴趣的用蛋白酶(ECE-1:75纳米;胰蛋白酶:0.04 nM的)的特定的酶,在室温或所建议的温度孵育。第二份无蛋白酶和培养,将作为对照样本。第一等分试样表示蛋白酶催化的18 O-标记的标准样品,可用于肽和蛋白质鉴定,蛋白水解活性的检测和监测蛋白水解切割反应。第二份是用来显示,18 O公司成立的蛋白酶引起的,因此,既没有标签,也不裂解,预计此示例。
- 按照反应,消除反应装察觉他们的DES第5步的时间间隔cribed下似乎是合适的。上面所述的反应条件是用来监测多达四个天(约24点)的蛋白水解反应。开始取样,每隔5分钟至30分钟,然后发现,每30分钟至2小时,每一个小时,直到8小时,每8个小时,直到4天。裂解产物应该出现在第一个12小时和24小时后的基材应完全水解。延期反应温育时间允许定义稳定的反应产物从反应的中间体,它被进一步处理是离散的。根据研究问题和酶 - 底物对,点状出血时间和孵化温度进行调节,以保证最佳的反应采样。
- 最终的反应时间点之后有斑点或扩展斑点的间隔之间,在MALDI靶板提交MALDI-TOF/TOF MS / MS分析,如下所述(B部分)。
II。古时间过程:Postdigestion标签的蛋白水解总站
- (可选)二硫键的蛋白质(10μM)和肽(250μM)减少与DTT(终浓度为2.5毫摩尔)在25mM NH 4 HCO 3(包括新鲜制备的)在50℃下30分钟孵育
- (可选)免半胱氨酸用碘乙酰胺烷基化(最终浓度为10毫摩尔)在25mM NH 4 HCO 3在黑暗中在室温下孵育30分钟。
- 根据不同上感兴趣的蛋白酶,蛋白质/肽的解决方案需要清理,以除去残留的缓冲液和烷基化剂。使用PepClean蛋白缓冲交换的肽清理和VIVASPIN的离心浓缩器为C-18柱。
- 重新溶解/交换清洗了肽产品/在20μl蛋白酶反应缓冲液中的蛋白质( 如胰蛋白酶:25 mM的NH 4 HCO 3,pH为8.0)和消化感兴趣的完成用蛋白酶( 例如胰蛋白酶:0.04纳米; 37°C,12小时)。
- 清除裂解产物与PepClean C-18离心柱。该步骤可以消除残余的蛋白酶活动。
- 在20μl蛋白酶反应缓冲液重新溶解/交换清理最多肽产品(胰蛋白酶:25mM的NH 4 HCO 3,pH8.0)中含有1:1(体积/体积)的最终H 2 18 O的
- 在加入酶之前撤回零时间点样品:将0.5微升的反应混合物和0.5μl的α-氰基-4 - 羟基肉桂酸的基质(10毫克/毫升,50%乙腈,0.1%TFA)。现货MALDI靶板上的样品和留下的溶剂,在室温下的液滴,直到干燥(约5分钟)。
- 反应溶液中分割成两等份。第一等分试样将与感兴趣的蛋白酶( 如胰蛋白酶:0.04 nM的)的特定的酶,在室温或所建议的温度孵育。第二份无蛋白酶和培养作为对照。第一等分试样表示标准样品的蛋白酶催化18 O-postdigestion的标签和可用于肽和蛋白质定量。第二份是用来显示,18 O-结合的蛋白酶催化,因此,预计此示例没有标签。
- 按照反应,消除反应装察觉他们根据第7步。)的时间间隔似乎是合适的。例如,我们发现了最初,每5分钟至30分钟,每15分钟后,监测通过胰蛋白酶催化的羧基氧交换反应。
- 在最后的反应时间点有斑点或扩展的斑点间隔之间的的MALDI靶标板被提交到MALDI-TOF/TOF MS / MS分析如下所述(B段)。
III。的ALEO-时间过程:羧基的酸催化的标签
- 孵育个别肽(50纳米),用1:1(体积/体积)18 O浓缩水,在T他的存在或不存在(对照)的0.1%(体积/体积)的最终的三氟乙酸(总体积30μl)。
- 有样品的反应产物通过共48天每天去斑0.5微升等分的混合物与α-氰基-4 - 羟基肉桂酸基质(10毫克/毫升,50%乙腈,0.1%TFA)加入0.5μl直接到MALDI靶板。
- 斑点间隔和对最终反应时间点后斑点提交MALDI靶板MALDI-TOF/TOF MS / MS分析,如下所述部分B之间
B. MALDI-TOF/TOF MS / MS数据采集与分析
- 质谱获得4800 MALDI TOF / TOF分析仪(AB SCIEX)。
- 分析前,仪器的校准与质量测量的最大允许误差为±50 ppm和最低数量的六峰匹配的多肽标准(质量标准AB SCIEX TOF / TOF仪器的校准工具包)的混合物。
- MS谱(质量范围400 - 4,000 米/ z)的购买,使用正离子模式与一个可调的激光强度(3,400 - 3,800,步长50)具有可接受的基峰强度范围为2,000 - 45,000,一式三份。单杆获得子谱,总共有400张/频谱,停止收购条件生效后800分谱(通过或失败)或400分谱合格的验收标准。 MS检测范围的下端低丰度的样品的情况下,或在存在复杂的生物背景应提高到800的m / z。此外,它可能是必要的与样品的清除步骤如前面所述或通过液相色谱分离,以除去盐和其它干扰化合物。
- MS数据文件(。T2D文件)的出口从4000系列浏览器的数据采集软件,并导入到我们的内部实验室信息系统,该利用MASCOT的蒸馏器软件(矩阵版)的光谱处理和峰值检测。同位素信封解卷积和O-18自动确定使用的算法类似的Mason 等12所描述的,适应我们的9组的掺入比例。另外,如ZoomQuant 13和Viper 14,以及商业套装软件的软件工具, ,随心BioWorks(赛默飞世尔科技)和Mascot Distiller的定量工具箱(矩阵版)解卷积18 O型数据15,16,18 O的注册比率表示的相对贡献的个人肽同位素物种( 即肽含有16 O 1或18 O,18 O 2)的整个同位素信封。
- 对于每一个时间过程实验,分子量([M + H] +)可用于所有检测到的肽种类的从相关联的MS数据文件中提取和离散化的值在100 ppm的质量宽度。
- 一至少3 [M + H] +设置为需要填充的垃圾桶。在已知的基板的情况下,滤波后的纸槽列表进行比较到一个列表中的蛋白水解切割产品使用的ExPASy FindPept工具17( http://au.expasy.org/tools/findpept.html )和一个从底物肽序列预测200 ppm的质量的错误接受性。
- MS / MS谱获得的所有质量值的裂解产物的FindPept工具,并为BIN值有18个 O-立案法团与预测。 MS / MS数据,4800 MALDI TOF / TOF分析仪在1KV反射器正离子模式下,获得一个固定的激光强度为4200和CID气体在关机模式。 50次收购,在每个子谱随机模式,共40分每点谱(共产生了2000张/点)。
- MS / MS数据文件(。T2D文件)的出口从4000系列的勘探与RER数据采集软件,并导入我们的内部实验室信息系统,峰值检测和MS / MS峰列表与相应的分级MS的数据。
- MS / MS肽识别,峰值列表下面的搜索参数对SwissProt数据库使用MASCOT搜索引擎进行搜索,没有酶的特异性,150 ppm的前体离子和0.2的大碎片离子的质量容差。
- 使用Data Explorer软件(AB SCIEX),可以另外进行验证肽鉴定确认的特征18 O-Y系列碎片离子之间的结合模式,舍甫琴科等人所描述的18。
C.制备的频谱时间和18 O公司成立图
频谱时间图:MS每个反应时间点的数据文件(。T2D文件)的出口数据浏览器软件使用的ASCII文件宏观和导入的数据分析和图形软件程序( 如地OriginLab),并显示为瀑布图( 图3)。
18 O的注册图:对于每个分级肽裂解产物中提取,个别种肽同位素(16 O,18 O 18 O 2)的相对贡献在所有的反应时间点,对时间作图( 图4)。
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Representative Results
我们使用动态监控结合成肽蛋白水解酶裂解产生18 O稳定同位素的古时间过程的工作流程。所提出的方法是一种多功能的工具,不同的底物和蛋白酶的组合比较研究蛋白水解处理途径。通过重复采样蛋白水解反应,在反应过程中的,古时间过程的时间分辨实验提供了快照的底物和产物的丰度和处理的详细信息。共发现样本与目标板的酸性基质溶液停止酶的反应和基体结晶,进一步保证样品的成分。因此,时间点可以追溯MALDI-TOF/TOF MS / MS进行分析结束后的酶反应。为了适应这些实验工作流程,数据丰富性,我们实施了的半自动生物信息学系统,计算O-18纳入离子比率对每个肽。 图3显示了具有代表性的频谱时间过程的处理ECE-1的肽Endokinin C的情节。古时间过程数据是多维的:整个质量范围内的MS的数据同时显示的放大视图的丰度的肽底物,以及肽产品的丰度。的时间安排允许解密裂解事件的序列的和确定肽片段是稳定的裂解产物。缩小视图MS数据揭示了每种肽的同位素的信封和裂解诱导的18 O-标记的是,很容易地确定的其特性的同位素分布。18 O-标签允许的酶切产物后续识别的阳性筛选通过MS / MS。总之,古时间过程分析捕获的动态评估首选的切割位点的蛋白酶蛋白水解处理,并允许。然而,另一个层次的信息tion可以得到的,这取决于所使用的蛋白酶的酶促机制。某些蛋白酶丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶能够共价重新绑定其肽的裂解产物。水解的酰基酶的中间结果的第二18个 O原子中的C-末端羧基基团中的掺入。 图4示出的相对贡献随时间的不同同位素产生的转变:最初的肽键的裂解反应结果以1:1的16 O O 1和18肽组分之间的分裂。的羧基氧交换反应的结果,在18 O 2的分数增加至25%的比例与随之而来的在平衡状态下减少16 O馏分。蛋白酶能够催化的羧基氧交换反应,因此可以使用一个额外的18 O-标记的工作流程,的postdigestion标签的蛋白水解之三迷你。在这些类型的实验中,底物初始消化的情况下的H 2 18 O,肽产品清理和孵育一批新的蛋白酶,但50%的存在下,这一次是在H 2 18 O的 图4示出了差异同位素掺入,可以观察到在这两个实验的工作流程和在个人之间的肽底物的掺入速度的差异。在postdigestion标签的工作流程中,两个18 O法团确定的速率,通过羧基的氧交换反应。反应的速率依赖于容易蛋白酶相互作用及其裂解产物。反应产物的亲和性可能间接被用来推断蛋白酶到原始的肽底物的亲和性。这些信息可能是有用的,以确定哪些肽序列是理想的基板,例如定量蛋白组学研究中的胰蛋白酶消化。 P容易裂解和双标记通过胰蛋白酶eptides可能是,再现性和定量地形成,因此,非常适合于比较蛋白质组学研究的肽段。
在低pH值,氧原子的羧酸基团与水性溶剂19-20交换。该反应可以使用蛋白酶催化标记策略引入成肽的稳定同位素作为一种替代方法。在ALEO时间过程(酸催化的标签采用18 O浓缩水)工作流程,我们监测的18 O原子转化为合成肽缓慢注册成立。的酸催化的氧交换停止共结晶后,用MALDI靶板上,有效地“冻结”的同位素分布状态的基质溶液。我们使用血管紧张素1为模型肽,研究它的同位素随着时间的推移信封( 图5)。每车18 O原子吸收组观察boxyl。在目前的实验条件下,比蛋白酶催化交换9的酸催化的羧基氧交换反应慢得多,只达到平衡后48天。然而,ALEO方法提供了无法识别的蛋白酶的标记肽的优势。此外,肽结合多个18 O-原子取决于酸性侧链,这可能会导致完全分离的未标记的和标记的物种的同位素信封上的数量。的总质量移位提供在一个给定的肽上的酸性残基的数目的信息和它们的位置可以由MS / MS的片段离子质谱位移的分析来自18 O-标记的肽相同的色谱行为作为他们的未标记的同行,附近显示使他们的比较分析,在相同的洗脱时间。综上所述,酸催化的18 O-标记可以作为化学,连接的替代zymatic和代谢标记方法中常用的定量蛋白质组学。这种技术的一个特别有前途的应用是使用18 O-标记的肽作为稳定同位素标准。
图1 18 O为基础的标签提供了多种的时间过程的工作流程。 (I)的蛋白酶催化古时间过程的工作流使蛋白水解裂解反应的动态监测。根据蛋白酶(a)单( 例如某些金属蛋白酶的情况下)或(b)双O-18成立( 例如,在特定的丝氨酸蛋白酶的情况下)。(II)双18 O-贴标机等,这些反应postdigestion标签工作流程中,也可以使用如胰蛋白酶,18 O掺入完全是通过蛋白酶介导的催化羧基氧交换反应(III)与此相反,ALEO时间过程的工作流程依赖于酸性肽侧和终端的酸催化的羧基氧交换反应。 点击此处查看大图 。
图2。实验工作流程的古ALEO时间过程的战略。 A)(I)在蛋白酶催化古时间过程的实验,基板与蛋白酶培养中存在的H 2 18 O中掺入高达18 O原子根据的蛋白酶。 (II)在一个古postdigestion的标定实验,从以前的裂解产物消化再培养 H 2 18 O的存在下的蛋白酶的兴趣有能力的双标签(我在工作流程)的蛋白酶催化成立18 O原子。 (III)在酸催化的ALEO实验中,所有的酸性官能基团包括18 O-原子,B)的时间过程分析:在定时的时间间隔,将反应混合物的等分试样共同察觉与基质的MALDI-靶板上后的MS-数据采集,光谱地块的的肽裂解反应的时间以及O-18注册成立地块的个人肽物种的产生和裂解产品均选用MS / MS-序列识别。 点击此处查看大图 。
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图3。光谱的时间图显示的蛋白水解裂解反应的动力学。古时间过程实验在一个瀑布安排通过绘制MS谱,它是可以同时监测的基板和出现的中间和最终的裂解产物的降解。在这里,通过内皮素的生物活性肽EndokininÇ裂解转化酶-1(ECE-1)所示。 MS / MS同位素信封显示18 O的特征,结合签名(红色突出显示)裂解产物进行鉴定。
图4。如胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶介导将高达18 O原子成肽裂解产物。 (I)的 仲>在基于蛋白酶的标签的工作流程中,肽键的裂解反应的查询结果,在50%的单一的18 O掺入比新鲜产生的肽的裂解产物(黑点表示未标记的,红色单标记的肽组分)。绑定它们的反应产物( 例如,丝氨酸蛋白酶,如胰蛋白酶)的蛋白酶,进一步催化掺入18 O原子的第二通过的羧基氧交换反应(绿色的点,双标记的肽馏分)。在平衡状态时,标签分发0.25:0.5:0.25(联合国;单,双标)达到(II)在postdigestion标签的蛋白水解总站的工作流程,没有肽键断裂时有发生。相反,高达18 O原子是专门成立的基础上的羧基氧交换反应。因此,18 O公司成立仅出现在绑定肽裂解产物的蛋白酶。p_upload/3891/3891fig4large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图5。酸催化的18 O-标记的掺入导致两个18 O-原子每羧基血管紧张素-1的同位素的信封,在实验过程中,经历了多个2大的质量变化(虚线)对应的摄取18 O原子。 18 O公司成立的网站中高亮显示的氨基酸序列(蓝色)。
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Discussion
结合稳定同位素标记和高分辨率质谱在时间分辨的方式,在古时间过程的方法允许产生的肽产品的动态分析。该试剂盒可用于产生稳定的同位素标记的肽进行定量和定性的蛋白质组学研究来评估肽段生成的动力学。此外,古时间过程被设计来评估,根据特定的,生理上有关的条件体外水解途径,可以利用工作流中的内源的蛋白质,肽和蛋白酶,以及合成肽和重组蛋白酶。根据特定的蛋白水解反应以进行调查,测定条件和点状出血时间可以被调整,以提供在反应过程中的最优采样。根据我们的经验,是有帮助的蛋白水解反应缓慢下降( 例如 ,通过使用酶浓度低,房间温度),以允许方便的手动采样间隔。喜欢与其他稳定同位素标记方法,实验的18 O掺入比测量的偏差是小的-通常小于5%的峰值与足够的离子统计。总体协议可以很容易地适应其他的测定格式,例如一大组的合成底物的筛选从复杂的生物样品( 例如 ,细胞培养基,体液)的内源性肽的蛋白水解加工或表征。我们以前证明古方法如何,连字符和LC分离工序,用来定义人类的唾液多肽组的动态组成的。的底物特异性的蛋白酶,蛋白水解签名的古时间过程提供了重要的事实的兴趣。此外,时间分辨的数据也产生动力学信息。这样的知识是特别有用的,在评价定量蛋白质组学研究,其中重复性和高丰度的靶肽的选择是至关重要的21肽段。同样的,确定的蛋白水解途径的限速步骤是高息为新的蛋白酶类药物的发展。蛋白酶的关键因素,在许多生理和病理过程( 如心血管疾病,神经退行性疾病,癌症),这种观测可以开辟新的治疗干预的机会。 ALEO策略 - 羧基酸催化的标签 - 方便地应用于合成和内源性肽,产生稳定的同位素编码标准。的酸催化反应的动力学是慢得多的酶催化的反应。因此,实验必须事先精心策划的。 ALEO时间过程是一个低成本的替代化学,代谢和合成标签米ethods目前使用的蛋白质组学研究。可以监测到验证,18 O的结合达到平衡时,它可以是一个优于其他稳定同位素标记方法标记过程。总之,这里所描述的狮子座 - 时间过程的工作流程是通用的工具,可以创造性地使用在许多定性和定量蛋白质组学的研究,以及蛋白酶的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由NIH / NIDCR的格兰特1R01DE019796。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
Table 1. Materials | |||
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
Table 2. Reagents |
References
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