Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel<em&gt; Aplysia</em

Zusammenfassung

Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung überwachenden Aplysia. Wir Bild intrazellulärem Calcium unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, Calcium Orange, und induzieren und zu überwachen synaptischen Übertragung mit scharfen (intrazellulären) Elektroden.

Zusammenfassung

Es wurde vorgeschlagen, dass Änderungen in intrazellulärem Calcium die Induktion einer Reihe von wichtigen Formen der synaptischen Plastizität (zB homosynaptische Erleichterung) ¹ vermitteln. Diese Hypothesen lassen sich durch gleichzeitiges Überwachen von Änderungen der intrazellulären Calcium-und Umbauten in der synaptischen Wirksamkeit getestet werden. Wir zeigen, wie dies durch die Kombination von Calcium-Imaging mit intrazellulären Aufnahme Techniken erreicht werden kann. Unsere Experimente sind in einer bukkalen Ganglienzellen der Mollusken Aplysia californica durchgeführt. Dieses Präparat hat eine Reihe von vorteilhaften Merkmalen experimentell: Ganglia leicht aus Aplysia entfernt werden und Experimente verwendet adulten Neuronen, die normale synaptische Verbindungen herzustellen und haben eine normale Ionenkanal Verteilung. Aufgrund der niedrigen Stoffwechsel des Tieres und den relativ niedrigen Temperaturen (14-16 ° C), die natürlich für Aplysia sind, sind die Vorbereitungen für längere Zeit stabil. ent "> Um Änderungen in der intrazellulären freien Calcium wir die Zelle impermeante Version von Calcium Orange ^2, die leicht 'geladen' in einem Neuron über Iontophorese ist verwenden. erkennen Wenn diese langwellige Fluoreszenz-Farbstoff bindet an Kalzium, Fluoreszenzintensität steigt. Calcium Orange hat schnelle kinetische Eigenschaften ³ und im Gegensatz ratiometrische Farbstoffe (beispielsweise Fura 2), erfordert keine Filterrad zur Bildgebung. Es ist ziemlich stabil und weniger Foto phototoxische als andere Farbstoffe (zB Fluo-3) ^2,4. Wie alle nicht-ratiometrische Farbstoffe, Calcium orange relativen Änderungen der Kalziumkonzentration anzeigt. Aber weil es nicht möglich ist, um Veränderungen in Farbstoffkonzentration durch Belastung und Diffusion, kann es nicht zur absoluten kalibrierten Calciumkonzentrationen bereitzustellen.

Ein aufrechter, feste Phase, zusammengesetzten Mikroskop wurde Bildes Neuronen mit einer CCD-Kamera in der Lage ist die Aufnahme etwa 30 Bildern pro Sekunde verwendet. In Aplysia diese zeitliche Auflösungist mehr als ausreichend, um auch nur einen einzigen Dorn induzierte Veränderung der intrazellulären Calcium-Konzentration zu detektieren. Sharp Elektroden gleichzeitig verwendet zu induzieren und aufzuzeichnen synaptischen Übertragung in identifizierten prä-und postsynaptischen Neuronen. Am Ende eines jeden Prozesses vereint ein benutzerdefiniertes Skript Elektrophysiologie und Bildgebung Daten. Um eine korrekte Synchronisation zu gewährleisten verwenden wir einen Lichtimpuls aus einer LED in den Kamera-Anschluss des Mikroskops montiert. Manipulation von präsynaptischen Kalziumspiegel (zB über intrazelluläre EGTA Injektion) ermöglicht es uns, spezifische Hypothesen über die Rolle der intrazellulären Calcium bei der Vermittlung verschiedener Formen von Plastizität zu testen.

Protokoll

Ein. Vorbereitung

1. Das Tier zu betäuben durch Einspritzen 75-100 ml isotonischer Magnesiumchloridlösung. Die Aplysia verwenden wir für die Bildgebung sind in der Regel 150-200 Gramm und werden von Marinus Scientific erhalten.
2. Merken die narkotisierten Tier zu einem Wachs bedeckt Gericht. Spritzennadeln funktionieren gut für diesen Zweck, sterile Techniken sind nicht erforderlich. Mit grober Pinzette und Standard-Schere einen Einschnitt in das Tier den Fuß und setzen die bukkalen Masse. Suchen Sie die bukkale Ganglion. Mit Feder Schere und feinen Pinzette vorsichtig kostenlos das Ganglion, indem alle bukkalen Nerven.
3. Entfernen Si....

Diskussion

Wir demonstrieren Techniken, die verwendet werden, um gleichzeitig zu überwachen die intrazelluläre Calciumkonzentration und Beurteilung der Wirksamkeit der synaptischen Übertragung kann. Diese Techniken sind nützlich, um zu bestimmen, wie verschiedene Formen von kurzfristigen Plastizität vermittelt werden.

Das Abbildungssystem wird mit einem Fluoreszenzmikroskop und CCD-Kamera durchgeführt wird. Diese Anforderungen an die Ausrüstung sind relativ bescheiden, wenn die meisten der funktionelle.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagent Name	Firma	Katalog-Nummer	Kommentar
Calcium orange	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
Calcium Kalibrierpuffer Kit	Invitrogen	C-3008MP	zum Testen der Empfindlichkeit und den Dynamikbereich des Signals
Magnesiumchloridhexahydrat	Sigma	M0250	verwendet in 0,33 M Lösung Tier zu betäuben

Ausrüstung Name	Firma	Kommentar
FN-1 aufrecht Fluoreszenzmikroskop	Nikon Instruments	mit Narishige ITS-FN1 Bühne
NMN-21 Manipulatoren	Narishige	montiert auf der Bühne mit Magneten
CoolSNAP HQ 2-CCD-Kamera	Photometrics
NIS Elementen AR (Version 3.22)	Nikon Instruments	Imaging-Software verwendet werden, um Fluoreszenz-Daten zu erfassen
10X/0.3w Plan Fluor Ziel	Nikon Instruments	Dieses Wasser Immersionslinse hat einen sehr langen Arbeitstag Abstand von 3,5 mm
X-Cite 120 PC Metallhalogenidlampe	EXFO	verwendet für die Fluoreszenz-Bildgebung
LS-DWL Halogenlampe	Sumica
ET-CY3 Filter-Set	Chroma Technology	;
Macht 1401 A / D-Wandler	Cambridge Electronic Design	Probenahme wurde bei 3 kHz getan
Spike II (Version 7.07)	Cambridge Electronic Design	Software zur Elektrophysiologie Daten erfassen
SEC-10 LX-Verstärker	NPI-Elektronik	verwendet mit einem 10X Headstage
Modell 410 Verstärker	Brownlee Präzision	zum Verstärken und Filtern des Signals
WS-4	minus k Technologie	Schwingungsisolierung für die Bildgebung
Kühltisch	Maßarbeit	Messingplatte durch welche Eiswasser mit einer variablen Rate gepumpt