Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Zusammenfassung

Diese Video-Protokoll zeigt die Anwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) zur Identifikation und Trennung von verschiedenen Subpopulationen von Zellen in humanen Glioblastomzellen nach der Häufigkeit des Zellteilung basiert.

Zusammenfassung

Tumorheterogenität stellt eine grundlegende Funktion tragenden Tumor Robustheit und stellt eine zentrale Hindernis für die Entwicklung von therapeutischen Strategien ^ein. Um das Problem der Tumorheterogenität zu überwinden, ist es wichtig, Tests und Tools ermöglichen phänotypische, (epi) genetische und funktionelle Identifizierung und Charakterisierung von Tumor-Subpopulationen, die spezifische Krankheit Krankheiten zu fahren und stellen klinisch relevante Ziele zu entwickeln. Es wird jetzt allgemein anerkannt, dass Tumore unterschiedlichen Sub-Fraktionen von Zellen mit unterschiedlichen Frequenzen der Zellteilung zeigen, und dass die funktionalen Kriterien der langsamen Rad positiv mit Tumorbildung Fähigkeit in mehreren Krebsarten einschließlich des Gehirns, der Brust, der Haut und die damit verbundenen Bauchspeicheldrüse sowie Leukämie ^2-8. Der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) hat zum Verfolgen der Teilung Häufigkeit von Zellen in vitro und in vivo im Blut übertragbaren t verwendetumors und soliden Tumoren wie zB Glioblastoma ^2,7,8. Das Zell-permeierenden nicht fluoreszierenden Prodrug CFSE wird durch intrazelluläre Esterasen in eine fluoreszierende Verbindung, die innerhalb der Zellen durch kovalentes Binden an Proteine ​​durch Reaktion seiner Succinimidyl-Komponente mit intrazellulären Amingruppen zu bilden stabile Amidbindungen ⁹ zurückgehalten wird umgewandelt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird gleichmäßig zwischen Tochterzellen auf Bereiche verteilt werden, was zu einer Halbierung der Fluoreszenzintensität mit jeder Zellteilung. Dies ermöglicht die Verfolgung von Zellzyklus Frequenz von bis zu 8-10 Runden Teilung ^10. CFSE Rückhaltevermögen wurde mit Hirntumorzellen zur Identifizierung und Isolierung eines langsamen Rad Subpopulation (obere 5% Farbstoff haltenden Zellen) nachgewiesen, bei Krebs Stammzellaktivität ² angereichert werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Technik der Färbung von Zellen mit CFSE und die Isolierung einzelner Populationen innerhalb einer Kultur von menschlichen GlioBlastom (GBM)-abgeleiteten Zellen mit unterschiedlichen Teilungsraten mittels Durchflusszytometrie ^2. Die Technik hat dazu gedient, zu identifizieren und zu isolieren, einen Hirntumor slow-cycling Population von Zellen, die aufgrund ihrer Fähigkeit, die CFSE Kennzeichnung erhalten.

Protokoll

Ein. Vorbereiten Glioblastoma Single Cell Suspension

1. Gliomasphere Kultur aufgebaut und gepflegt mit dem Neurosphäre Assay (NSA), wie zuvor beschrieben ^2,11,12.
2. Zum geeigneten Zeitpunkt für Passagieren der gliomaspheres wird das Medium mit den Kugeln entfernt, in einer geeigneten Größe sterilen Zellkulturgefäß und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Der Überstand wird verworfen und das Pellet von Kugeln wird in 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA resuspendiert und bei 37 ° C in einem Wasserbad für 3-5 min.
4. Ein gleiches Volumen von Sojabohnentrypsininhibitor wird dann verwendet, um die Trypsin-Akti....

Diskussion

Eine wachsende Zahl von Studien haben die Bedeutung eines langsamen teilende Unterabteil von Zellen in Krebszellen, die Tumorbildung und Therapieresistenz ^2-8 beitragen demonstriert. Daher ist es wichtig, zu beschreiben und zu standardisieren experimentellen Methoden, mit denen das Studium dieser spezifischen Subpopulation von Zellen oder mehr allgemein Subpopulationen mit unterschiedlichen Wachstumsraten vergleichen. Mit CFSE zu identifizieren und zu isolieren, Sub-Fraktionen von Zellen auf ihre Rate der Zel.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Typ	Firma	Katalog-Nummer
NeuroCult NSC Basal Medium (Human)	Medium	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human)	Medium Ergänzung	Stem Cell Technologies	05753
0,05% Trypsin-EDTA	Reagens	Gibco	25300-062
Sojabohnentrypsininhibitor	Reagens	Sigma	T6522
Penicillin / Streptomycin	Reagens	Gibco	15140-122
T25-Flasche	Kultur ware	Nalge Nunc International	136196
T80 Kolben	Kultur ware	Nalge Nunc International	178905
15 ml Röhrchen	Kultur ware	BD Falcon	352096
50 ml Röhrchen	Kultur ware	BD Falcon	352070
EGF	Wachstumsfaktor	R & D	2028-EG
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Fluorescent Cell Division Markierungsfarbstoff	Molecular Probes, Invitrogen	C34554