Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

Summary

Imaging embryonalem Gewebe in Echtzeit wird über längere Zeit eine Herausforderung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test zur Überwachung der zellulären und subzellulären Veränderungen im Rückenmark Küken für längere Zeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Diese Technik kann für andere Regionen des Nervensystems und sich entwickelnden Embryo angepasst werden.

Abstract

Die embryonale Rückenmark besteht aus Radfahren neuronale Vorläuferzellen, die Anlass zu einem großen Prozentsatz der neuronalen und glialen Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS). Obwohl viel über die molekularen Mechanismen, die Muster des Rückenmarks bekannt ist und entlocken neuronalen Differenzierung ^{1, 2,} fehlt uns ein tiefes Verständnis dieser frühen Ereignisse auf der Ebene des Verhaltens von Zellen. Es ist daher wichtig, das Verhalten der neuralen Vorläuferzellen in Echtzeit zu untersuchen, wie sie Neurogenese unterzogen.

In der Vergangenheit Echtzeit-Bildgebung von frühen embryonalen Gewebe durch Zellen / Gewebe Lebensfähigkeit in Kultur als auch die phototoxische Effekte von Fluoreszenz-Bildgebung beschränkt. Hier präsentieren wir eine neuartige Assays für die Bildgebung solche Gewebe für längere Zeit, die Verwendung eines neuartigen Ex-vivo-Kokultur-Protokoll und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 1). Dieser Ansatz erzielt langfristige Zeitraffer-Überwachung von Kükenembryonen sPinal Schnur Progenitorzellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Dieser Assay modifiziert werden, um Bild eine Reihe von embryonalem Gewebe ^{3, 4} Neben der Beobachtung von zellulären und subzellulären Verhaltensweisen, die Entwicklung von neuartigen und hochsensiblen Reporter-Gen-Aktivität werden (z. B. Notch ⁵⁾ macht diesen Test ein leistungsstarkes Tool, mit dem zu verstehen, wie Signalweg reguliert das Verhalten der Zelle während der embryonalen Entwicklung.

Protocol

1. Dish Vorbereitung

1. Geschirr für Stück Kultur verwendet werden, sind mit Glasboden (mit einem Deckglas als Basis) (Willco Gerichte). Diese basieren auf Linsengewebe in einer 6 cm Gewebekulturschale zu halten Glasboden sauber platziert.
2. Am Tag vor dem Experiment, 2 ml 0,1% Poly-L-Lysin-Lösung für den Glasboden Schüssel und Inkubation für 5min bei Raumtemperatur, damit das Poly-L-Lysin zur Beschichtung der Glasboden.
3. Entfernen Poly-L-Lysin-Lösung und spülen Sie drei Mal in vollentsalztem Wasser, und dann noch einmal in 70% Ethanol.
4. Lassen Sie über Nacht trocknen. Geschirr kann auch durch leichtes Erwärmen in der Mikrowelle bei niedriger Leistung für 30-45 Sekunden getrocknet werden.

2. Embryo Elektroporation

1. Eier inkubieren bei 37 ° C zu Hamburger-Hamilton (HH) Stufe 10 (~ 36 Stunden) (oder einem anderen gewünschten Stufe).
2. Vor Beginn der Vorbereitung Glasnadeln (wir verwenden eine Flaming / Brown-Modell p87 Mikrokapillare Abzieher) und brechen Sie die Spitze des needle mit einer feinen Pinzette unter einem Binokular. Das Ende der Nadel sollte scharf genug zu durchbohren der Embryo zwar nicht so eng, dass es der Injektion des DNA-Lösung behindert.
3. Fenster Eier und Ort Elektroden (5mm Abstand) auf beiden Seiten des Embryos
4. Inject DNA (~ 0,025 bis 0,5 ug / ul in VE-Wasser mit einer geringen Menge schnell grün eingefärbt) in das Neuralrohr.
5. Tragen Sie aktuelle - 12-17 V dreimal, 50ms Pulslänge mit 950 ms zwischen den Impulsen.
6. Wir verwenden niedrigen Konzentrationen von DNA und niedrigen Spannungen an Elektroporation Mosaik Expression zu erreichen, so dass wir einzelnen Zellen zu folgen.
7. Cover Fenster in der Eierschale mit Klebeband und sicherzustellen, dass es dicht ist.
8. Erlauben Embryonen für 3-4 Stunden oder über Nacht bei 37 ° C erholen

3. Collagen und Slice-Kulturmedium Vorbereitung

1. Bereiten Collagen-Mix und in Scheiben schneiden Kulturmedium etwa eine Stunde vor dem Schneiden.
2. Zu 300 ul typ 1-Kollagen mit 100 ul 0,1% Essigsäure-Lösung und 100 ul 5 x L15 Medium. Vortex gründlich nach jeder Zugabe. Die Lösung sollte gelb werden.
3. Fügen Sie nun 15-20 ul 7,5% Natriumbicarbonat und gründlich vortexen. Die Lösung sollte leicht rosa geworden, und das Volumen von Natriumbicarbonat dafür benötigten können abweichen. Halten Sie auf dem Eis und machen jedes Mal frisch.
4. Zu 10 ml Neurobasalmedium hinzufügen B-27 Ergänzung und Glutamax, zu einem 1 x Endkonzentration und 10 ul Gentamicin-Lösung.
5. Ort Medium in einem 37 ° C Inkubator gepuffert mit 5% CO _2. Lassen Sie die Oberseite des Behälters locker, damit es mit dem CO ₂ ausgleichen.

4. Slice-Kultur

1. Entfernen Embryonen aus Ei und waschen in L15 Medium.
2. In eine Gewebekulturschale mit einer Schicht aus Sylgard an der Unterseite und stecken Sie sie durch die umliegenden extra-embryonalen Membranen, so dass sie straff gespannt sind.
3. Mit einem Mikrofonroknife, Slice Embryo so gerade wie möglich durch Region von Interesse. Für die Wirbelsäule, sollte Scheiben zwischen 1-2 Somiten dick sein. Lassen Sie Scheiben, die an Embryo, während Sie andere Embryonen, so dass Sie nicht verlieren, sie zu schneiden.
4. Bereiten Sie eine 200 pl Mikropipettenspitze durch Abschneiden ~ 1 mm von der Spitze und Anbringen dieser auf eine P2-oder P10. Dieser Tipp wird verwendet, um die Wirbelsäule Scheiben an den Glasboden Gericht übertragen werden. Ein 10 ul Spitze ist nicht breit genug, um abholen Scheiben schneiden.
5. Bestreichen Sie die Innenseite der Spitze mit Kollagen durch Pipettieren 1 ul Collagen-Mix vorbereitet früher. Verlassen Sie für 1-2 Minuten und dann spülen mit L15 Medium. Dies wird das Gewebe Kleben an der Innenseite der Spitze zu verhindern.
6. Nehmen Scheibe von Embryo mit Hilfe eines microknife und entfernen aus der Schale mit einem P2 oder P10 mit einer 200 ul Spitze versehen und auf 1 pl. Versuchen Sie, mit möglichst wenig Medium wie möglich.
7. Vortex das Kollagen Mischung Drop 5-8 ul diese an das Poly-L-Lysin beschichtete Schale.
8. ImmediaTely setzen Embryo Scheibe in Kollagen und Position in Stelle mit einer feinen Pinzette. Scheiben sollten so positioniert, dass die Seite, die abgebildet werden bündig mit dem Deckglas ist. Das Gewebe sollte der Poly-L-Lysin-Beschichtung auf dem Deckglas haften.
9. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie einige Scheiben auf dem Deckglas zu haben. Wir können in der Regel 6-9 legen Scheiben auf einem Teller.
10. Nachdem alle Scheiben vorhanden sind, decken Sie die Schüssel und lassen Sie das Kollagen zu 20 Minuten eingestellt. Einige der frühesten angeordnet Kollagen kann bereits begonnen haben zu trocknen. Um dies zu verhindern eine kleine Menge von L15, diese vor abdeckt.
11. Einmal eingestellt, vorsichtig 2ml Scheibe Kulturmedium, das äquilibriert wurde in 5% CO ₂ bei 37 ° C für mindestens eine Stunde. Es ist darauf zu verdrängen nicht das Kollagen aus dem Deckglas werden.
12. Platz in einem 37 ° / 5% CO _2-Inkubator und erlauben Scheiben für mindestens 3 Stunden vor der Bildgebung zu erholen. Wenn es keine Feuchtigkeit, statt Schüssel in einer Plexiglas-Box Witzha bisschen feuchten Papiertüchern in einer Ecke.

5. Imaging Embryo Scheiben

1. Wir verwenden eine DeltaVision Core-wide-field-Mikroskop mit einem WeatherStation Klimakammer zu Bildschnitten ausgestattet. Die Kammer wird konstant auf 37 ° C, mit einem CO _2-Perfusion Vorrichtung gehalten, um die Mikroskoptisch bei 5% CO _2/95% Luft zu halten.
2. Imaging wird in der Regel mit einem 40-x / 1,30 NA Ölimmersionslinse und Bilder sind mit einem CoolSnap HQ2 eingefangen gekühlte CCD-Kamera durchgeführt.
3. Z-Profile werden alle 1,5 um bis 45 um Gewebe eingefangen. Belichtungszeit sollte so niedrig wie möglich gehalten werden. Wir in der Regel für 5 bis 50 ms aussetzen für jeden Z-Abschnitt. Die Bilder werden alle 7 Minuten gefangen genommen und bis zu 9 Scheiben können besichtigt Verwendung des Systems DeltaVision genauen Punkt zu besuchen Funktion sein.

6. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel Zeitraffer-Sequenz des Rückenmarks Progenitorzellen istgezeigt in. 2a und entsprechenden Movie 1. Imaging wurde auf einer Rückenmark Slice aus einer zwei Tage alten (HH Stadium 12) Embryo begonnen. Diese Zelle wurde mit einem Konstrukt, die GFP-αTubulin transfiziert. Während dieser frühen Phase durchlaufen neuronale Vorläuferzellen überwiegend Vorläuferzellen-Vorläuferzellen Modus Divisionen, während der die Zellen sich teilen, um zwei weitere Rad-Vorläuferzellen zu erzeugen. Abb. 2b und entsprechende Film 2 zeigt eine Zelle mit GFP-GPI (GPI-verankerten GFP) transfiziert, Kennzeichnung der Zellmembran. Diese Zelle erfährt eine Spaltung, während der die basalen Prozess spaltet sich in zwei und sind zu gleichen Teilen an die Tochterzellen vererbt.

Abbildung 1. Slice-Kultur-Protokoll für Zeitraffer-Bildgebung.

Abbildung 2. Zelle behavior während der normalen Entwicklung des Rückenmarks. (a) ausgewählte Bilder aus Film 1. Zelle, die GFP-Tubulin unterteilt mit einer Schnittstelle Ebene, die senkrecht zu der apikalen Oberfläche (2 h 20 min), Erzeugen von zwei Tochterzellen, die wieder (24 h 23 min und 25 h 54 min) zu unterteilen. (B) ausgewählte Bilder aus Movie 2. Zelle mit GFP-GPI transfiziert erfährt die Zellteilung, während der die basalen Prozess aufgeteilt (weiße Pfeile) und wird zu gleichen Teilen von den Tochterzellen vererbt.

Movie 1. Hier klicken, um Film anzusehen .

Movie 2. Hier klicken, um Film anzusehen .

Discussion

Wir stellen Ihnen hier eine neue Zeitraffer-Imaging-Test des Verhaltens von Zellen in Hühner-Embryonen Hirnschnittmodell überwachen. Dieser Assay ermöglicht die hochauflösende Bildgebung von lebendem Gewebe für bis zu 70 Stunden, obwohl Zeitrahmen zwischen 24-48 Stunden leichter zu erfassen sind. Die Verwendung eines hohen NA Öl-Objektiv und relativ kurzen Abständen zwischen Zeit-Punkte ermöglicht Bildaufnahme mit hoher Auflösung, sowie es uns ermöglicht, das Verhalten der Zelle, die oft auftreten rasch zu überwachen, und kann einfach während herkömmliche Zeitraffer-Bildgebung mit Hilfe der konfokalen entgehen lassen Mikroskopie.

Der große Vorteil dieses Tests ist die Fähigkeit, Bildzellen über lange Zeiträume. Die Verwendung von ^Weitwinkel-6 statt konfokalen Laser Scanning Mikroskopie ⁷ ist von entscheidender Bedeutung für diese. Die konfokale Mikroskopie ist traditionell mehrere Vorteile gegenüber Weitfeld-Mikroskopie angeboten, einschließlich der Möglichkeit, optische Schnitte zu nehmen und zu beseitigen unscharf Informationen direkt ^{7, aber die Verwendung einer Lochblende führt zu einem Verlust von Licht zu dem Detektor 8, ohne eine signifikante Menge an Information, und es muss längere Belichtungszeiten. Weitwinkel-Mikroskopie, auf der anderen Seite, verwendet volle Hellfeldbeleuchtung und alle das Licht, das durch das Objektiv mit dem Detektor gesandt. Dies gepaart mit einer hohen Quanteneffizienz gekühlt Coupled Device (CCD)-Kamera sorgt für Bildgebung mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu konfokalen Mikroskopie 9, mit sehr schnellen Belichtungszeiten. In unserer Anwendung müssen wir die Grafik für eine längere Zeit, Rekord 3D-Stacks und letztlich zu lösen kleine Beinahe-beugungsbegrenzte Strukturen. Obwohl der konfokalen Mikroskopie wird verhindert, out-of-focus Licht aus immer den Detektor erreicht und damit deutlich reduziert Hintergrundgeräusche in dicken, dicht-markierten Proben 7, 8, es werde nur ein brauchbares Signal-Rausch-Verhältnis mit viel größeren Licht-Eingang als breit- Mikroskopie 10. Für sehr lichtempfindlich sparsely-markierten Proben wie unsere elektroporierte Rückenmark Scheiben, deshalb führt Weitfeldmikroskopie besser als der konfokalen Mikroskopie. Wenn es mit Image-Wiederherstellung durch Entfaltung kombiniert, entfernt die Informationen aus dem Fokus und verbessert den Kontrast, wide-field ist dann besonders gut für die Erfassung von kleinen, dunklen Objekten 11. Während nicht für jede Tissue Imaging Experiment wurde dieser Ansatz als sehr wirksam für unsere Live Cell Imaging Anwendung.}

Die Wahl der fluoreszierende Protein ist ein wichtiger Faktor, der das Überleben der Zelle zu beeinflussen kann. Wir finden, dass die besten Ergebnisse, Konstrukte, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) ^{12 zu} verwenden als Marker erhalten. Wir prüfen derzeit eine Reihe von rot fluoreszierende Proteine, die effektiv in Kombination mit GFP für Dual-Channel-Zeit erlischt, kann verwendet werden. Es gibt eine Vielzahl solcher Proteine ​​verfügbar ^13. Obwohl viele Proteine ​​sind als Fusionen mit einem fluoreszierenden Protein stabilKönnen einige Proteine ​​unstabil gemacht werden durch Schmelzen, was zu einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen. In solchen Fällen ist die Verwendung von Konstrukten, die eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) nützlich, um das Protein von Interesse aus dem fluoreszierenden Protein zu trennen.

Bei der Darstellung des Rückenmarks Scheiben, muss darauf geachtet werden, um die Exposition gegenüber Fluoreszenzlicht zu minimieren. Die Mikroskop-Okulare dürfen nur mit Durchlicht (Hellfeld) verwendet werden, zu lokalisieren und zu Position Scheiben schneiden. Fluoreszierende Bilder sollten immer aufgenommen mit der Mikroskop-Software mit minimalen Belichtungszeiten werden. Diese sollten in dem Bereich von 5-50 ms gehalten werden und die Verwendung von Neutralfilter sollte experimentiert werden. Obwohl längere Belichtungszeiten produzieren kann zunächst klarere Bilder, so können die phototoxische Effekte von Fluoreszenzlicht Exposition zum Zelltod führen. Die ersten 5-10 um Gewebe, das auf das Deckglas am nächsten ist nicht abgebildet, wie diese Region enthält Gewebe, das während geschädigt worden sein werdenSlicing.

Obwohl die hier vorgestellten Beispiele von Embryonen bei HH Stadium 10 und abgebildeten 6-7 Stunden später elektroporiert sind, kann diese Methode für Embryonen verwendet werden, bis zu Stufe 18 HH. In späteren Stadien ist das Gewebe des Rückenmarks viel größer und so schwierig ist, von Hand zu schneiden. In diesen Fällen kann das Einbetten der Embryonen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Schneiden mit einem Vibratom zu besseren Ergebnissen. Obwohl wir diesen Test zu präsentieren als Verfahren zur Abbildung von Zellen im sich entwickelnden Rückenmark, hat dieser Ansatz auch auf andere Bild embryonalen Geweben, einschließlich der sensorischen Plakoden ³ geändert worden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Willco Dish	Willco Wells	GWst-3522
Poly-L-Lysin	Sigma	P8970	0,1% Tris
Borosilikatglas Kapillaren	Harvard Instruments	GC100-10	1,0 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser
Elektroden (Genetrodes in ovo, L-förmigen	BTX	10-001850-01	5mm vergoldet
ECM 830 Quadratmeter Impulsgeber	BTX	45-0002	für die in ovo electroopration
Fast Green	Sigma	F7258
Typ I-Kollagen-Ratte	Sigma	C3857
L-15-Medium (Pulver)	Sigma		2,76 g / L in destilliertem Wasser für 5-fach-Lösung
Natriumbicarbonat	Sigma	S8761	7,5% ige Lösung
Neurobasalmedium	Invitrogen	12348-017	ohne Phenolrot
Glutamax	Invitrogen	A1286001	100x-Lösung
B-27 Ergänzung	Invitrogen	17504-044
Gentamicin	Invitrogen	15710049	10 mg / ml
L15 Medium (Flüssigkeit 1x)	Invitrogen	11415-049
Microknife	Altomed	A10102	15 Grad Neigung
Edelstahl-Gewindestifte	Watkins und Doncaster	E6871	Format DIN A1
Sylgard 184 Elastomer	VWR	634165S
DeltaVision Core-Mikroskop-System	Applied Precision
Coolsnap HQ2 CCD-Kamera	Photometrics