Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Zusammenfassung

Verfahren schnell Bildschirm Wirtspflanze flüchtigen Stoffe durch Messung der elektrophysiologische Reaktion von erwachsenen Nabel orangeworm ( Amyelois transitella)-Antennen, um einzelne Komponenten und Mischungen über elektroantennographischer Analyse nachgewiesen wird.

Zusammenfassung

Pflanze flüchtigen spielen eine wichtige Rolle bei Pflanze-Insekt-Wechselwirkungen. Pflanzenfressende Insekten benutzen Pflanzen flüchtige Stoffe, wie Kairomonen bekannt, um ihre Wirtspflanze zu lokalisieren. ^1,2 Wenn eine Wirtspflanze ist ein wichtiger Rohstoff agronomischen Fraßschäden durch Schädlinge können schwere wirtschaftliche Verluste für die Erzeuger zuzufügen. Dementsprechend kann Kairomonen als Lockmittel eingesetzt werden, um zu locken oder zu verwirren diese Insekten und bieten somit eine umweltfreundliche Alternative zu Pestiziden zur Schädlingsbekämpfung. ³ Leider Pflanzen können eine große Anzahl flüchtiger mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Verhältnisse von Emissionen in Abhängigkeit von der Phänologie emittieren der Ware oder der Tageszeit. Dies macht die Identifizierung von biologisch aktiven Komponenten oder Mischungen von flüchtigen Komponenten ein mühsamer Prozess. Zur besseren Identifizierung der bioaktiven Komponenten der Wirtspflanze flüchtigen Emissionen setzen wir die Labor-basierte Screening-Bioassay Elektroantennographie (EAG). EAG ist ein effektives Instrument zur Bewertung und Record elektrophysiologisch die olfaktorischen Reaktionen eines Insektes über ihre antennalen Rezeptoren. Die EAG Screening-Verfahren kann dazu beitragen, die Zahl der flüchtigen Stoffe getestet, um vielversprechende biologisch aktiven Komponenten zu identifizieren. Allerdings EAG Bioassays nur Auskunft über Aktivierung von Rezeptoren. Sie enthält keine Informationen über die Art des Verhaltens von Insekten die Verbindung löst, was könnte als Lockmittel, abstoßend oder andere Art von Verhaltensreaktionen sein. Flüchtige Hervorrufen eine signifikante Antwort von EAG, bezogen auf eine geeignete positive Kontrolle, werden typischerweise auf einer weiteren Prüfung von Verhaltensreaktionen der Schädling aufgenommen. Das experimentelle Design präsentiert ausführlich die Methoden zu Mandel-basierte Wirtspflanze flüchtigen ^4,5 durch Messung der elektrophysiologischen Reaktionen antennalen eines Erwachsenen Schädling Nabel orangeworm (Amyelois transitella), um einzelne Komponenten und einfache Mischungen von Komponenten über EAG Bioassay zu screenen. Das Verfahren nutzt zwei Exschnittene Antennen platziert über eine "Gabel" Elektrodenhalter. Das Protokoll hier gezeigt stellt eine schnelle, High-Throughput-standardisierten Verfahren zum Screening flüchtiger Bestandteile. Jeder flüchtig ist bei einer eingestellten, konstanten Menge als die Anregungspegel standardisieren und ermöglichen so Antennallobus Reaktionen als indikativ für die relative chemoreceptivity. Die negative Kontrolle hilft dabei, die elektrophysiologische Reaktion auf sowohl restliche Lösungsmittel und mechanische Kraft der Blätterteig. Die positive Kontrolle (in diesem Fall Acetophenon) ist eine einzige Verbindung, die ausgelöst eine kohärente Reaktion der männlichen und weiblichen Bauchnabel orangeworm (NOW) Motte hat. Ein weiterer Standard, der semiochemischen einheitliche Reaktion bereitstellt und für den Bioassay Studien mit dem männlichen NOW Motten, (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, ein Aldehyd-Komponente aus dem weiblichen hergestellten Sexualpheromon. ^6-8

Protokoll

1. Vorbereitung von flüchtigen Stoffen aus der Wirtspflanze für EAG Screening entdeckt

1. Nach entsprechender Identifizierung und Authentifizierung aller flüchtigen Bestandteile via GC-MS, führen EAG puff Analyse der einzelnen flüchtigen verfügbar. Das anfängliche Screening kann eine niedrige Anzahl von Wiederholungen Antennallobus Antworten (N = 3-5) für jedes Geschlecht sein, um eine Anzeige der relativen chemoreceptivity in einer kurzen Zeit (Tabelle 1) zu erreichen.
2. Eine Lösung aus jedem flüchtigen bei einer 5 mg / ml-Konzentration in Pentan. Dicht verschließen und kühl stellen, bis die Probe für den sofortigen Einsatz (z. B. Acetophenon, Dichte = 1,03 g / ml, volume = (0,005 g/1.03 g / ml) × 1.000 = 4,85 ul von Acetophenon in ein 1,0 ml-Messkolben und zu verdünnen 1,0 ml mit Pentan).
3. Unmittelbar vor der Analyse EAG, entfernen die Fläschchen, die 5 mg / ml Konzentration an flüchtigen Stoffen zu prüfenden und zu ermöglichen, sich auf Raumtemperatur erwärmen. Inzwischen bezeichnen die richtige Anzahl von Pasteurpipetten zukorrelieren mit jedem flüchtigen getestet werden soll, und wickeln Sie ein kleines Stück Parafilm (ca. 15 × 15 mm) über die Spitze der Pipette. Für die erste Screening-10 Stimulus Pipetten (N = 4 für jede männliche und weibliche) werden im Falle einer schlechten Vorbereitung oder andere unvorhergesehene Hindernisse geladen.
4. Mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig falten Sie den Bioassay Scheibe in zwei Hälften, um die Platzierung in die Pipette zu erleichtern, dann legen Sie die teilweise gefalteten Disc in das große Ende der Pipette, so dass ca. 2-3 mm von der Platte ausgesetzt sind. Richten Sie die markierte und vorbereitet Pipetten in einem Rack Halter.
5. Mit einer Pipette oder Spritze, laden 10 l (50 g) von flüchtigen Lösung auf jeder Disc und warten Sie 2 Minuten, bevor das Einlegen von Medien in vollem Umfang in die Pipette passieren. Einmal geladen, sofort verschließen Sie das Ende der Pipette mit Parafilm (ca. 15 × 30 mm). Die Menge an flüchtigen Reiz zu verladen und aufgeblasen werden, wird höchstwahrscheinlich mit Insekten Arten variieren.
6. Nach dem gleichen Protokoll oben erwähnt vorbereitet Steuerelementegehören in jeder Analyse. Für die Negativkontrolle Last von nur 10 l Pentan auf jeder Disc, 2 Minuten warten, laden in den gekennzeichneten Pipette und Dichtung. Für die positive Kontrolle, laden 10 l (50 g) auf die Disc, 2 Minuten warten, Last in den gekennzeichneten Pipette und Dichtung mit Parafilm.
7. Die Lebensfähigkeit des Insekts antennalen prep wird höchstwahrscheinlich mit Arten variieren, aber wir haben festgestellt, dass Amyelois transitella Antennen in der Regel aktiv bleiben und konsequent für> 30 Minuten nach der Exzision mit dem beschriebenen Protokoll. Diese Zeit wird im Allgemeinen bis auf 4-10 flüchtigen Proben ausgewertet werden können. Tabelle 2 gibt ein Beispiel von Malen und Sequenzen.

2. Vorbereitung der Insektenfühler für EAG Bioassay

1. Der Schwerpunkt dieses Experiment wird EAG-Analyse, so die Annahme, dass jeder Prüfer den Zugriff auf entsprechend aufgezogen Insekten haben.
2. Für dieses Experiment werden wir studieren 3-4 Tage old, gepaart männlichen und weiblichen Motten. Individuelle Motten sind in einem kleinen, mit Deckel, Kunststoff-Behälter der Tag der Analyse übertragen. Unmittelbar vor der Bioassay wird die Motte zu prüfenden Kopf voran in eine Haltevorrichtung (dh aus verschiedenen Kunststoff-Pipettenspitzen) und von hinten gesichert übertragen. Manipulation des Insekts kann unter einer Low-Power-Stereo-Mikroskop zu erleichtern Exzision angesehen werden.
3. Antennen werden mit Hilfe einer Draht-bestückten Werkzeug gehänselt. Die Gabelhalter, mit einem kleinen Film aus Elektroden-Gel, in unmittelbarer Nähe für die schnelle Übertragung von Antennen angeordnet. Die erste Antenne ist mit Mikroscheren ausgeschnitten und auf der Gabel, die Gewährleistung der Basis der Antenne ist auf der nicht-roten Teil der Gabel (die indifferente Masseelektrode) angeordnet ist. Ein Timer-Set für 10 Minuten gestartet wird und die zweite Antenne wird herausgeschnitten und neben der ersten Antenne mit beiden Basen auf der gleichen Seite der Gabel.
4. Alternativ können die Antennen links befestigt werden im holding Tube, ausgeschnitten, dann sanft von zwischen dem Rohr und das Insekt unter Verwendung eines Draht-Werkzeug aus den festen mit einem Klecks Gel am Ende entfernt.
5. Antennen werden überprüft, um sicherzustellen, dass die Basis und der Spitze in Elektroden-Gel getaucht werden und keine Blasen in dem Gel. Die Enden / Tipps können getrimmt werden, um volle Exposition gegenüber dem Elektroden-Gel zu gewährleisten. Es sollte sichergestellt werden, dass der Rest jeder Antenne nicht mit Gel bedeckt, so garantieren maximale Antennallobus Oberfläche wird auf der Zug ausgesetzt werden.
6. Das vorbereitete Gabel wird dann in die Sonde Vorverstärker eingesetzt und unter einem konstanten Strom von befeuchteter Luft bei 200 ml / min für die verbleibende Zeit der 10 minütigen Wartezeit. Die Verbrauchsteuern Zeit und EAG Initiation mal notiert (Tabelle 2) und 30 Sekunden vor dem ersten Stimulus puff, die Pipette mit der positiven Kontrolle wird entsiegelt und in die Halterung, die eingestellt wird, um direkte Flugverbindung / puff Flow von 2-3 mm die Antennen vorbereitet.
7. Nach jedem experiment werden die Test-Motten in einem Trockeneis-Umgebung eingeschläfert und fachgerecht entsorgt.
8. Weibliche Motten werden seziert der Paarung Status zu überprüfen. Cohabitating Männchen verpaart angenommen haben.

3. EAG-Protokoll für die einzelnen Komponenten

1. Antennalen Antworten werden über die Software mit dem AutoSpike Syntech EAG Instrument enthalten aufgezeichnet. Die Konfiguration im AutoSpike Registerkarte Eigenschaften für den Kanal mit dem EAG-Sonde wird mit einer Abtastrate von 106,7, NEIN zu beheben, und einen Filter von 0-42 Hz eingestellt. Für die Registerkarte Filter, ist die EAG-Filter ON und die Low-Cutoff auf 0,1 Hz eingestellt.
2. Stimulus Puffs sind in 1-2 Sekunden Dauer. Ein Timer für 1 Minute eingestellt ist nach jedem Zug gestartet.
3. Der nächste Test flüchtigen Pipette wird entsiegelt und in die Halterung ein. Die Reihenfolge der Tests flüchtigen, randomisierte zwischen läuft, um sicherzustellen, keine Testverbindungen konsequent einen weiteren Test flüchtig ist, wird dann folgte (z. B. Tabelle 2) sorgfältig allowing 1 Minute zwischen den Zügen.
4. Um eine einfache Lesen EAG Antworten zu erleichtern, werden Teile der Lineale auf dem Bildschirm platziert, und die Grundlinie Ebene der Spitze der Auslenkung nach unten Signal wird in mm gemessen und protokolliert auf einem Datenblatt (dh für die Einstellung 5 mV, 33 mm = 2,5 mV). Die Software hat die Fähigkeit der Wiedergabe der gespeicherten Aufnahmen für eine spätere Analyse. Umrechnung von mm zu beiden mV oder uV Amplitude wird in späteren Datenanalyse durchgeführt.
5. Nach dem letzten Zug positive Kontrolle (zB Eintrag # 12) verabreicht wird, die Antennen entfernt werden, wird die Gabel mit einem Ethanol-gesättigten Wischen gereinigt und gelassen, bevor nachfolgende Verwendung zu trocknen.
6. Um den Durchsatz des Assays erhöhen, kann die Entfernung der nächsten Gruppe von Antennen durch ein zweites Labor Personal ca. 10 Minuten vor dem Ende der aktuellen Experiment gestartet werden - nach dem vierten Zug, der zweite Test flüchtige des aktuellen Experiment, nach Tabelle 2. Auf diese Weise können for der Beginn des nächsten Versuch unmittelbar nach der aktuellen Experiment Enden.
7. Höhere Anzahl von Wiederholungen (auf verschiedenen Antennen) können auf Verbindungen von Interesse durchgeführt werden, um weitere statistische Validierung liefern.

4. Ein Beispiel für EAG Analyse von Mischungen oder anderen Matrices (Tabelle 3)

1. Als nächstes werden die Verhältnisse und Volumina für zwei tertiären Mischungen (3-Komponenten-Mischungen) berechnet, um ein Beispiel der Kombination von flüchtigen Hervorrufen hohen EAG Reaktionen (Tabelle 4) bereitzustellen. Die Berechnungen sind für einige grundlegende Verhältnisse, einem 1:1:1-Molverhältnis von α-Humulen: 2-Undecanon: 2-Phenylethanol und dann den Vergleich zu einem zweiten Mischungsverhältnis von 1:2:4.
2. Mit ähnlichen Protokolle beschrieben, die Mischungen hergestellt und etikettiert sind Pasteurpipetten werden zusammen mit den notwendigen positiven und negativen Kontrollen geladen.
3. Die flüchtigen Proben werden über männliche und weibliche Antennen aufgeblasen und die Antworten werden gemessen und protokolliert aufum ein Datenblatt (Tabelle 3).

5. Repräsentative Ergebnisse

Für weibliche Bauchnabel orangeworm die folgenden Einstellungen verwendet: 2 Sekunden Puffs, 10 Sekunden Aufnahmezeit, 10 Sekunden-Fenster, und 5 mV Skala. Eine negative Ablenkung ist die typische Antwort, doch der absolute Wert wird aufgezeichnet (zB -3.400 uV Auslenkung wird als 3400 uV aufgezeichnet). Eine relativ schwache Reaktion des prep mit der positiven Kontrolle wird verworfen. Abbildung 1 zeigt eine grafische Darstellung von einem schlechten Ansprechen auf die positive Kontrolle durch Nabel orangeworm.

Zum Beispiel von einem schlechten Steuerung Ergebnis ist die durchschnittliche weibliche antennalen Reaktion auf Acetophenon in der Regel ca. 2600 uV (2), wenn die Vorbereitung gab nur eine Antwort von ca.. 1300 uV wäre es verworfen und ein anderes Paar von Antennen vorbereitet. In ähnlicher Weise die durchschnittliche männliche Reaktion auf (Z, Z) -11,13-war hexadecadienal typically 3000 uV; damit, jede Reaktion weniger als 1.500 uV wurde in der Regel verworfen.

Die positive Kontrolle am Anfang und Ende jedes Experiments auch Informationen über den Zustand der Antennen. Eine Faustregel folgen wir für ein schnelles Screening ist, wenn die Antwort auf die antennalen puff der post-Kontrolle (Record Nr. 12, Tabelle 2) ist entweder weniger als 75% des ^1. Blätterteig des Pre-Steuerung (Rekord # 1 , Tabelle 2) oder weniger als der ^2. Zug der Pre-Steuerung (Record Nr. 2, Tabelle 2) dann wird das Experiment nicht in der Datenanalyse wegen der möglichen Verschlechterung des prep verwendet werden (Abbildung 3). Ein Beispiel für die erste Faustregel würde Rekord Nr. 1 sein = 2.730 uV und Record # 12 = 1680 uV; und die zweite Faustregel gilt, wenn Record # 2 = 2350 uV und Record # 12 = 1680 uV, In jedem dieser Fälle , würden die Vorbereitung und Experiment die Ergebnisse verworfen werden.

Einrepräsentatives Beispiel für die Korrektur der EAG-Werte als Reaktion auf die positive Kontrolle gemessen würde wie folgt aussehen.

Run #	EAG (uV)	Run # 2	EAG (uV)	Run # 3	EAG (uV)
(+) Strg	2800	(+) Strg	2420	(+) Strg	3030
Ein Cmpnd	3000	Ein Cmpnd	2500	Ein Cmpnd	3440
(-) Strg	530	(-) Strg	755	(-) Strg	910
Cmpnd B	2400	Cmpnd B	2000	Cmpnd B	2560
(+) Strg	2770	(+) Strg	2400	(+) Ctrl	3020

Unter Verwendung der Werte für einen N = 3 oben beschriebene Experiment wird die negative Kontrolle-Antwort von jedem Wert in jedem Experiment unter der Annahme, die negative Kontrolle ist die Grundlinie Antennallobus Reaktion auf die mechanische Zug und restliches Lösungsmittel abgezogen.

Run # 1	EAG (uV)	Run # 2	EAG (uV)	Run # 3	EAG (uV)
(+) Strg	2270	(+) Strg	1665	(+) Strg	2120
Ein Cmpnd	2470	Ein Cmpnd	1745	Ein Cmpnd	2530
(-) Strg	0	(-) Strg	0	(-) Strg	0
Cmpnd B	1870	Cmpnd B	1245	Cmpnd B	1650
(+) Strg	2240	(+) Strg	1645	(+) Strg	2110

Die positiven Kontrollen für jedes Experiment würde dann gemittelt und korrigiert werden, um 1000 uV und stellt fest, das Verhältnis zur Korrektur bis 1.000 uV. Ein Datenblatt (zB Excel) können leicht manipuliert werden, um Antworten auf verwertbare Daten umgewandelt werden.

Run # 1	Avg (uV)	Run # 2	Avg (uV)	Run # 3	Avg (uV)
(+) Strg	2255	(+) Strg	1655	(+) Strg	2115
(+) Strg adj.	1000 (0.443)	(+) Strg adj.	1000 (0.604)	(+) Strg adj.	1000 (0.473)

Die Multiplikation mit dem Korrekturverhältnis innerhalb jedes Experiment wurden die Werte für Verbindung A und Verbindung B werden dann eingestellt.

Run # 1	Adj. EAG (uV)	Run # 2	Adj. EAG (uV)	Run # 3	Adj. EAG (uV)
Ein Cmpnd	1094	Ein Cmpnd	1054	Ein Cmpnd	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

Die Durchschnittswerte (Mittelwerte) für jede Verbindung werden dann zusammen mit anderen einschlägigen statistischen Daten und der EAG-Antworten für den getesteten Verbindungen bestimmt können anschließend ausgewertet werdenfür die Kandidatur für eine weitere Untersuchung.

Verbindung	EAG (uV)	Nr. läuft, N =
Ein	1115	3
B	787	3

Abbildung 1. Vertreter EAG für männliche antennalen Reaktion (1.180 uV) an den Pre-Steuerung (1 ^st positive Kontrolle Blätterteig), die aufgrund der schlechten antennalen Antwort wäre nach Sicherstellung der Antennen verworfen haben guten Kontakt mit dem Gel. Blaue Balken im unteren Fenster stellen die 2 Sekunden puff flüchtiger. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. Vertreter EAG für die weibliche Antwort Fühlerglied (3.400 uV) auf der ^1. Blätterteig Pre-Steuerelement, das als angemessen betrachtet werden würde. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 3. Vertreter EAG für die weibliche Antwort Fühlerglied (1680 uV) auf die post-Kontrolle (letzte positive Kontrolle für jedes Experiment), die als arm werden würde, und suggestive Abbau von Antennen (<75% vom ^1. Vor-Steuer-oder < ^2. Blätterteig Wert von Pre-Steuerung). Für dieses Beispiel der ^1. Pre-Steuerung puff war 2730 uV und ^2. Vorregelung puff war 2350 uV. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 4. Vertreter EAG für die weibliche Antwort Fühlerglied (3.800 uV) an den Blätterteig eines Kandidaten flüchtige Mischung und den anschließenden Messungen der maximalen Anfangsauslenkung (3.800 uV), die anfängliche Steigung während der Zugzeit (0,3 mV = s/1.2 0,25 s / mV), und die Steigung für die restliche Dauer Blätterteig (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 5. Kleine modifizierte Gefäß, das eine Probenmatrix und die damit verbundenen flüchtigen Stoffe, über A. aufgeblasen werden transitella Antennen.

Tabelle 1. In sITU Emission von flüchtigen Nonpareil Mandeln (2007) und EAG Reaktionen durch eine andere und weniger empfindliche Konfiguration in der Autospike Programm bestimmt.

Tabelle 2. Beispiel eines Formulars für die Aufzeichnung männlichen und weiblichen antennalen Antworten auf individuelle flüchtigen Bestandteilen.

Tabelle 3. Beispiel eines Formulars für die Aufzeichnung männlichen und weiblichen antennalen Reaktionen auf flüchtige Mischungen und / oder Sträuße.

Tabelle 4. Beispiele für die Herstellung von 10 ml einer 5 mg / ml Lösung für zwei verschiedene Verhältnisse von Mischungen.

Tabelle 5. Beispiel der Form für die Aufnahme zwei Folgencutive Hauche des einzigen flüchtigen Komponenten über männliche und weibliche Antennen.

Diskussion

Verwendung Elektroantennogramm Aufnahmen als Bioassay Chemorezeption Reaktionen ein Zielinsekt zu bestimmen ist recht üblich und zahlreiche Studien unter Verwendung EAG als Detektor für Ausfluss aus einem Gaschromatogramm (GC-EAD) in der Literatur gefunden werden. ^9,10 Verfahren nachgewiesen wird ein schnelles Screening von äquivalenten Mengen an flüchtigen Komponenten mit hohen Wiederholungen für zuversichtlich Zuordnung der relativen Reaktionsfähigkeit geben. Das Programm in der AutoSpike Syntech Software i...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Acetophenon	Alfa-Aesar	A12727	Weibliche positive Kontrolle
(Z, Z) -11,13-Hexadecadienal	Suterra		Männlich positive Kontrolle
α-Humulen	Aldrich	53675	Sesquiterpen
2-Undecanon	Aldrich	U1303	Fettsäurederivat
2-Phenylethanol	Aldrich	77861	Benzoiden
Pentan	EMD	PX0167-1	Lösungsmittel
4-Kanal-Controller Erwerb	Syntech	IchDAC-4
EAG-Sonde, Vorverstärker	Syntech	Typ PRG-2
Antennenhalter	Syntech	Für PRG-2	Fork Elektrode
Stimulus-Controller	Syntech	CS-55	Luftdurchsatz und Puffs
Spectra Elektrodengel	Parker	12-02
Bioassay-Discs	Whatman	2017-006	6 mm
Pasteurpipetten	VWR	14673-010	5 ¾ "(14,6 cm)
Parafilm M	Bemis	PM-992