Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Summary

Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.

Abstract

Die Exposition gegenüber Diät, können Medikamente und frühes Leben Widrigkeiten während der sensiblen Fenstern des Lebens ^1,2 zu nachhaltigen Veränderungen in der Genexpression, die zur Darstellung von physiologischen und Verhaltens-Phänotypen beitragen führen. Solche Umwelt-Programmierung geeignet ist, die Anfälligkeit für Stoffwechsel-, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und psychische ^3,4 zu erhöhen.

DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen sind wichtige Prozesse in der Vermittlung der Gen-Umwelt-Dialog berücksichtigt und erscheinen auch auf Umwelt-Programmierung zu unterlegen ^5. Bei Säugetieren, DNA-Methylierung in der Regel umfasst die kovalente Addition einer Methylgruppe an der 5-Position von Cytosin im Kontext der CpG Dinukleotide.

CpG methyliert in einem hoch-Gewebe und Zell-spezifischen Weise so dass es eine Herausforderung, um diskrete, kleine Regionen des Gehirns, wo zellulären Heterogenität ist hoch und Gewebe Menge beschränkt zu studieren. Darüber hinaus beil Genexpression und Methylierung eng miteinander verknüpft Ereignisse, können erhöhte Wert durch den Vergleich beider Parameter in der gleichen Probe gewonnen werden.

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll (Abbildung 1) für die Untersuchung der epigenetischen Programmierung im Gehirn präsentiert mit der "mütterlichen Trennung 'Paradigma der frühen Leben Widrigkeiten zu illustrativen Zwecken. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von micropunches von differentiell Alters Mäusehirnen, aus denen DNA und RNA gleichzeitig isoliert werden können, so dass DNA-Methylierung und Genexpressionsanalysen in der gleichen Probe.

Protocol

1. Die Programmierung von Early Life Missgeschick

Mütterliche Trennung (MS) durchgeführt wird, um früh-Life-Stress (ELS) bei Jungtieren durch timed-trächtigen Mäusen C57BL/6N (postnatalen Tag 0 (P0) am Tag der Geburt) geliefert zu induzieren.

1. Einzelne Würfe in sauberen Käfigen (mit Heizkissen) für 3 h täglich von P1-10.
2. Control (Nicht-ELS) Jungtiere ungestört im mütterlichen Nest ganz.
3. Die Jungen werden mit ihren Müttern bis zum Absetzen (P21), nach welcher Zeit sie in Sex-angepassten Gruppen (3-5 Mäuse pro Käfig) unter Standardbedingungen Versuchstier Haltungsbedingungen untergebracht sind, gehalten.

2. Isolierung und Präparation von Hirngewebe

1. . Mäuse werden an gewünschten Zeiten durch Genickbruch getötet Hinweis: weil dieses Protokoll beinhaltet eine Stress-Paradigma, keine Betäubung vor dem Genickbruch gegeben, nicht zu stören normalen physiologischen Regulation von Stresshormonen. Schädel geöffnet undGehirn werden sorgfältig entfernt und sofort schockgefroren durch Eintauchen in Isopentan-Trockeneis, bevor es bei -80 ° C gelagert
2. Gehirne sind kryogeschnitten (10 um Dicke); Abschnitte sind auf Superfrost Glasobjektträger montiert und bei -20 ° C Verweis auf eine Standard-Maus stereotaktischen Atlas (zB Paxinos ⁶⁾ wird verwendet, um anatomische Präzision zu verifizieren und Einbeziehung der Region of Interest (zB für Neuronen im PVN gewährleisten - PVN - sammeln Abschnitten zunächst auf der Ebene des rostralen PVN, Bregma -0,75 bis -0,85).
3. Die Schnitte werden mit Kresylviolett gefärbt, um die Identifizierung der verschiedenen Hirnstrukturen zu erleichtern. Stempel (0,8 mm) der Bereiche von Interesse (zB PVN) durch in loco Mikrodissektion erhalten.

3. Nukleinsäure-Extraktion von Brain Punches

Ein optimiertes Protokoll für die gleichzeitige Gewinnung von DNA und RNA aus winzigen Gehirn definiert neuroanatomisch-regIonen für die Bisulfit-und Genexpressionsanalysen ⁷ beschrieben wird.

Hinweis: Unter Berücksichtigung, dass die RNA weniger stabil als DNA in der GTC-Puffer ist, empfehlen wir die Verarbeitung RNA zuerst. Das Homogenat zur DNA-Reinigung verwendet werden kann bei Raumtemperatur (RT) während dieser Zeit gehalten werden.

1. Homogenisieren Stempel mit einer Pipette und Vortexer in 400 ul Guanidiniumthiocyanat (GTC)-Puffer (4,5 M Guanidiniumthiocyanat, 2% N-Lauroylsarcosin, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-Mercaptoethanol, 0,2% Antischaummittel A) bei RT, vorbei mehrmals durch eine Injektionsspritze (29G) (Abbildung 2).
2. Split Lysat in gleiche Teile, sowohl RNA und DNA kann zur gleichen Zeit gewonnen werden oder getrennt, abhängig von den jeweiligen experimentellen Anforderungen.
3. Für die RNA-Reinigung hinzufügen 1/10 Volumen von NaOAc, 1 Volumen AquaPhenol (Appligene) (pH 4) und 1/2 Volumen Chloroform: Isoamylalkohol (24:1) bis Lysat. Vortex kräftig nach jedem Schritt undInkubation auf Eis für 10 min, Zentrifuge (20 min bei 10.000 g bei 4 ° C); ein gleiches Volumen von 70% EtOH zu wässrigen Phase, die.
4. Übertragen Mischung, um ein RNA-Spin-Säule (zB NucleoSpin RNA II von Macherey-Nagel) und führen On-Column-DNase-Verdauung und Waschschritte (folgen Sie dem Protokoll des Herstellers); eluieren RNA in 25 ul H ₂ O.
5. Für die DNA-Aufreinigung ein optimiertes Protokoll des Qiagen DNeasy Blut und Gewebe Kit verwendet wird. Äquilibrieren Lysat mit gleichen Volumina von Buffer AL und 100% EtOH, Last auf eine Spin-Säule zentrifugieren (1 min bei 10.000 g bei RT) und Durchfluss abschütten.
6. Fügen Sie 500 ul Buffer AW1, darunter 5 ul RNAse (1 mg / ml) zur Säule und Inkubation 10 min bei RT. Spin (1 min bei 10.000 g, RT) und Durchfluss abschütten.
7. Waschkolonne mit 500 ul Buffer AW2, Durchfluss-und Spin-trockenen leeren Spalte (1 min bei 15.000 g) zu verwerfen.
8. In vorgewärmte (70 ° C) Buffer AE und inkubieren Spalten für 10 min bei 70 ° C Eluieren durch Zentrifugation (1 min, 10.000 g), tragen Sie Flow-Through-und Zentrifugationsschritt wiederholen.

Verwenden Sie ein Spektralphotometer zur DNA-und RNA-Konzentrationen zu bestimmen. Ein typisches PVN Punsch Ausbeuten ~ 600 ng DNA und ~ 400 ng RNA. Für die Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR (qPCR), wir verwenden in der Regel ~ 100 ng RNA in die Reverse Transkription-Reaktion.

4. Bisulfit-Konvertierung

Natriumbisulfit wird verwendet, um nicht-methylierte Cytosine zu Uracile konvertieren. Im Gegensatz dazu sind methylierte Cytosine aus der Umwandlung geschützt. Daher stellen alle Cytosine, die in der endgültigen Sequenzierung des PCR-Amplikon Bisulfit erkannt werden methylierte Cytosine.

Bisulfit-Konvertierung verursacht erheblichen Abbau der DNA, die ein begrenzender Faktor sein können in PCR-Analyse. Optimierten Reaktionsbedingungen, die Cytosin-Konversion zu maximieren, DNA-Fragmentierung zu reduzieren und zu pflegen Einzelstrang-DNA auch bei niedrigeren Temperaturen kann erreicht werden durchQIAGENs EpiTect-Bisulfit-Kit. In unseren Händen ~ 200 ng DNA aus micropunches gereinigt eine ausreichende Menge an Ausgangsmaterial für die Bisulfit-Umsetzung.

Um die Unterschiede in der Effizienz der Umwandlung Reaktion zu verhindern, sollte die Menge der Ziel-DNA konstant gehalten werden bei allen Proben, die während eines Experiments verarbeitet. Darüber hinaus liest Sequenz sollte für Umwandlungseffizienz durch Untersuchen der Anzahl der nicht umgesetzten nicht CpGs geprüft werden. Dieser Satz sollte höchstens 98% betragen. Niedrigere Werte weisen auf unvollständige oder ineffizient Bisulfit-Konvertierung und die zugrunde liegenden Sequenzen sollten aus der Analyse ausgeschlossen werden.

5. Bisulfit-PCR

1. Design-Bisulfit-Sequenzierung Primer, die spezifisch für Bisulfit-konvertierter DNA (siehe Diskussion) sind; Methyl Primer Express-Software ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ De / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 & catid = 602121) wird diese Hilfe und helfen, optimale Annealing-Temperaturen in Pilotversuchen zu bestimmen.
2. Planen PCR-Master-Mix (für eine Reaktion) wie folgt:

   2,5 ul 10x PCR-Puffer
   0,5 ul 10 mM dNTPs
   1 ul 10 uM Vorwärtsprimer
   1 ul 10 uM Rückwärtsprimer
   0,125 ul Qiagen Hotstart Taq Plus-
   füllen bis zu 23 ul mit H ₂ O

3. In 2 pl Bisulfit-behandelter DNA, um eine Reaktion.
4. Amplify unter folgenden Bedingungen:

   1 Zyklus 6 min 95 ° C
   45-50 Zyklen von 1 min 95 ° C, 1 min bei optimale Glühtemperatur, 1 min 72 ° C
   1 Zyklus 5 min 72 ° C

Analysieren 7 ul PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese der Größe des Amplikons zu überprüfen und zu reinigen verbleibenden PCR-Reaktion für die anschließende Ligation unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen PCR Clean-up Kit (z. B. Macherey-NaGel NucleoSpin Extract). Bei zusätzlichen unerwünschten PCR-Produkte erhalten werden, wird Gelreinigung empfohlen.

6. Bisulfit-Sequenzierung

Hochauflösende DNA-Methylierungs-Profile von einzelnen Klon Lesungen ableiten lassen erkennen, kleine Veränderungen in der DNA-Methylierung und identifizieren regulatorischen Regionen, die auf eine Behandlung (Umwelt-Programmierung) sind. Die Bisulfit-Sequenzierung Verfahren umfasst drei aufeinander folgenden Arbeitsschritten. Erstens, werden PCR-Produkte durch PCR erhalten vor Bisulfit in einen Vektor ligiert und in Bakterien. Zweitens wird von Kolonie-PCR einzelne Klone eingesetzt, um die korrekte Größe des Einsatzes zu bestimmen. Drittens sind positive Kolonie PCRs aufgeräumt und unterzogen Big-Dye-Sequenzierung-Reaktion. Nach einer Reinigung Schritt werden die Produkte auf einem kapillaren Elektrophorese Sequenzer.

6,1 Ligation und Transformation

Hinweis: Wir verwenden routinemäßig den pGEM-T Vektor clenantrieb Kits (Promega). Unserer Erfahrung nach hängt die Klonierungseffizienz kritisch an dem Einsatz zu ligiert werden. Verschiedene Vektoren sollte getestet bei einer geringen Zahl von rekombinanten Klonen wiederholt erhalten werden.

1. Richten Sie Ligationsreaktion:

   5 ul 2x Ligationspuffer
   1 ul pGEM-T Vektor
   1 ul T4-Ligase
   3 ul-up gereinigt PCR-Produkt

2. Mischen Reaktion durch Pipettieren und Inkubation über Nacht bei 4 ° C

   Hinweis: Ligation kann auch für 1 h bei RT durchgeführt werden sowie. Um die Anzahl der rekombinanten Klone zu erhöhen, über Nacht Ligation bei 4 ° C ist bevorzugt.

3. Clean-up von Ligationsprodukte durch Ethanolfällung:
   1. Fügen Sie 1 ul Glycogen, 1 ul 3 M NaAc und 25 ul 100% EtOH auf die Ligationsreaktion und Niederschlag für 1 min in flüssigem Stickstoff.
   2. Zentrifuge (15,0000 g für 30 min bei 4 ° C) und Überstand verwerfen.
   3. Waschen mit 300 ul70% EtOH und dann zentrifugiert (15.000 g für 20 min bei 4 ° C), Überstand verwerfen und Pellet trocken bei RT (10 min).
   4. Pellet in 10 ul H ₂ O.

6,2 Transformation von Ligationsprodukte in elektrokompetente Bakterien

1. Vorkühlen Elektroporationsküvetten (1 mm breit) auf Eis und Tauwetter Aliquot elektrokompetente DH5a Bakterien auf Eis.
2. In 45 ul DH5a Bakterien zu 10 pl bis Ligationsprodukt gereinigt (siehe oben) und Transfer zum Küvette.
3. Verwandeln Bakterien bei 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF und fügen Sie 1 ml vorgewärmten SOB-Medium direkt nach dem Puls-Lieferung.
4. Recover Bakterien für 1 h bei 37 ° C, verteilt 100 ul Suspension auf LB / Ampicillin-Platten mit IPTG / X-Gal beschichtet.
5. Platten über Nacht bei 37 ° C

6,3 Kolonie-PCR

Hinweis: Kolonie-PCR aus einzelnen Klonen wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Einsätze sindder vorhergesagten Größe. Verzögerte Entwicklung von der Farbe blau / weiß-Screening, unerwünschte Rekombinationsereignisse während der Ligation, Einbau von oligomeren Primerpaare oder verkürzte PCR-Produkte kann sonst zu fehlerhaften Ergebnissen führen Sequenzierung. Wir verwenden routinemäßig T7-und SP6-Primer an klonierten Inserts zu verstärken; führt dieser Ansatz zusätzliche Vektorsequenzen von ca. 150 bp. T7-Primer wird in der Sequenzierreaktion in einem späteren Schritt verwendet.

1. Einrichten Kolonie-PCR-Reaktion in 96-Well-Platte. Für eine Reaktion zu verwenden:

   3 ul 2,5 mM MgCl ₂
   2,5 ul 10x Taq-Puffer
   1,5 ul 10 mM dNTP
   2 ul 2,5 mM Primer T7
   2 ul 2,5 mM SP6-Primer
   1 ul Fermentas Taq-Polymerase
   füllen bis zu 25 ul mit H ₂ O

2. Je 25 ul / Vertiefung Master-Mix in jedes Well einer 96-Well-Platte.
3. Pick-positiven (weiß) von Klon Platte mit Pipettenspitze und tauchen Sie ein in PCR-Reaktion.
4. Amplify mit folfolgenden Bedingungen:

   1 Zyklus 4 min bei 95 ° C
   10 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 56 ° C und 30 s bei 72 ° C
   30 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 48 ° C und 30 s bei 72 ° C
   1 Zyklus von 5 min bei 72 ° C

5. Laden 5 ul Kolonie-PCR auf einem Agarosegel und bestimmen Reaktionen, die das Recht Insert-Größe enthalten.
6. Kolonie PCRs mit den gewünschten Amplikons bis Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Macherey Nagel Nucleofast) gereinigt.

6,4 Big-Dye Terminator Reaktion und Sequenzierung

1. Und Master-Mix für Big-Dye-Reaktion. Für eine Reaktion zu verwenden:

   1 ul H ₂ O
   0,5 ul Big-Dye-Reagenz
   1,5 ul Sequenzierungspuffer

2. Dispense 3 ul / Vertiefung in jedes Well einer 96-Well-Platte, in jede Vertiefung hinzufügen 2 ul aufgeräumt Kolonie-PCR-Produkt und führen Reaktion auf einem Thermocycler mit folgenden Parametern:
   35 Zyklen von 10 s bei 96 ° C, 5 s bei 50 ° C und 4 Minuten bei 60 ° C
3. Der Big-Dye Reaktion wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Millipore Montage 96 Sequenzierung Clean-Up Kit) gereinigt und verarbeitet auf einem Kapillar-Sequenzer (zB ABI 3100 DNA).
4. Die Sequenzen werden mit Hilfe der Biq Analyzer ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) oder das Online-Tool BISMA ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) zur Ableitung der Methylierungsmuster der DNA-Region untersucht (Abbildung 4).

7. Repräsentative Ergebnisse

Um einen Einblick in den Einfluss von ELS auf der AVP Expression und Methylierung Status zu erhalten, wurden C57BL/6N Mäuse nach der oben beschriebenen Workflow verarbeitet. Kurz gesagt, war eine Gruppe von Mäusen C57BL/6N subjected zu ELS während die Kontrollgruppe wurde in Ruhe gelassen. Die PVN und der Nucleus supraopticus (SON) gestanzt und DNA und RNA isoliert wurden gleichzeitig aus den einzelnen Schläge. RNA wurde revers transkribiert und die Ebenen von AVP-Transkripte wurden durch qPCR Analyse und normiert auf die Expression von HPRT und GAPDH Housekeeping-Gene gemessen. DNA wurde Bisulfit behandelt, amplifiziert mit Primern, die spezifisch den AVP-Enhancer (4a) und der PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Mindestens 20 rekombinante Klone von jeder Maus / PCR wurden analysiert, um die Frequenzen für die Methylierung CpGs in der PCR-Amplikons (4b) enthalten bestimmen. Im Vergleich zu Kontrollen, ELS einen signifikanten Hypomethylierung bei CpG10, CpG12, CpG13 und Cpg14 der AVP-Enhancer (p <0,05, n = 6-8 Tiere) induziert darauf hindeutet, epigenetische Markierung dieser regulatorischen Region durch frühe Lebenserfahrungen. Im Gegensatz zu der PVN, Methylierungder AVP-Enhancer war unbeeinflusst von ELS im Sohn illustriert Gewebsspezifität epigenetische Markierung (Abbildung 4c). Die Analyse des DNA-Methylierungs-Status bei CpG10 und AVP-Genexpression in Kontrolltieren (n = 6) zeigte eine negative Korrelation, die auf eine Rolle der DNA-Methylierung in der Feinabstimmung der AVP-Genexpression (Abbildung 4d).

Abbildung 1. Micropunches werden aus sezierten Gehirne von Steuer-und im frühen betonte Mäusen erhalten. Nach DNA und RNA-Isolierung wird die Genexpression mittels qRT-PCR bestimmt, während Bisulfit behandelten DNA amplifiziert und gereinigt Produkte werden in einen geeigneten Vektor zur Identifizierung von rekombinanten Klonen von blau / Weiß-Selektion kloniert. Richtiger Einsatz Größen werden von geprüftenKolonie-PCR vor der Durchführung von Big-Dye Reaktions-und Bearbeitungszeiten auf einem Kapillar-Sequenzer. Methylierungsmuster werden visualisiert durch entsprechende Software-Tools. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. Timeline von DNA / RNA-Extraktion zur Bisulfit-Sequenzierung.

Abbildung 3. Workflow für die gleichzeitige Extraktion von DNA und RNA. Der Stempel des hypothalamischen Nucleus paraventricularis, einem winzigen Avp exprimierenden Hirnregion, wird in 400 ul GTA Puffer gelegt, gevortext, bis gestört und weiter homogenisiert, indem sie durch eine Spritze (29G). Das Homogenat wird dann für die Aufreinigung von RNA und DNA gespalten. Die Spaltung kann 1:1 sein oder aus unterschiedlichen Anteilen jevon der jeweiligen experimentellen Frage. Homogenate sollten innerhalb weniger Stunden verarbeitet werden.

Abbildung 4. CpG-Methylierung bei der AVP-Locus in 6 Wochen alt-Steuerung und ELS Tiere. (A) Schema der AVP und Oxytocin Gene orientiert Schwanz-Schwanz und getrennt von der Zwischengenregion (IGR). Exons sind durch offene (nummeriert) Boxen dargestellt. Die Verteilung von CpG-Reste angegeben wird und eine Größe und Position des jeweiligen PCR-Fragments mit CpG 10 bis CpG14 durch eine fette Linie markiert. (B) Methylierung der AVP-Enhancer im PVN in Steuer-und ELS Tiere (n = 6-8). (C) Methylierung der AVP-Enhancer an den Sohn in Steuer-und ELS Tiere (n = 8-10). (D) AVP-Genexpression wurde korreliertmit Methylierung an CpG10 (n = 6). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Discussion

Epigenetischen Programmierung wird zunehmend als wichtiger Mechanismus zugrunde liegen, Gesundheit und Krankheit anerkannt. Hier präsentieren wir eine verfeinerte Methode zur simultanen Isolierung von DNA und RNA aus micropunches und die nachfolgenden Schritte, um DNA-Methylierungs-Profile durch Bisulfit-Sequenzierung zu erhalten. Der optimierte Workflow ermöglicht eine bequeme Analyse der epigenetischen Programmierung im Gehirn als Reaktion auf Reize aus der Umwelt. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz für die Untersuchung von den funktionalen Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung und Genexpression sowohl aus derselben Probe analysiert. Schließlich kann der Tiernummer für das Experiment benötigten signifikant reduziert werden.

Bestimmte Vorsichtsmaßnahmen und Richtlinien zu befolgen, während Sie die Workflow vorgestellt werden. Angesichts der außerordentlichen Komplexität und Heterogenität des Gehirns und da-Methylierung und Expression kann in einem Zell-und Gewebe-spezifische Weise zu variieren ist es von größterwichtig, dass micropunching in einer standardisierten Art und Weise durchgeführt. Als Beispiel hierfür wird epigenetische Programmierung von AVP in der paravaventriuclar nachgewiesen, aber nicht im Nucleus supraopticus (4b-d), Expression zweier Avp Regionen des Hypothalamus ^4. In dieser Hinsicht ist die Verfügbarkeit von DNA und RNA aus der gleichen Gewebestanze vorteilhaft, da RNA Expression bestimmter Gewebe-spezifischen Markergene kann in einigen Fällen verwendet werden, zu bestätigen, dass der richtige Bereich gestanzt wurde. Obwohl micropunching zellulären Heterogenität reduzieren kann, ist zu bedenken, dass dieser Ansatz nicht auf die Isolierung einzelner Zelltypen oder Populationen führen kann. Zusätzliche Reinigung Schritte könnten erwogen werden, um dieses Thema anzugehen.

Für eine optimale Bisulfit-Sequenzierung Primer-Design für die PCR-Amplifikation folgenden Bisulfit-Behandlung ist unerlässlich. PCR-Produkte von mehr als 400 bp Länge kann problematisch sein, infolge des Abbaus von DNA durch bisulfite Behandlung. Es sollte auch beachtet werden, dass nested PCR kann verzerrten Ergebnissen führen, wenn nur noch wenige intakte Vorlagen zur Verstärkung beitragen. Primerpaare, die spezifisch für das modifizierte Amplikon sind gestaltet werden sollte, ihre Sequenzen sollten keine CpG-Dinukleotide, um Methylierung vorgespannte Verstärkung zu vermeiden. Darüber hinaus sollte Primer enthalten nicht-CpG Cytosine um die Amplifikation von nicht modifizierten oder nicht vollständig umgesetzte DNA zu verhindern. Verstärkung von einigen Vorlagen kann von der Durchführung von Hot-Start PCR profitieren. In jedem Fall sollte die Eignung von Primerpaaren in Pilot-Experimente verifiziert werden, so Verderb von wertvollen experimentellen Proben zu verhindern.

Bisulfit-Sequenzierung stellt eine Standardmethode für die ortsspezifische Methylierungsanalyse, wie es in der Lage, zuverlässig und präzise erkennen die Methylierung von CpG einzigen Rückstände in einer Allel-spezifischen Art und Weise ⁸ ist. Direkte Sequenzierung des PCR-Produkt wird nicht als gemischte Methylierung o empfohlenfa CpG Rest wird als C / T Doppel-Peak im Elektropherogramm, die Quantifizierung der Methylierung am betreffenden Standort kann verhindern, erscheinen. Aus diesem Grund eine Zwischenschicht Klonierung durchgeführt wird, und mehrere Klone sequenziert (~ 20-30), um das Ausmaß der Methylierung zu bestimmen. Pyrosequenzierung stellt eine alternative Methode zur Quantifizierung von DNA-Methylierung. Außerdem verwendet Bisulfitumwandlung und Bisulfit PCR sondern der Klonierung und Sequenzierung das Amplifikat, um eine direkte Reaktion, bei der Pyrosequenzierung der Methylierungsstatus einer CpG-Rest als C / T Einzel-Nukleotid-Polymorphismus, der leicht quantifiziert werden kann gelesen werden, unterzogen wird. Beide Methoden ermitteln ähnliches Ausmaß an Methylierung ^9, aber da das Klonen-Schritt kann übersprungen werden Pyrosequenzierung ist zeiteffizienter. In Abhängigkeit von der Vorlage nur 40 bis 100 Nukleotide auf einmal sequenziert werden, so dass mehrere Runden der Pyrosequenzierung mit unterschiedlichen Sequenzierprimer erforderlich sind. Dies ist eine kritische Begrenzung, da that höhere Mengen an DNA (ca. 1 pg pro Reaktion) benötigt, was absehbar über die Beträge zur Verfügung, von winzigen Hirngewebe Schläge. So anfängliche Abtasten der Regionen im Bereich von mehreren Kilobasen von Pyrosequenzierung scheint weniger geeignet als einzigen Klon Lesen. Dennoch sollte nach der Identifizierung von einem kleinen Bereich von Interesse Pyrosequenzierung betrachtet werden.

Insgesamt bietet der oben beschriebenen Protokoll eine genaue, effiziente und optimierte Ansatz für die schnelle und kostengünstige Analyse von Gehirn micropunches für epigenetische Veränderungen. Mehrere Proben können in einem einzigen Durchlauf verarbeitet werden und die Verfahren sind geeignet, wenn der Analyse von Proben von mittlerer Größe Experimenten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506
NucleoSpin RNA II	Macherey-Nagel	740.955,50
EpiTect Bisulfite Kit	Qiagen	59104
NucleoSpin Extract	Macherey-Nagel	740.609,50
pGEM-T Vector Cloning Kit	Promega	A3600
Nucleofast 96	Macherey-Nagel	743.100,50
Montage 96 Sequencing Clean-Up	Millipore	LSK09624
HotStar Taq-Polymerase	Qiagen	203203
Taq-Polymerase	Fermentas	EP0401