Die α-Test: Rapid Zellfreie CD4-Zählung mit ganzen Speichel

Zusammenfassung

Eine Aufzählung CD4-Methode, die α-Test, beschrieben, nutzt ganzen Speichel auf eine schnelle und genaue CD4-Werten geben. Die α-Test kostet Pfennige und eliminiert die Notwendigkeit für technische Schulungen, teure Reagenzien wie monoklonale Antikörper, Mess-, Kälte-, Transport der Proben, sowie Sammlung und Handhabung von Blut.

Zusammenfassung

Es besteht ein dringender Bedarf an erschwinglichen CD4-Enumeration, um HIV-Erkrankung zu überwachen. CD4-Zählung ist außerhalb der Reichweite in Regionen mit begrenzten Ressourcen aufgrund der Zeit und Temperatur Einschränkungen, technische Raffinesse, und die Kosten für Reagenzien, insbesondere monoklonale Antikörper gegen CD4 auf Blutzellen, die einzige derzeit akzeptable Methode zu messen. Eine häufig verwendete kostengünstige und zeitsparende Labor Strategie ist es, zu berechnen, anstatt Maßnahme bestimmte Blutwerte. Zum Beispiel werden LDL-Spiegel unter Verwendung der gemessenen Werte von Gesamtcholesterin, HDL und Triglyceride ^1. Somit zählt Identifizierung von zellfreien korreliert, die direkt regulieren die Anzahl der CD4 ⁺ T-Zellen konnte eine genaue Methode zur Berechnung CD4 bereitzustellen aufgrund der physiologischen Bedeutung der korreliert.

Die Anzahl der Stammzellen, die Blut eintreten und bestimmt zu werden zirkulierender CD4 ⁺ T-Zellen wird durch das Chemokin CXCL12 einer bestimmtennd seinen Rezeptor CXCR4 durch ihren Einfluss auf die Fortbewegung ^2. Verfahren nach Stammzellen Bewegung in Blut wird zusätzlich durch Zelloberfläche menschliche Leukozyten-Elastase (HLE _CS) und dem HLE _CS-reaktiven aktiven α _{1-Proteinase-Inhibitor} (α ₁ PI, α _{1-Antitrypsin,} SERPINA1) ³ geregelt. In HIV-1-Erkrankung, ist α ₁ PI inaktiviert durch Krankheitsprozesse ^4. In den frühen Gruppen von asymptomatischen HIV-1 Erkrankung, wurde die aktive α ₁ PI zufolge unter werden in 100% der unbehandelten HIV-1-Patienten (M = 12 pM, und ein normales während der symptomatischen Kategorien ^{4, 5 zu} erreichen normal. Diese Muster hat Immunsystem Inaktivierung zugeschrieben, nicht ausreichend Synthese proteolytischen Inaktivierung oder Sauerstoff. Wir beobachteten, dass bei HIV-1-Patienten mit> 220 CD4-Zellen / ul, CD4-Zahlen mit Serum Spiegel der aktiven α ₁ PI korreliert (r ² = 0,93, p < 0,0001, n = 26) und inaktive α ₁ PI (r ² = 0,91, p <0,0001, n = 26) ^5. Die Verabreichung von α ₁ PI, um HIV-1 infizierten und nicht infizierten Probanden führte zu dramatischen Anstieg der CD4-Zellzahl darauf hindeutet, α ₁ PI beteiligt an der Regulation der Anzahl der CD4 ⁺ T-Zellen im Blut ^3.

Mit Stimulation, enthält ganze Speichel ausreichend seröse Exsudat (Plasma, das verbleibende Material, das durch Wände der Blutgefäße in den Speichel übergeht), damit die Messung von aktiven α ₁ PI und die Korrelation dieser Messung gibt Hinweise, dass es eine genaue Methode zur Berechnung der CD4-Zellzahl ist. Kurz gesagt, stimulieren sialogogues wie Kaugummi oder Zitronensäure die Exsudation von Serum in ganzen Mund Speichel. Nach Stimulation Serum Exsudation, wird die Aktivität von Serum α ₁ PI im Speichel durch seine Fähigkeit, Elastase-Aktivität zu hemmen gemessen. Schweine-Pankreas-Elastase (PPE)ist ein leicht verfügbares preiswerten Quelle für Elastase. PPE bindet an α ₁ PI Bilden einer eins-zu-eins-Komplex, der verhindert, PPE Abspaltung ihrer spezifischen Substraten, von denen die kolorimetrische Peptid ist, Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-Nitroanilid (SA ³ NA). Inkubation von Speichel mit einer sättigenden Konzentration von PSA für 10 Minuten bei Raumtemperatur ermöglicht die Bindung von PSA an alle aktiven α ₁ PI im Speichel. Die daraus resultierende Hemmung der PSA, die unter aktiver α ₁ PI kann durch Zugabe des PSA-Substrat SA ³ NA. (Abbildung 1) gemessen werden. Obwohl CD4 in Bezug auf das Blutvolumen (CD4-Zellen / ul) gemessen werden, wird die Konzentration an α ₁ PI im Speichel zu der Konzentration von Serum im Speichel und nicht die für die Menge der Speichel da das Volumen beträchtlich variieren während des Tages und Person bis ⁶ Personen. Es ist praktisch das gesamte Protein im Speichel durch Serumgehalt, und das Protein von Speichel wird gemesversicherbar ^7. Somit wird aktiven α ₁ PI im Speichel im Verhältnis zum Speichel Proteingehalt berechnet und wird als α ₁ PI-Index. Hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die α ₁ PI-Index eine genaue und präzise physiologische Verfahren zur Berechnung CD4 bietet.

Protokoll

1. Bereiten Sie frische Arbeitskopie Lösungen

1. TBS: 0,05 M Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,8 (TBS). Bereiten Sie 60 ml TBS / Mikroplatten.
2. PSA: Schweine-Pankreas-Elastase, Typ 1 (PSA) wird als Suspension zur Verfügung gestellt. Gut schütteln und verdünnen PSA in TBS auf etwa 0,01 U / ml. Bereiten Sie 6 ml Arbeitslösung / Mikroplatten).
3. SA ³ NA: Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA ³ NA). Bereiten 0,1 M Lager SA ³ NA Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) und sofort verwenden oder bei -20 ° C lagern Bereiten 6ml Arbeitslösung / Mikrotiterplatten durch Verdünnung Lager SA ³ NA-Lösung 1/100 in TBS.
4. Coomassie-Blau: Bereiten Sie eine Stammlösung von 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie-Blau) in TBS und sofort verwenden oder bei -20 ° C. Bereiten Sie 6 ml Arbeitslösung durch Verdünnen Stammlösung 1/1000 in TBS.

2. Bereiten Saliva

1. Speichelsammelsystem: im Stehen, stimulieren Serum Exsudation in Speichel, indem Sie einen sialogogue wie Zitronensäure oder Kaugummi im Mund. Eine zuckerfreie Zitronen-Tropfen ist praktisch für HIV-1-Patienten, die häufig zahnlosen und nicht in der Lage, Kaugummi zu kauen sind. Schlucken, weil für die ersten 3 min benötigt, und sammeln ganzen Mund Speichel in einem verschlossenen Becher für die nächsten 3 min. Dies wird etwa 2 ml Speichel. Verwenden Sie sofort oder bei -80 ° C lagern
2. SPEICHEL HANDHABUNG: Wenn gefroren, auftauen Probe bei 37 ° C und auf Eis stellen. Bewahren Sie frische oder aufgetaute Probe bei 2-4 ° C nicht mehr als 3 Tage. Nicht vortexen und Speichel zu vermeiden Pipettieren Mucin, das kein Serum Exsudat enthält. Verwenden Sie Standard-Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Speichel http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

3. Mikroplatten Set-up

1. BUFFER: Die Messungen werden in dreifacher Ausführung durchgeführt. In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte wird 130 ul TBS aufgenommen.
2. EXEMPLARE: Zu jedem Test gut, wird 20 ul Speichel für ein Endvolumen von 150 ul / Vertiefung zugegeben. Durch Pipettieren gründlich mischen, ohne dabei Blasen.
3. STEUERUNG: Die positive Kontrolle enthält PPE, aber kein Speichel. Die negative Kontrolle enthält Speichel, aber kein PPE.To die positive Kontrolle ist gut 20 ul TBS aufgenommen. Um die negative Kontrolle wird 20 ul Speichel aufgenommen.
4. PSA Inkubation: Schütteln Sie PSA gut funktionierende Lösung. Dann werden 50 ul PSA arbeiten Lösung in jede Vertiefung mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefungen. Um den negativen Kontrollvertiefungen, fügen Sie 50 ul TBS. Inkubieren 10 min bei 23 ° C
5. SUBSTRATINKUBATION: Je 50 ul SA ³ NA funktionierende Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren 45 min bei 23 ° C
6. Coomassie-Blau:. Dann werden 50 ul Coomassie Blue Arbeitslösung
7. Read-Out: Extinktion in Mikroplatten-Reader, A _{405 nm} bis SA ³ NA-Spaltung die aktive α ₁ PI und A _{595 nm} bis Coomassie Blue, die Eiweißgehalt darstellt erkennen repräsentiert zu erkennen.

4. Berechnen Sie α ₁ PI Index

1. Normalisieren der Durchschnitt eine _{405 nm} und einer _{595 nm:} Für jeden dreifacher Ausfertigung, berechnen Sie den Durchschnitt. Subtrahieren Sie die Negativ Kontrolle Durchschnitt von der Probe Durchschnitt. Um von Platte zu Platte Variation zu minimieren, normalisieren die Durchschnitte, indem jede Probe durchschnittlich durch die positive Kontrolle im Durchschnitt wie folgt:
   

2. BERECHNEN α ₁ PI INEX: Teilen Sie den normalisierten A _{405 nm} durch den normierten A _{595 nm:}
   

5. Repräsentative Ergebnisse

Um festzustellen, ob die α-Test geeignet sein könnten für die Verwendung als ein Point-of-care-Screening-Test CD4-Zellzahlen in endemischen, mit begrenzten Ressourcen zu überwachen, um Regionen, wurde angeregt Speichel aus 20 weiblichen und 11 männlichen gesammelt HIV-1 Patienten betreuende Klinik für Routineversorgung in Kamerun. In Übereinstimmung mit vorläufigen Beobachtungen während der Entwicklung des α-Test unter Verwendung von Speichel in New York City gesammelt, das α ₁ PI Index im Speichel in Kamerun mit CD4-Zellzahlen (r ² = 0,91, p <0,0001. N = 31) korreliert gesammelt. Die Beziehung war von einem 3-Parameter-förmigen Kurve, die im Einklang mit einer Dosis-Wirkungs-Beziehung (Abbildung 2A) ist definiert. Die 95%-Vertrauensbereich und Vorhersage-Intervalle sind mit blauen und roten Linien (Abbildung 2B) dargestellt.

InEine frühere Studie haben wir festgestellt, dass CD4 ⁺ T-Zellen sinusförmige Periodizität Radfahren mit 23 ± 3,5 Tage in der HIV-1 Patienten und bei Patienten mit der vererbten Version von α ₁ PI-Mangel (PiZZ) ³ aufweisen. Abgebildet sind, ist ein repräsentatives Beispiel von Computer-generierten Sinuskurve Analyse der CD4 Radfahren in einer nicht-HIV-1-gesunden Kontrollgruppe zeigt 27 Tage Periodizität (Abbildung 3A).

Computer-generierte Sinuskurve Analyse der CD4 ⁺ T-Zell-Veränderungen in 6 Fächer ergaben Werte für Spitze-Spitze-Amplitude und Schwenkachse ^3. Wie erwartet, wurde die Achse der Schwingung mit der Amplitude (r ² = 0,96, p = 0,009, n = 6) (3B) korreliert. Bei Patienten werden niedrige ^{CD4-T-Zellzahlen} waren die zyklischen Veränderungen der CD4-T-Zellzahl klein, und bei Patienten mit hoher CD4 ⁺ T-Zellzahl, waren zyklische Veränderungen groß.

Da dieRegressionslinie in Abbildung 2 dargestellt schätzt die Schwingungsachse und die Achse der Schwingung mit der Amplitude korreliert die Amplitude für die Regressionslinie dadurch Abschätzen, wie weit oberhalb und unterhalb der Regressionslinie CD4 ⁺ T-Zellen zu erwarten würde, kann berechnet werden, um variieren aufgrund Radfahren (3C). Die Überlagerung der Amplitude in 3C und das Konfidenzintervall in 2B berechnet berechnet wurde festgestellt, dass Amplitude (grüne Linie) innerhalb des 95% liegt das Konfidenzintervall (blaue Linie) (3D).

Abbildung 1. Zusammenfassung Vorgehensweise: Legen Sie Zitronensäure in den Mund und Speichel zu sammeln. In verdünnten Speichel zu Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in dreifacher Ausfertigung. Fügen PSA in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 15 min bei 23 ° C. Fügen Sie den PSA-Substrat in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 45 min bei 23 ° C. In Coomassie-Blau und bei 405 nm auf PSA Aktivität zu detektieren und bei 595 nm bis Proteins nachzuweisen.

Abbildung 2. Vergleich der α-Test mit dem Standard-CD4-Zählweise. A) Die α-Test wurde durch die Quantifizierung der α ₁ PI Index in stimulierten ganzen Mund Speichel durchgeführt. CD4-Zahlen wurden von einem unabhängigen medizinischen Labor mit Hilfe der Durchflusszytometrie durchgeführt. Blut für die Durchflusszytometrie und Speichel wurden in derselben Klinik Besuch gesammelt. Die Beziehung zwischen der α ₁ PI-Index und CD4-Zellzahl wurde durch eine 3-Parameter-förmigen Kurve (r ² = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) Die 95%-Vertrauensbereich und Vorhersage-Intervalle werden in blau und rot dargestellt definiert Linien angezeigt sind.

Abbildung 3. Die Genauigkeit der Berechnung CD4 counts mit dem α1PI Index.A) CD4 ⁺ T-Zellen zeigten eine sinusförmige Radfahren mit 27 Tage Periodizität in einer nicht-HIV-1-gesunden Kontrollgruppe. Die Schwenkachse ist gezeigt (rot gepunktete Linie). B) Computer festgelegt Sinuswelle Analyse von CD4-T-Zellzyklus verwendet werden, um den Spitze-Spitze-Amplitude und der Achse der Schwingung in 4 HIV-1-Patienten berechnet wurde, ein nicht-HIV -1 Pizz unterliegen, und die Nicht-HIV-1 gesunden Kontrollpersonen in Teil A. schilderte die Beziehung zwischen CD4-T-Zelle ⁺ Amplitude und Drehachse des Pendels wurde durch 3-Parameter-förmigen Kurve (r ² = 0,96, p = 0,009, n definiert = 6). C) Die sigmoide Beziehung zwischen Amplitude und Drehachse des Pendels in Teil B) abgeleitet wurde benutzt, um die erwartete Amplitude (grüne Linien) der Punkte entlang der Regressionsgeraden (schwarze Linie) aus Abbildung 2 zu berechnen. d) die erwartete Amplitude Intervall (grüne Linien) unterschied sich signifikant von dem 95%-Konfidenzintervall (blaue Linien) wie von der Mann-Whitney-Rangsummentest (basierend auf einem Vergleich des mittleren Differenz zwischen dem 95%-Konfidenzintervall und Regressionsgerade (63 Zellen / ul) und die mediane Differenz zwischen der Amplitude Linie und Regressionsgerade (37 Zellen bestimmt / ul); p = 0,001).

Diskussion

Unverdünntes Serum enthält Median 36 um α ₁ PI und 3,6 um α ₂ Makroglobulin (α ₂ M) ein 10-facher Unterschied ^8. Beide Proteine ​​um die Bindung an PSA. Diese beiden Eigenschaften, Konzentration und PPE Affinität, wurden genutzt, um ein Verfahren, das imstande ist, spezifisch Messen α ₁ PI in normalem Serum in Gegenwart von konkurrierenden α ₂ M ⁸ zu entwickeln. Diese Methode kann so wenig wie 50 nM μ ₁ PI in 0,3% Serum zu detektiere...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Sialogogue, 0,05 M Zitronensäure	Edas Zuckerfreie Bonbons, 4900 Hintere N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon Drops
Schweine-Pankreas-Elastase, Typ 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Gewebekultur-behandelt, 96 Well Mikrotiterplatten	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Mikroplatten-Reader mit Filtern für 405 nm und 595 nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277