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Umfangreiche Forschungen haben genügend Beweise darauf hindeutet, dass Proteinfaltung in der Zelle ein Co-translationalen Prozess 5.1 ist vorgesehen. Allerdings ist der genaue Weg, dass Polypeptidkette folgt während der Co-translationale Faltung seiner funktionellen Form zu erreichen immer noch ein Rätsel. Um diesen Prozess zu verstehen und zu den genauen Konformation der cotranslationale Faltungsintermediate bestimmen, ist es wichtig, Techniken, die die Isolierung von RNCs Durchführung naszierenden Ketten von vorgegebenen Größen, um ihre weitere strukturelle Analyse zu ermöglichen erlauben zu entwickeln.
SecM (Sekretion Monitor) ist ein 170 Aminosäuren E. coli-Protein, das die Expression des stromabwärtigen SecA (Sekretion Fahren) ATPase in der secM-Operon secA 6 regelt. Nakatogawa und Ito ursprünglich gefunden, dass ein 17 Aminosäuren lange Sequenz (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) in der C-terminalen Bereich des Proteins SecM ausreichend und notwendig ist,verursachen Abwürgen des SECM Dehnung bei Gly165, wodurch Peptidyl-Glycyl-tRNA stabil an der ribosomalen P-Stelle 9.7 gebunden. Noch wichtiger ist, wurde festgestellt, dass diese 17 Aminosäure langen Sequenz zu der C-Terminus von praktisch jedem voller Länge und / oder verkürzte Protein wodurch die Produktion von RNCs Durchführung naszierenden Ketten von vorbestimmten Größen 7 verschmolzen werden können. Somit, wenn es geschmolzen oder in der Ziel-Protein insertiert, produziert SecM Abwürgen Sequenz Verhaftung der Polypeptidkette Dehnung und erzeugt eine stabile RNCs sowohl in vivo in E. coli-Zellen und in vitro in einem zellfreien System. Saccharosegradientenzentrifugation wird weiter genutzt werden, um RNCs zu isolieren.
Die isolierten RNCs kann zur strukturellen und funktionellen Merkmale der Co-translationale Faltungsintermediate zu analysieren. Kürzlich wurde diese Technik erfolgreich eingesetzt, um Einblicke in die Struktur von mehreren Ribosomen gebundenen naszierenden Ketten 10,11 gewinnen. Hier beschreiben wir die Isolierung von Rinder-Gamma-B Crystallin RNCs zu SecM verschmolzen und erzeugt in einem in vitro Translation System.