Methodenartikel

A Human Eileiter Modell zur Untersuchung der

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DOI:

10.3791/4036

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11. August 2012

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Ex-vivo-Infektion Modell zur Visualisierung von direkten Interaktionen von bakteriellen Erregern mit menschlichen Eileiter Zellen. Die ganze Organgewebe Modell wurde gegründet, um zu untersuchen C trachomatis Induzierten Pathologie der weiblichen Eileiter unter "lebensechte" Bedingungen.

Zusammenfassung

Genitale Infektionen mit Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) sind die häufigste sexuell übertragene Krankheit bei Frauen weltweit. Ineffiziente Clearance oder Persistenz der Erreger können zu aufsteigenden Infektionen der oberen Genitaltrakt und sollen chronisch entzündliche Schäden an infizierten Geweben verursachen 1,2 führen. Als Folge können schwere klinische Folgen wie Adnexitis (PID), Eileiter und Unfruchtbarkeit auftreten 3,4.

Ein Großteil der Forschung mit C. trachomatis in Epithelzelllinien (z. B. HEp-2 Zellen und HeLa-229) oder an Mäusen durchgeführt. Wie bei Zellkultur-Modelle, während sie weder die Physiologie von nativem Gewebe noch die Pathophysiologie von C. trachomatis Genitaltrakt Infektionen in vivo 5. Weitere Einschränkungen sind durch die Tatsache gegeben, dass zentrale Signalkaskaden (zB IFN-γ mediated JAK / STAT-Signalweg), die intrazellulären Chlamydien-Wachstum zu kontrollieren grundsätzlich zwischen Mäusen und Menschen 6,7 unterscheiden. Wir und andere daher ein ganzes Organ Eileiter Modell, um direkte Interaktionen zwischen C untersuchen trachomatis und menschlichen Eileiter Zellen ex vivo 8,9.

Zu diesem Zweck wurden humane Eileiter von Frauen, die sich Hysterektomie gesammelt und mit C infiziert trachomatis Serovar D. Innerhalb von 24 h nach Infektion, Probe analysiert, wo mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) auf Chlamydia trachomatis erkennen vermittelt epithelialen Schäden sowie C. trachomatis Einbeziehung Bildung im Eileiter Gewebe.

Protokoll

1. Vorbereitung von Chlamydia trachomatis Serovar D Lager

  1. Infect konfluente 175 cm 2 Zellkulturflasche mit HeLa-229 Zellen mit 4 ml C trachomatis D in SPG-Puffer.
  2. Inkubieren Sie für 1 Stunde bei 37 ° C während ständigem Schütteln.
  3. 20 ml DMEM mit 10% FCS und 240 ul Cycloheximid.
  4. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator für 48 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
  5. 5 ml steriler Glasperlen, starkes Schütteln zu lösen und zu zerstören C. trachomatis beherbergen HeLa-229 Zellen.
  6. Sammle Überstand und fügen Sie eine weitere 5 ml steriler Glasperlen.
  7. Felsen dreimal für 1 min, alles zu zerstören HeLa-229 Zellen und Freisetzung C. trachomatis.
  8. Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPMI und 4 ° C zu beseitigen Zelltrümmer.
  9. Die überstehende Flüssigkeit für die Infektion von 8 bis 10 175 cm 2 Zellkulturflaschen konfluent grown mit HeLa 229-Zellen.
  10. Inkubieren Sie jede Flasche mit 4 ml SPG-Puffer und 4 ml Überstand aus früheren Infektionen für eine Stunde bei 37 ° C unter ständigem Schütteln.
  11. Nach einer Stunde mit 15 ml DMEM mit 10% FCS und 230 ul Cycloheximid nach 48 h Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 an.
  12. 5 ml steriler Glasperlen, schütteln zu lösen und zu zerstören C. trachomatis beherbergen HeLa-229 Zellen.
  13. Sammeln Sie den Überstand und fügen Sie eine weitere 5 ml steriler Glasperlen.
  14. Felsen dreimal für 1 min, alles zu zerstören HeLa-229 Zellen und Freisetzung C. trachomatis.
  15. Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPMI bei 4 ° C zu beseitigen Zelltrümmer.
  16. Die überstehende Flüssigkeit.
  17. Füllen Sie 40 ml Überstand in 50 ml Falcon-Röhrchen, Zentrifuge für 99 min mit 11000 RPMI.
  18. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und Waschen des Pellets mit 1 ml SPG-Puffer.
  19. Homogenisieren derPellet in 1 ml SPG und 20 ul Aliquot in einem 1, 5 ml Eppendorf-Röhrchen, Lagerung bei -70 ° C bis zur Verwendung. Biologische Aktivität der hergestellten Stammlösung wurde in einem etablierten HeLa-229 Zellinfektion Modell bestätigt.

2. Preparation of Human Eileiter

  1. Shop menschlichen Eileiter (HFT) von Frauen, die sich einer Hysterektomie unmittelbar nach der Operation in RPMI mit 5% FCS ohne Antibiotika in 4 ° C bis Vorbereitung. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Universität zu Lübeck (09-153) genehmigt. Frauen in die Studie eingeschlossen (Alter 34 bis 53) hatte keine Geschichte vor C. trachomatis-Infektion. Gewebe der Eileiter wurde auf peripartalen Sterilisation auf Wunsch der Mutter während der Kaiserschnitte oder während Hysterektomien wegen symptomatischer Uterusmyome in der Lutealphase gesammelt. Alle HFT wurden negativ getestet C. trachomatis durch PCR.
  2. Präparieren Sie die HFT in eine Petrischale mit RPMI mit5% FCS ohne Antibiotika. Während der gesamten Bearbeitung des Gewebes sollte in Medien ein Austrocknen zu verhindern untergetaucht werden.
  3. Abgeschnitten und entsorgen Bindegewebe und Gewebe während der Operation zerstört.
  4. Nach Dissektion öffnen Sie die HFT vorsichtig mit einem kleinen Skalpell.
  5. Weitere Experimente vorzubereiten Gewebestücke in der Größe von 0,5 cm x 0,5 cm bis 1 cm × 1 cm.
  6. Zur Infektion Shop HFT Probe in 1 ml RPMI mit 5% FCS ohne Antibiotika. HFT Proben wurden mit 5.5x10 5 IFU (inclusion forming units) von C infiziert trachomatis.
  7. Inkubieren HFT Muster in 37 ° C, 5% CO 2 und 21% O 2 als auch in 37 ° C, 5% CO 2 und 2% O 2 für 24 Stunden.
  8. Nach Inkubationszeit die Probe entnehmen und lagern in Monti Fixativ für mindestens drei Tage bei 4 ° C bis SEM / TEM Vorbereitung.

3. Vorbereitung der Proben für TEM-HFT

  1. FürTEM entfernen Probe aus Montis Fixiermittel und geschnitten 2 x 2 mm bis 4 x 5 mm große Stücke. Der verbleibende Gewebe für SEM verwendet werden.
  2. Waschen Stücke mit Natriumcacodylatpuffer, pH 7,35 für 1 h.
  3. Inkubieren in 1% (w / v) Osmiumtetroxid in Aqua dest. über Nacht.
  4. Entfernen Sie überschüssiges Osmiumtetroxid durch Waschen 6x5 min in Natriumcacodylatpuffer, pH 7,35.
  5. Entfernen Wasser durch Inkubation in steigenden Konzentrationen von Ethanol in Wasser (v / v) (30% für 2 h, 40% für 2 h, 50% für 2 h, 60% für 2 h, 70% über Nacht, 80% für 2 h, 90% für 1 h, 95% für 1 h, 100% für 1 h.
  6. Auswaschen Ethanol für 2 x 15 min in Propylenoxid und anschließend zu einer Mischung von 50% (v / v) frisch hergestellt Araldit (einschließlich aller Komponenten) in Propylencarbonat übertragen und über Nacht inkubieren.
  7. Transfer zum frisch zubereiteten Araldite (einschließlich aller Komponenten) für mindestens 1 h.
  8. Transfer zum flachen Einbettformen und füllen mit Araldite.
  9. Lassen Araldite aushärtenmindestens 48 h bei 60 ° C
  10. Nach dem Trimmen von Embedded-Probe geschnitten halb Dünnschliffen (700 nm) auf einem Ultramikrotom Verwendung von Glas-Messer oder eine Histo Diamantmesser und Flecken mit Richardson-Färbung.
  11. Schneiden Sie ultra-dünne Schnitte (ca. 70 nm) mit Hilfe einer Diamant-Messer und Transfer zum Kupfer-Grids (zB 150 quadratischen Maschen).
  12. Stain ultradünne Schnitte mit 0,5% (w / v) Uranylacetat in Aqua dest. gefolgt von 3% (w / v) Bleicitrat in Aqua dest. in einem automatischen Abschnitt Stainer. Alternativ können Abschnitte manuell durch Verlassen Grids 15 min auf einem gesättigten zentrifugierten Lösung von Uranylacetat in Aqua dest gefärbt werden. gefolgt von 0,3% Bleicitrat (w / v) in Aqua dest.

4. Vorbereitung der Probe HFT für SEM

  1. Für SEM entfernen Probe von Monti Fixativ, orientieren mit Epithel nach oben auf einem 1,5 x 1 cm Korkplatte und fixieren Position mit Insekten-Nadeln.
  2. Übertragen Probe auf Kork zu geeigneten Metall und KörbeWaschen für 30 Minuten in Natriumcacodylat, pH 7,35.
  3. Entfernen Wasser durch Inkubieren Muster in steigender Konzentration von Aceton / Wasser-Mischungen (v / v) 30% für 6 h, 40% für 6 h, 60% für 8 h, 70% über Nacht, 80% für 2 h, 90% für 2 h und 100% über Nacht (äußerst vorsichtig sein, damit Probe kontinuierlich unter Wasser).
  4. Transfer zum frischen 100% Aceton und trockenen Probe durch kritische Punkt-Trocknung (Temperatur 40 ° C, Druck 80 bar).
  5. Entfernen Sie Nadeln, Kork und Leim Probe mit dem Epithel nach oben auf SEM Probenhalter mit einem leitfähigen Kohlenstoff Registerkarte mit leitfähigem Kohlenstoff Zement ausgestattet. Verwenden Sie flüssiges Leitsilber, um die Leitfähigkeit zwischen der Halterung und dem leitfähigen Kohlenstoff-Register zu verbessern.
  6. Bereiten Sie eine leitende Platin, Gold oder Palladium-Beschichtung der Probe mit einem Sputtergerät.

5. Die Färbung der Semi Dünnschliffen mit Richardson-Färbung

  1. Lassen halb dünne Schnitte auf dem Objektträger trocken.
  2. Stain Abschnitte mit Färbelösung bei 60 ° C für 1-2 min.
  3. Waschen in Aqua dest.
  4. Trockene Abschnitte und Deckglas.

6. Repräsentative Ergebnisse

Innerhalb des menschlichen Eileiter Infektionsmodell konnten wir Unterschiede in der epitheliale Morphologie zwischen den nicht-infizierten Kontrollen (Abbildung 1) und dem C visualisieren trachomatis - infizierten Röhren (Abbildung 2) unter normoxischen Zustand. Charakteristische morphologische Unterschiede impliziert Pathogen-induzierte Schwellung und Lyse der Eileiter Epithelzellen, die nicht in nicht-infizierten Kontrollen nachgewiesen werden konnte. Mit halb dünne Schnitte und Transmissions-Elektronenmikroskopie konnten wir nachweisen intrazellulären C trachomatis Einbeziehung Bildung in der ex vivo infiziert menschlichen Eileiter Gewebe (Abbildung 3, 5), aber nicht in nicht-infizierten Kontrollen (Abbildung 4). Als Sauerstoff-Konzentrationgen in den weiblichen Genitaltrakt sind bereits unter physiologischen Bedingungen 11, und weiteren Rückgang gering während eines entzündlichen Prozesses untersuchten wir auch unser Modell unter hypoxischen Bedingungen. Vorläufige Ergebnisse zeigen, das Modell ist nützlich, um Chlamydien-Wachstum und die Nachkommen unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen zu analysieren. Chlamydien-induzierten Epithelzellschädigung muss von Artefakten, die durch unvorsichtige Handhabung der Zubereitung und der Eileiter vor der Infektion (Abbildung 6) vermittelt werden, getrennt werden.

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Abbildung 1. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) eines nicht-infizierten menschlichen Eileiter nach einem Tag Inkubation in Medium-Steuerung (grüner Pfeil zeigt bewimperte Zelle, blauer Pfeil zeigen nicht-bewimperte Zelle).

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Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopie Kopie (SEM) von einem Ex-vivo C. trachomatis infiziert menschlichen Eileiter 1 Tag nach der Infektion (weißer Pfeil rupturierten Inklusion).

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Abbildung 3. Semi Dünnschliffe zeigen typische intrazelluläre Einschlüsse (weiße Pfeile) 1d nach der Infektion des menschlichen Eileiter mit C. trachomatis ex vivo.

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4. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) aus einem nicht-infizierten menschlichen Eileiter nach einem Tag Inkubation in Kontrollmedium.

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Abbildung 5. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von einem Ex-vivo C. trachomatis infiziert menschlichen Eileiter 1 Tag nach der Infektion (weiße Pfeile markieren Chlamydien-Einschlüsse).

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Abbildung 6. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) der Eileiter Epithel durch unvorsichtige Herstellung und Handhabung der Proben (weiße Pfeile markieren zerstört Epithelgewebe) beschädigt.

Diskussion

Visualisierung von Pathogen-induzierte Schädigung des infizierten Gewebes ist mühsam und oft beschränkt auf experimentelle Verfahren bei Mäusen. Wir gründeten eine ex-vivo Modell Infektion im menschlichen Eileiter zu analysieren C. trachomatis-Infektionen des oberen weiblichen Genitaltrakt. Durch die Verwendung dieses Verfahrens konnten wir C visualisieren trachomatis - induzierte Schäden an der menschlichen Eileiter Epithel innerhalb eines Tages nach der Infektion. Cellular Schwellung und Lyse waren typisch für morphologische Veränderungen, die in C beobachtet wurden, trachomatis - infizierten Eileiter, aber nicht in nicht-infizierten Kontrollen. TEM-Analysen zeigten, dass Chlamydien einen typischen intrazellulären Entwicklungszyklus implementieren innerhalb infizierten Geweben, welche große Einschlüsse mit Re-differenzierte elementaren Körper, sondern auch kleinere Einschlüsse mit erweiterten Retikularkörper, die Persistenz hinweisen könnten. Allerdings ist die morphologische Bild allein nicht ausreichen, um zwischen repl diskriminierenicating und persistierende Infektionen, die durch reduzierte Stoffwechsel charakterisiert sind und eine erhöhte Resistenz gegen antimikrobielle Substanzen 10.

Die Zerstörung des Epithels in infizierten Eileiter ist entweder infolge der Unterbrechung des C. trachomatis - infizierten Epithelzellen nach Abschluss der intrazellulären Entwicklungszyklus und Freisetzung infektiöser elementaren Körper oder die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen 8. Pathogen Gewebeschädigung und Host-induzierte Immunreaktionen gegen C. trachomatis sollen die wichtigsten Faktoren, die zu einem Verlust von epithelialen Zell-Funktion, Fibroblasten-Umbau und schließlich Eileiterunfruchtbarkeit in vivo 8,11 sein.

Eine der wichtigsten Grenzen dieses Modells ist die Abwesenheit von Entzündungszellen, die die Analyse der sekundären Effekte behindert auf die ursprüngliche C. trachomatis-Infektion der Eileiter Epithel. Jedoch ist das Modell apchenden an verschiedene Umweltbedingungen (zB Sauerstoffgehalt) und die erste Host-Immunantwort bei akuten C. untersuchen trachomatis-Infektionen 8,9. Weitere Pläne sind, um ein Modell zum Testen von Antibiotika gegen C. etablieren trachomatis in ganzen menschlichen Eileiter und die metabolische Zustände der verschiedenen Entwicklungsstadien im Epithel der Eileiter durch 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet zu charakterisieren.

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der DFG-Exzellenzcluster "Entzündung an Grenzflächen" (RA-Falls, RA-D) unterstützt. Wir sind dankbar für die ausgezeichnete technische Unterstützung von Kristin Wischnat.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximid Sigma - Aldrich
SPG-Puffer verschiedene siehe Rezept unten
Monti Fixativ verschiedene siehe Rezept unten
Natriumcacodylatpuffer verschiedene siehe Rezept unten
Richardson-Färbung verschiedene siehe Rezept unten

Rezepte:

1. SPG-Puffer

  1. Fügen Sie 75 g Saccharose.
  2. In 2,47 g Dinatriumphosphat.
  3. In 0,36 g Mononatriumphosphat.
  4. In 0,72 g Glutaminsäure.
  5. Füllen Sie auf 1 l mit Aqua dest.
  6. Der pH-Wert auf 7,3.

2. 0,1 M Natriumcacodylat, pH 7,35.

  1. In 42,80 g Dimethylarsensäure Natriumsalz.
  2. In 68,46 g Saccharose.
  3. Füllen Sie auf 1 l mit Aqua dest. bis 0,2 M Natriumcacodylatpuffer zu erhalten.
  4. Vor dem Gebrauch verdünnten Lösung mit Aqua dest. auf die gewünschte Konzentration und pH-Einstellung auf 7,35, wenn nötig.

3. Monti Fixativ

  1. In 156 ml 0,12 M Natriumcacodylatpuffer. 3,2 25 ml 25% Glutardialdehyd in aqua dest.
  2. Fügen Sie 19 ml10% Paraformaldehyd in Aqua dest.
  3. 3 ml 3% CaCl 2 in aqua dest.
  4. Der pH-Wert auf 7,35 und füllen mit Aqua dest. bis 312 ml Endlösung.

4. Richardson-Färbung

  1. Mischen Sie zu gleichen Teilen von 1% Methylenblau in 1% ige wässrige Lösung Borax und 1% Azur II in Aqua dest.

Referenzen

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Schlagwörter

Chlamydia trachomatisRasterelektronenmikroskopieTransmissionselektronenmikroskopieEx vivo GewebemodellMontys Fixiermittelkritischer PunktetrocknerSputter CoaterUltramikrotomHypoxiekammer

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