Computertomographie-gesteuerte Time-Domain diffuse Fluoreszenz-Tomographie in der Kleintiere für die Lokalisierung von Krebs-Biomarker

Summary

Diffuse Fluoreszenz-Tomographie bietet eine relativ kostengünstige und potenziell hoher gesamten Ansatz für präklinische In-vivo- Tumordarstellung. Die Methodik der optischen Datenerfassung, Kalibrierung und Bildrekonstruktion für eine Computertomographie-geführte berührungslosen Zeitbereichs-System unter Verwendung von fluoreszierenden Ausrichtung der Tumorbiomarker epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor in einem Maus-Gliom-Modell dargestellt.

Abstract

Kleintier-Fluoreszenz molekulare Bildgebung (FMI) kann ein mächtiges Werkzeug für die präklinische Wirkstoffforschung und-entwicklung Studien ¹ sein. Jedoch Lichtabsorption durch Gewebe Chromophore (zB Hämoglobin, Wasser, Lipide, Melanin) typischerweise begrenzt optischen Signalausbreitung durch Dicken größer als ein paar Millimeter ^2. Im Vergleich zu anderen sichtbaren Wellenlängen, Gewebeabsorption für rote und nahes Infrarot (NIR-) Lichtabsorption dramatisch abnimmt und nicht-elastische Streuung wird die dominante Licht-Gewebe-Wechselwirkung Mechanismus. Die relativ neue Entwicklung von fluoreszierenden Mittel, und absorbieren Licht im nahen IR-Bereich (600-1000 nm), hat die Entwicklung von Bildverarbeitung und Lichtausbreitung Modelle von ganzen Körper dreidimensionalen Bildgebung in Kleintieren ³ kann erreicht angetrieben.

Trotz großer Fortschritte in diesem Bereich bleibt die schlecht gestellte Natur der diffuse Fluoreszenz-Tomographie eine deutlicheProblem für die Stabilität, Kontrast Erholung und räumliche Auflösung der Bildrekonstruktionstechniken und die optimale Herangehensweise an FMI bei Kleintieren muss noch vereinbart werden. Die Mehrheit der Forschungsgruppen haben in charge-coupled device (CCD)-basierte Systeme, die reichlich vorhandenen Gewebe-Sampling aber suboptimal Empfindlichkeit ^4-9 liefern investiert, während unsere Gruppe und ein paar andere Systeme auf Basis von ^10-13 sehr hohe Empfindlichkeit Detektoren verfolgt haben , dass zu diesem Zeitpunkt erlauben dichtem Gewebe Probenahme nur auf Kosten der niedrigen Bildgebung Durchsatz erreicht werden. Hier zeigen wir die Methodik für die Anwendung Single-Photon-Detection-Technologie in einem Fluoreszenz-Tomographie-System zu lokalisieren, eine krebsartige Hirnverletzung in einem Mausmodell.

Die Fluoreszenz-Tomographie (FT)-System verwendet Einzelphotonenzählung mit Photomultiplier (PMT) und informative Zeitbereich Lichterfassungseinrichtung in einem berührungslosen Konformation ^11. Dies ermöglicht eine gleichzeitige colwahl der übertragenen Anregung und Emission, und beinhaltet eine automatische Belichtungssteuerung Fluoreszenzanregung ^14, Laser-Referenzierung, und Co-Registrierung mit einem kleinen Tier Computertomographie (MicroCT) System ^15. Eine Nacktmaus-Modell wurde für die Bildgebung verwendet. Das Tier wurde mit einem orthotop menschliche Gliom-Zelllinie (U251) in der linken Gehirnhälfte geimpft und bebildert 2 Wochen später. Der Tumor wurde durch Einspritzen eines Fluoreszenz-Tracer fluoreszieren, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) gezielt auf epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor, ein Zellmembranprotein bekannt, in der U251 Tumorzelllinie überexprimiert und vielen anderen Krebsarten ^18. Eine zweite, ungezielte fluoreszierender Tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) wurde ebenfalls zur Rechenschaft für Nicht-Rezeptor-vermittelte Effekte injiziert auf die Aufnahme der gezielten Tracer, ein Mittel zur Quantifizierung der Bindung des Tracers und Rezeptor-Verfügbarkeit / Dichte liefern ^27. Eine CT-gesteuerte, time-Domäne-Algorithmus wurde verwendet, um den Standort der beiden fluoreszierenden Tracern (dh die Lage des Tumors) im Gehirn der Maus und ihre Fähigkeit zur Lokalisation des Tumors durch Kontrastmittel-Kernspintomographie wurde bestätigt, zu rekonstruieren.

Obwohl für die Fluoreszenz-Bildgebung in einem Gliom Mausmodell gezeigt, kann die Methode in diesem Video vorgestellt, um verschiedene Tumor-Modellen in verschiedenen kleinen Tiermodellen potenziell bis zu der Größe einer Ratte ¹⁷ verlängert.

Protocol

1. Tierische Vorbereitung

1. Anesthetize Nacktmaus (Charles River, Wilmington, MA) mit intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg ip).
2. Bewegen Sie die Maus in stereotaktischen Rahmen, einen Einschnitt in die Kopfhaut auf der linken Seite des Schädels und unter Verwendung einer 18-Gauge-Nadel, erstellen Sie eine 1 mm-Durchmesser-Loch in den Schädel 2 mm von der Mittellinie und 2 mm hinter der Bregma.
3. Injizieren Sie ⁵ x 10 5 U251 humanen neuronalen Zellen des Glioblastoms (freundlicherweise von Dr. Mark Israel am Dartmouth College, Hanover, NH zur Verfügung gestellt) in 5 ul Phosphatpuffer-Lösung in der linken Gehirnhälfte in einer Tiefe von ca. 2 mm unterhalb der Oberfläche der Gehirn. Verwenden Sie einen Hamilton Mikro-Spritze ¹⁸ und ein stumpfes Ende 27-Gauge-Nadel für die Zelltransplantation und legen Sie die Spitze der Nadel 3 mm von der äußeren Oberfläche des Schädels und dann zurücktreten 1 mm, um eine Tasche für die Zellen zu schaffen.
4. Nahteinschnitt Website und lassen Sie wiederEntdeckung von der Operation.
5. Warten ~ 14 Tage, damit der Tumor zu wachsen, bevor Bildgebung.

2. Fluoreszenz-Tomographie-System Calibration

1. Am Tag der Maus Imaging, zu initiieren und ermöglichen Laser und Lichtdetektoren zu Warm-up für ca. 20 Minuten, um Drifts in Empfindlichkeit des Systems zu vermeiden.
2. Legen Sie eine 100 °-durch-4 ° gentechnisch Linie Diffusor (Thorlabs, Newton, NJ) bei der direkten Zentrum der Bildgebung Gantry, senkrecht zu dem Anregungslaser: eine Pikosekunden-gepulsten 80-MHz-Multimode 635 nm Laserdiode (PicoQuant Photonics North America Inc., Westfield, MA). Stellen Sie den Winkel des Diffusors auf den Anteil des Signals von allen fünf Kanälen Licht Sammlung entdeckt zu maximieren. Eine vollständige Beschreibung der Bildgeometrie ist an anderer Stelle ^11,14,15 zur Verfügung gestellt.
3. Zeigen OD 2 Neutralfilter (Thorlabs, Newton, New Jersey) vor allen Fluoreszenzdetektion Photomultipliern (PMT) und OD 1 Neutralfilter (Thorlabs, Newton, New Jersey) vor allen Transmission Erkennung PMTs. Sammeln Sie 100 zeitliche Pulsform Ausbreitung Profile (TPSF) des Lasers, die jeweils mit einem 1-s Integrationszeit.
4. Normalisieren jeder TPSF durch den Laser Referenz für korrekte zeitliche Drift in der Laserreferenzebene und Mittel über alle Iterationen für jeden Detektor. Diese gemittelten TPSFs sind die Detektor-spezifisches Instrument Antwortfunktionen (IRF) in dem optischen Bildrekonstruktion verwendet.

3. Imaging Protocol

1. Anesthetize die Maus mit 2% Isofluran (1 L / min).
2. Inject 1 Nanomol IRDye 800CW-EGF und 1 Nanomol von Alexa Fluor 647 in 100 ul Phosphatpufferlösung, intraperitoneal, 12 h vor der Bebilderung zu epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Überexpression im Tumor zielen.
3. Platzieren Sie die Maus auf die Glasfaser unterstützt der bildgebenden Bett, Arrangieren mit der Maus, so dass seine Nase noch in einem Kegel liefert Isofluran-Narkose.
4. EnSie sicher, dass die Maus in geeigneter Weise auf dem Bett angeordnet: Das bedeutet, dass, wenn das Bett in der Fluoreszenz-Tomographie-System befestigt ist die Maus in der ungefähren Mitte des bildgebenden Gantry ist. Diese Positionierung kann durch Drehen des Anregungs-Laser 180 ° um die Maus, dass der Brennpunkt des Lasers einen Punkt beleuchtet etwa auf der Mitte der Maus aus der Perspektive des Lasers bei allen Winkeln geführt werden.
5. Einmal positioniert, übertragen Sie sorgfältig die Bildgebung Bett und Maus an den MicroCT (eXplore Locus, GE Healthcare, London, ON) Scanner und anatomischen Informationen sammeln bei einer Auflösung von 93-isotropen um für den ganzen Kopf der Maus.
6. Visualisieren des CT-Bildes Stapel und wählen die Scheibe (n) mit der Fluoreszenz-Tomographie-System abgebildet werden.
7. Sorgfältig überweisen Sie den Imaging-Bett und Maus zurück in die Fluoreszenz-Tomographie-System. Wählen Sie die Anzahl der Positionen Quelle, um Daten über die Maus für jeden Bildgebung SLIC sammelne (32), die Integrationszeit für jeden TPSF Messung (1 s), die Anzahl der Iterationen für jede Quellenposition (10) und die Position und Anzahl der gewünschten Bildgebungsgebiet Scheiben aus dem CT-Bild Stapel von Schritt 3.6. Die Zahlen in Klammern sind typische Werte für die einzelnen bildgebenden Parameter Nachgeben ~ 5 Minuten der Datenerfassung pro Bilderzeugungsscheibe.
8. Legen Triple Notch-Filter (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) vor der Fluoreszenzdetektion PMTs, um jede Laserlicht erreicht die Fluoreszenz-Detektoren zu beschränken, und OD 2 Neutralfilter vor der Durchlässigkeit Detektion PMTs Sättigung zu vermeiden dieser Detektoren.
9. Führen Sie die Software zur Datenerfassung, Sammeln Fluoreszenz und Transmission TPSFs an jedem definierten Quelle-Detektor Position und für jede Anregungswellenlänge (635 nm und 755 nm, die Alexa Fluor 647 und IRDye 800CW EGF-Tracer, bzw. zu erregen). Für jeden Satz von TPSFs gesammelt, überwachen und aufzeichnen die Laserintensitätmit einem Referenzwert PMT-Kanal.

4. Bildrekonstruktion

1. Bestimmen Sie die äußere Oberfläche der Maus und die Lage der Imaging-Bett Haltestangen aus den CT-Bildern und erstellen Masken, die die Grenzen der Maus und die Imaging-Stangen separat behandelt.
2. Benutzen Sie die Maus-Maske, um eine Finite-Elemente-Netz des Tieres mit der Software NIRFAST ¹⁹ zu produzieren.
3. Lokalisieren der Quelle und der Detektor Positionen von der Fluoreszenz-Tomographie-System auf der Oberfläche des Netzes auf MicroCT und Fluoreszenz räumlichen Koordinaten-Registrierung ²⁰ basierend.
4. Entfernen optischen Datenpunkte mit Quelle oder des Detektors Positionen, die mit dem Standort der Aufnahmebett Haltestäbe Interaktion assoziiert.
5. Normalisieren von Daten an jedem Quelle-Detektor Position von der Laser-Referenz gesammelt, für korrekte zeitliche Drift in der Laser-Referenz, und richtig für Filter-Empfindlichkeiten, die durch experimentelle Prüfung ermittelt wurden zum Zeitpunkt des Kaufs ^15.
6. Nehmen Sie das Geboren Verhältnis der Daten (Fluoreszenz, die durch Transmission geteilt) für jede Quelle-Detektor-Position und vermehren sich mit einem Forward-Modell Simulation der Transmission auf der Finite-Element-Tier-Mesh für eine einheitliche optische Eigenschaften. Dies geschieht, um Fehler mit der Source-Detektor-Gewebe Kupplung ²¹ zu mindern, um die Daten in der Modell ²² zu kalibrieren, und die Daten für andere Aspekte der Modell-Daten Fehlanpassung ^23,24 einzustellen.
7. Konstruieren Sie einen Datenvektor des skalierten Differenz der Daten geboren Verhältnis bei beiden Wellenlängen gesammelt komponiert. Der Skalierungsfaktor wird gewählt, um EGFR verbindlich Gegensatz zu maximieren. Führen Zeitbereichs-Bildrekonstruktion mit der kalibrierten Daten unter Verwendung der Differenz TPSF für jeden Detektionskanal als eine Eingabe, und schaffen Fluoreszenz Karten des kontrastverstärkten gezielte Tracer ^15.

5. Repräsentative Ergebnisse

"> Ein Beispiel eines Fluoreszenz-Rekonstruktion mit einem Co-registrierten CT anatomische Bild aus dem Kopf einer Maus mit einem U251 orthotopen Gliom Tumor in 1b dargestellt überlagert. Der Masseschwerpunkt des Glioms von der fluoreszierenden Rekonstruktion (1b bestimmt ) war maximal 1 mm über dem Tumor Zentrum der Masse durch Kontrast-Verbesserung Magnetresonanz-Tomographie (Abbildung 1a) bestimmt. Die CT-und MRT-Bildern co-registriert wurden auf einer gegenseitigen Information-Transformation basiert.

Abbildung 1. Kontrastverstärkte (Gadolinium) Magnet-Resonanz-Image der Maus Kopf (a). Die Maus wurde orthotop mit einem U251 menschliche Gliom-Zelllinie beimpft. Die Lage des Tumors, die mehr Kontrastmittel als das normale Gehirn absorbiert, kann in der linken Gehirnhälfte (rechts im Bild) zu sehen und durch den weißen Pfeil. Der Ausgangsort hatg Computertomographie-Bild (aus der gleichen Stelle auf dem Kopf Maus) ist in (b) mit den epidermalen Wachstumsfaktor gezielt Fluoreszenz abzüglich der ungezielte Fluoreszenz Rekonstruktion überlagert dargestellt. Die Einheiten der Fluoreszenz im umgekehrten mm und beziehen sich auf den Absorptionskoeffizienten des gebundenen Fluoreszenz durch gezielte ihre Quantenausbeute und durch seine Konzentration multipliziert.

Discussion

Fluoreszenz-Tomographie (FT) ist ein sensibler, ionisierende Strahlung frei molekularen Bildgebungsverfahren auf sichtbaren und nahen infraroten Lichts Transport durch biologische Gewebe basieren. Die meisten der Interesse an FT hat sich auf sein Potenzial zur Wirkstoffforschung und-entwicklung in kleinen tierexperimentellen Modellen ¹ und ein zentraler Bereich der Forschung war die Erforschung der Krebs-Biomarker-Expression und dem Ansprechen auf molekulare Therapien zu beschleunigen hat ²⁶ konzentriert. Derzeit gibt es zwei konkurrierende Ansätze, um FT-System-Design. Die häufigste basiert auf gekühlten charge-coupled device (CCD) für die Fluoreszenzdetektion ^4-9 bezogen. Dieser Entwurf stellt eine hohe Dichte von Messungen, die Maximierung Gewebeentnahmevorrichtung da jedes Pixel in der CCD-Kamera kann Licht, das einen eindeutigen Pfad gereist ist durch das Gewebe zu erfassen. Allerdings haben CCD-Kameras einen begrenzten Dynamikbereich und Ausleserauschen schränkt ihre ultimative Empfindlichkeit. Das zweite Design vermeidet die potenzielle Einschränkungen gen der CCD-Kamera Detektion unter Verwendung hochempfindliche Single-Photon-Zähl-Technologie auf die Verwendung solcher Detektoren SEV-Röhren oder Avalanche-Photodioden ^10-13 bezogen. Der Nachteil dieser empfindlichere Nachweismethoden ist, dass jeder Detektor kann nur sammeln Licht an einem einzigen Punkt, daher zu dichtem Gewebe Probenahme erreicht werden können, entweder viele Detektoren zu verwenden (was sehr teuer ist), oder viele Projektionen müssen abgebildet werden mit dem gleichen Detektor (das kann sehr zeitaufwändig sein). Während das optimale Niveau der Gewebeentnahme für Kleintier-FT noch nicht vereinbart worden ist, und darf nur von Fall zu Fall variieren, wird vereinbart, dass Single-Photon-Counting Instrumentierung besser geeignet ist, um die Empfindlichkeit Grenzen der FT in Bezug erkunden seiner Fähigkeit, geringen Konzentrationen molekularer Marker zu detektieren. In dieser Studie stellen wir eine Methodik für die Durchführung von FT mit Single-Photon-Counting-Erkennung Instrumentierung zu lokalisieren Tumoren in Mäusen.

ENT "> Es gibt vier wichtige Schritte erforderlich, um robuste Datensätze mit zeitkorrelierten Single-Photon-Counting-FT zu produzieren. Die erste ist die Anwendung eines geeigneten und unkomplizierte Kalibrierung. In der vorgestellten Methodik werden die jeweiligen Sensibilitäten der einzelnen Detektionskanal entfielen durch Sammeln einer Baseline-Messung von Anregungslicht durch eine Leitung-Diffusor ausgebildet, um gleiche Anteile der Lichtmenge für jeden Detektor ¹⁵ zu richten übertragen. Ferner ist das detektierte Licht während eines Experiments kontinuierlich an den Laser Referenz kalibriert, sowohl in Bezug auf Intensität und Mittel .-Zeit, die im Laufe der Zeit schwanken kann, durch den Betrieb eines Lasers Referenzkanal ^11,15 Die zweite kritische Schritt ist die genaue Erfassung und Co-Registration der anatomischen Bildgebung für geführte Fluoreszenz Rekonstruktionen Der FT-Daten allein bietet keine anatomische Information. daher, um ein Modell der leichten Transport zu schaffen, die verwendet werden, um die lo rekonstruierenKation Leuchtstofflampen in einer Probe aus der detektierten Fluoreszenz an der Oberfläche der Probe, muss die Anatomie der Probe in Bezug auf die FT-System genau bekannt sind. In unserem System wird die anatomische Information von einem Mikro-Computertomographie mit räumlichen Koordinaten, die räumlich sind mit denen des FT-System registriert ^15,20 erworben. Der dritte kritische Schritt sorgen, daß sich eine optimale Belichtung (dh insgesamt Photonendetektion für jede Laserprojektionseinheit) in jedem Quelle-Detektor-Position eingesetzt wird. Dies ist aus zwei Gründen wichtig: erstens, um sicherzustellen, dass es ein ausreichendes Signal-Rausch-bei jeder Erfassung Position und der zweiten zu dem Detektor Sättigung, die die Detektion Geräte beschädigen könnten, zu vermeiden. Um eine optimale Belichtung bei jedem Detektor Position zu erreichen, eine automatische Belichtungssteuerung verwendet wird, die im wesentlichen trianguliert die optimale Belichtung von zwei, Low-Signal Forderungen ^14. Das vierte kritischeSchritt der Methode verweist die gesammelten Fluoreszenzdaten auf die Menge der übertragenen Anregungslicht. Diese Referenzierung wird oft das Verhältnis Born genannt, und bietet viele Vorteile für die FT, mit dem im wesentlichen darauf eine Milderung der Modell-Daten Fehlanpassungsfehlern ^23,24. Das vorgestellte System wurde entwickelt, um sowohl Fluoreszenz-und Durchlicht Anregungslicht gleichzeitig zu erkennen, indem jedes Jahr das Licht in jeden Detektionskanal in 2 separate Photovervielfacherröhren. Auf diese Weise vermeiden wir irgendwelche Auswirkungen von Bewegung auf die Richtigkeit der Born-Verhältnis.

Mit einem robusten Datensatz es Hand, beinhaltet Bildrekonstruktion der Time-Domain-Daten Lösung des inversen Problems der Finite-Elemente-Netz mit dem Ausdruck:

d = Jx

wobei d ein Vektor mit N x M-Elemente für n Quelle-Detektor-Vorsprünge und m TPSF Zeitgatter, J ist ein n x m-mal-l Sensitivitätsmatrix (oder Jacobi), für l Knoten in dem Netz, und x der Vektor der Fluoreszenz optischen Eigenschaften in jedem Knoten, mit einer Größe L d die kalibrierten Daten während des Experiments und J gesammelt simuliert mit Hilfe der Finiten-Elemente-Lösung. in den Zeitbereich Diffusionsnaeherung der Fluoreszenz Transport ^25. Die Zeit-Dimension von J ist auch mit dem Detektor spezielles Instrument Antwortfunktionen gefaltet. X ist eine Darstellung der Fluoreszenz Karte von Interesse ist und für die Verwendung eines Levenberg-Marqardt nichtnegative kleinsten Quadrate mit Tikhonov Regularisierung ¹⁵ gelöst.

Die hier vorgestellten Methode, die beschreibt ein Verfahren zur Lokalisierung der Lage fluoreszenzmarkierten Tumoren in Mäusen mit hochsensiblen Photonenzählung Fluoreszenzdetektion, hat das Potential, die Grenzen der FT zu drücken. In einer früheren Studie, beschäftigt das Potenzial diesesAnsatz in larger-than-Mäusen Tiere Modelle, wie Ratten, sowie eine verbesserte Empfindlichkeit gegenüber bestehenden System-Designs in Maus-Größe Proben wurde ¹⁷ demonstriert. Die unmittelbare Anwendung dieses Ansatzes würde für die Überwachung der Biomarker-Expression in vivo in kleinen Tiertumormodellen zu der Wirksamkeit von Arzneimitteln in einem Hochdurchsatz-Mittel zu beurteilen. Die Fähigkeit des Systems zu erregen und erkennen Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Fluoreszenzmarker. Zusätzliche fluoreszierende Marker ein Mittel zur Abfrage mehrerer Aspekte einer Pathologie, gleichzeitig, oder könnte verwendet werden, wie in dieser Studie werden, um weitere quantitative Bildgebung Ansätze wie Dual-Reporter Methoden zur Messung der in vivo-Bindung Potenzial, ein Marker der Rezeptordichte beschäftigen ^26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, Succinimidylester	Life Technologies	A20106	Reagiert mit Wasser, um nicht-spezifische Bindung zu minimieren