Methodenartikel

Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

DOI:

10.3791/4052

5. September 2012

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Verständnis der Funktion des zentralen Nervensystems in Wirbeltieren erfordert Aufnahmen aus, weil viele Neuronen kortikale Funktion entsteht auf der Ebene der Populationen von Neuronen. Hier haben wir ein optisches Verfahren zur überschwelligen neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung aufzeichnen beschreiben, gedithert Random-Access-Scans. Diese Methode records somatischen Fluoreszenz-Calcium-Signale von bis zu 100 Neuronen mit hoher zeitlicher Auflösung. Ein Maximum-Likelihood-Algorithmus deconvolves die darunterliegende überschwellige neuronale Aktivität von den somatischen Fluoreszenz Calcium Signale. Diese Methode erkennt zuverlässig Spikes mit hohen Erkennungsraten Wirkungsgrad und eine geringe Rate der False Positives und kann verwendet werden, um neuronale Populationen zu untersuchen In vitro Und In vivo.

Zusammenfassung

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Signalisieren von Informationen in dem Vertebraten zentralen Nervensystems wird oft von Populationen von Neuronen statt einzelner Neuronen durchgeführt. Auch Ausbreitung überschwellige spiking Tätigkeit umfasst Populationen von Neuronen. Empirische Studien zu kortikalen Funktion direkt erfordern daher Aufnahmen von Populationen von Neuronen mit hoher Auflösung. Hier beschreiben wir ein optisches Verfahren und eine Entfaltungs-Algorithmus auf neurale Aktivität von bis zu 100 Neuronen mit Single-Cell-und Single-Spike-Auflösung aufzeichnen. Diese Methode beruht auf dem Nachweis der transienten Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration somatischen mit überschwelligen elektrischen Spitzen (Aktionspotentiale) in kortikalen Neuronen verbunden. Hohe zeitliche Auflösung der optischen Aufnahmen wird durch eine schnelle Random-Access-Scanning-Technik mit akusto-optische Deflektoren (bevollmächtigten Anweisungsbefugten) 1 erreicht. Zwei-Photonen-Anregung der Calcium-sensitiven Farbstoff Ergebnisse in hoher räumlicher Auflösung in undurchsichtigen Gehirn tisSue 2. Rekonstruktion der Spitzen von den Fluoreszenz-Calcium-Aufnahmen durch eine Maximum-Likelihood-Methode erreicht. Simultane elektrophysiologische und optische Aufnahmen zeigen, dass unsere Methode zuverlässig erkennt Spikes (> 97% Spike Detektionseffizienz) weist eine geringe Rate an falsch positiven Spitzen-Detektionssignals (<0,003 Spikes / s) und einer hohen zeitlichen Genauigkeit (etwa 3 ms) 3. Diese optische Methode der Spitzen-Detektionssignals können verwendet werden, um neuronale Aktivität in vitro und in vivo in narkotisierten Tieren 3,4 aufzuzeichnen.

Protokoll

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Ein. Optischer Aufbau (Abbildung 1)

  1. Für Zwei-Photonen-Anregung ein Infrarot gepulstes Lasersystem mit Femtosekunden-Pulsen verwendet wird. Eine hohe Laserausgangsleistung (teilweise> 2W bei 890 nm Wellenlänge) ist erforderlich, um die großen Verluste durch die optischen Komponenten des Systems eingebracht wird, ausgeglichen.
  2. Ein prechirper bestehend aus zwei Prismen verleiht eine negative Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) auf die Laserpulse vor den akustooptischen Ablenker (bevollmächtigten Anweisungsbefugten) für die zeitliche Dispersion durch den bevollmächtigten Anweisungsbefugten 1 eingeführt kompensieren.
  3. Zwei bevo....

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Diskussion

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Dithered Random-Access-Scans indirekt erkennt überschwellige Spiking-Aktivität aus dem Anstieg der intrazellulären Calcium-somatischen mit jedem Spike in einem Neuron Somata verbunden. Der Anstieg der intrazellulären Calcium durch fluoreszierende Kalzium Farbstoffe nachgewiesen. Die Grenzen der geditherten Random-Access-Überprüfung ergeben weitgehend aus der begrenzten Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Calcium Fluoreszenzsignalen. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis wird wiederum durch Lichtschäden, die es nicht erlaubt mit h.......

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Randy Chitwood für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Whitehall-Stiftung und der Alfred P. Sloan Foundation Zuschüsse für HJK unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare (optional)
Optische Komponenten werden in Reihenfolge, beginnend von dem Laser
Titan: Saphir-Laser Coherent Inc. Chameleon Ultra 2 Hohe Leistung empfohlen (> 2W bei 900 nm)
Achromatische Linse f = 30 mm Thor Labors AC254-030-B Anti-Reflex-Beschichtung (AR) für 650-1050 nm
Achromatische Linse f = 100 mm Thor Labors AC254-100-B AR 650-1050 nm
Objektiv f = 75 mm Thor Labors LA1608-B AR 650-1050 nm
Objektiv f = 175 mm Thor Labors LA1229-B AR 650-1050 nm
Achromatische Linse f = 300 mm Thor Labors AC254-300-B AR 650-1050 nm
Achromatische Linse f = 100 mm Thor Labors AC254-100-B AR 650-1050 nm
Achromatische Linse f = 100 mm Thor Labors AC254-100-B AR 650-1050 nm
Akusto-optische Deflektoren Intraaction Corp ATD 6510CD2
Reflektierende Beugungsgitter Newport 53-011R 100 Rillen / mm bevollmächtigten Anweisungsbefugten mit 65 MHz Bandbreite und Scan-Winkel von 45 mrad
21,6 mm Brewster-Prismen Lambda Research Optics Inc. IBP21.6SF10
Colored Glass Schott BG-39
Dichroitischen Spiegel Chroma Technology Corp Z532RDC
Photomultiplier-Module Hamamatsu H9305-03
DAC-ADC Bord National Instruments PCI-6115
Oregon Green 488 BAPTA-01.00 Invitrogen O-6807

Referenzen

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  1. Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science<....

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Schlagwörter

Einzelzellaufl sungCalcium ImagingZwei Photonen AnregungRandom Access ScanningDekonvolutionsalgorithmusSpike DetektionFluoreszenzmikroskopie

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