Identifizierung von Protein-Komplexen in Escherichia coli Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Summary

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium entwickelt Escherichia coli Das verwendet werden kann, zu isolieren und zu charakterisieren stabilen Multi-Protein-Komplexen zur Homogenität, auch ausgehend von einer geringen Kopienzahl pro Zelle ist.

Abstract

Da die meisten zellulären Prozesse werden von makromolekularen Anordnungen, die systematische Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) und die Identifizierung der Untereinheitzusammensetzung von Multi-Protein-Komplexen Einblick in Genfunktion Verfügung stellen können und besseren Verständnis der biologischen Systeme ^{1, 2} vermittelt wird. Physikalische Wechselwirkungen können mit hoher Konfidenz vialarge angelegte Isolierung und Charakterisierung von endogenen Proteinkomplexe unter nahezu physiologischen Bedingungen auf Affinitätsreinigung chromosomal-markierte Proteine ​​in Kombination mit Massenspektrometrie (APMS) basierend abgebildet werden. Dieser Ansatz ist erfolgreich in evolutionär diversen Organismen, einschließlich Hefe, Fliegen, Würmern, Säugetierzellen, Bakterien und ^1-6 aufgebracht. Insbesondere haben wir eine Carboxy-terminale Peptid Sequentielle Affinity (SPA) dualen Markierungssystem für Affinitäts-Reinigungskatalysator native Protein-Komplexen aus kultivierten gramnegativen Escherichia coli erzeugt wird, unter Verwendung genetically Spann Gastlabor Stämme, die für genomweite Untersuchungen der grundlegenden Biologie und konservierte Prozesse der Prokaryoten ^{1, 2, 7} gut geeignet. Unsere SPA-Kennzeichnungssystem ist analog zu dem Tandem Affinitätsreinigung Methode ursprünglich für Hefe ^{8, 9} entwickelt, und besteht aus einem Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) durch die Spaltstelle für die hochspezifische Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease gefolgt und drei Kopien des FLAG-Epitop (3X FLAG), so dass für zwei aufeinanderfolgende Runden von Affinitätsanreicherung. Nach Kassette Amplifikation werden sequenzspezifische lineare PCR-Produkte Codieren des SPA-tag und einen selektierbaren Marker integriert und ausgedrückt in Rahmen als carboxyterminale Fusionen in einem Hintergrund, der DY330 veranlaßt transient exprimieren ein hocheffizientes heterologe Bakteriophagen Lambda Rekombinationssystem ¹⁰ ist. Nachfolgende Dual-Schritt-Reinigung mit Calmodulin und anti-FLAG Affinitätsbeads ermöglicht die hochselektiveund effizienten Beitreibung sogar geringer Menge Protein-Komplexe von großen Kulturen. Tandem-Massenspektrometrie wird dann verwendet, um die stabil co-reinigenden Proteine ​​mit hoher Empfindlichkeit (niedrige Nachweisgrenzen Nanogramm) zu identifizieren.

Hier beschreiben wir detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die wir üblicherweise für die systematische Protein-Tagging, Reinigung und Massenspektrometrie-basierte Analyse von löslichem Protein-Komplexen aus E. verwenden coli, die bis skaliert werden und kann potenziell auf andere Bakterienarten, einschließlich bestimmter opportunistischer Krankheitserreger, die zugänglich Recombineering zugeschnitten sind. Die resultierenden physikalischen Wechselwirkungen zeigen oft interessante unerwartete Komponenten und Verbindungen hindeutet neuartige mechanistische Links. Integration der PPI-Daten mit alternativen molekulare Assoziation Daten wie genetische (Gen-Gen-) Wechselwirkungen und genomische-Kontext (GC) Prognosen Aufklärung der globalen molekulare Organisation von Multi-Protein-Komplexe in bi erleichtern kanngische Wege. Die Netzwerke für E. erzeugten coli können verwendet werden, um einen Einblick in die funktionelle Architektur von orthologen Genprodukte in anderen Mikroben für die funktionelle Annotationen derzeit fehlen gewinnen.

Protocol

Ein. Bau von Gen-spezifische SPA-Tagging in E. coli DY330 Stamm

1. Das Plasmid pJL148 umfassend den SPA-tag-DNA-Sequenz und die Kanamycin Antibiotikaresistenzmarker Kassette (Kan ^R) als Matrize in der Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation ⁷ verwendet. A 45 nt genspezifischen Vorwärtsprimer, unmittelbar stromaufwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tag spezifischen Vorwärtsprimer befindet, und eine 45 nt genspezifischen Rückwärtsprimer, der unmittelbar stromabwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') tag spezifischen Rückwärtsprimer, werden verwendet, um den SPA-tag und ^Kan ® Kassette aus dem pJL148 mit nachfolgenden PCR amplifizieren Zyklusbedingungen: 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 1 min, 55 ° C für 1 min, 68 ° C für 2 Min. 10 Sek., um 68 ° C für 10 min folgte. Diese verstärkten Sequenzen dienen as Substrate für die ektopisch eingeführt λ-Rot-Rekombination homologer Maschinen (siehe unten).
2. Das PCR-Produkt wird unter Verwendung einer QIAquick-PCR, um Salze, die mit der Elektroporation stören können, zu entfernen. Das gereinigte PCR-Produkt wird anschließend zur gezielten am 3'-Ende (unmittelbar stromaufwärts des nativen Stopcodon) eines spezifischen Gens in DY330 Stamm, in dem der λ-Rot-Rekombination Maschinen ¹⁰ exprimiert wird integrieren.
3. Die DY330 λ-Red exprimierenden Stamm wird über Nacht in 2 ml Luria-Bertani (LB)-Medium bei 32 ° C gewachsen durch Schütteln bei 180 UpM. 1 ml der Übernacht-Kultur wird anschliessend in 70 ml frischem LB-Medium in 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert. Das Inokulum wird bei 32 ° C durch Schütteln bei 180 rpm, bis die OD ₆₀₀ erreicht ~ 0,8 gewachsen.
4. Die Kultur wird in einem frischen 250 ml Erlenmeyerkolben, wo die Zellen durch Inkubation der Kolben im Wasserbad auf 42 ° C durch vorsichtiges Schütteln bei induziert übertragen180 rpm für 15 min. Unmittelbar nach der Induktion wird die Flasche in einem Eiswasser-Bad Aufschlämmung für mindestens 30 min unter Schütteln inkubiert.
5. Das eiskalte Kultur wird sofort in vorgekühlte 50 ml Polypropylen-Röhrchen transferiert und einer Zentrifugation bei 3993 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Das Zellpellet wird in 50 ml eiskaltem sterilen Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert bei 3993 xg für 6 Minuten bei 4 ° C. Das Zellpellet anschließend in 1 ml kaltem Wasser resuspendiert und in einem 1,5 ml Röhrchen Effendorf und zentrifugiert bei maximaler Geschwindigkeit für 20 sec bei 4 ° C. Nach zwei oder drei Waschschritten mit eiskaltem Wasser, wird das Zellpellet schließlich in 700 ul eiskaltem, sterilen Wasser resuspendiert, was in elektro-kompetenten Zellen.
6. Durch Elektroporation wird ein ul des gereinigten Amplikon in 40 ul der elektro-kompetenten Zellen eingeführt. 2,5 kV, 25 uF mit Puls: Die Zellen werden in einem Bio-Rad GenePulser II mit folgenden Einstellungen elektroporiertSteuerung von 200 Ω. Nach homologer Rekombination und Integration werden die Transformanten, die erfolgreich rekombiniert das Tag / Kassette in das Chromosom basierend auf Resistenz gegen Kan (Abbildung 1A) ausgewählt ist. Mehrere Transformanten werden für Western Blotting, um die korrekte Erzeugung (dh positive Signal) von SPA-markierte Fusionsproteine ​​mit anti-FLAG M2-Antikörper, die selektiv gegen die FLAG-Epitope des SPA-tag ist verifizieren ausgewählt.
7. Bestätigt carboxyterminalen SPA-tag-Fusion-Stamm in großem Maßstab zu löslichem Protein-Komplexen aus geernteten Zellen unter Verwendung des SPA Aufreinigungsprotokolls isolieren kultiviert. Der übersicht der Schritte in dem Reinigungsverfahren Affinitätsmarkierung involviert ist in 1B gezeigt.

2. Kultivierung und Beschallung

1. Beimpfen 100 ul einer SPA-markierten E. coli Glycerin Lager in 50 ml Terrific Broth (TB) Flüssigmedium mit 50 ul von 25 ug / ml o ergänztf Kan Lösung in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Die Kultur über Nacht bei 32 ° C.
   Anmerkung: Da die Temperatur-induzierbare λ Red Kassette in Stamm DY330 steht unter der Kontrolle eines temperatursensitiven Repressors ¹⁰ wird die SPA-markierten E.coli-Stamm bei 32 ° C gezüchtet
2. Übertragen 10 ml der Übernacht-Kultur in 990 ml frischem TB mit 25 ug / ml Kan in einem 4-Liter-Kolben ergänzt. Die Kultur wird bei 32 ° C unter konstantem Schütteln bei 250 Upm für 5 bis 6 Stunden gezüchtet, bis die OD ₆₀₀ erreicht auf ~ 2 bis 3 ist.
3. Übertragen Sie die 1 Liter E. coli SPA-tag Kultur einer Zentrifugierung Flaschen zu reinigen und Spin der Zellen bei 4 ° C im Beckman Zentrifuge J6-HC @ 3993 × g für 15 min.
4. Der Überstand wird von den Flaschen entfernt Zentrifugation. Resuspendieren E. coli-Zellpellets mit 25 ml Beschallungspuffer. Stellen Sie sicher, um die Zentrifugation Flaschen auf Eis zu allen Zeiten zu halten.
5. Die resuspendierten Pelletübertragen zu 50 ml Falcon-Röhrchen aus Polypropylen und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die eingefrorenen Zellen werden bei -80 ° C für die langfristige Verwendung gelagert.
6. Vor Beschallung, tauen die gefrorenen Zellen vollständig, indem die Pellets auf Eis. Die aufgetauten Proben werden in ein steriles Edelstahlbecher auf Eis platziert Ultraschallbehandlung übertragen. Die Sonde wird in die Probe eingetaucht und für 3 min mit Ultraschall behandelt. Eine zusätzliche 2 Minuten läßt man die Probe vor Überhitzung zu kühlen.
7. Das beschallte Zellysat wird in die vorgekühlte sterile Zentrifugenröhrchen gegeben und einer Zentrifugation bei 4 ° C im Beckman Zentrifuge mit einem Rotor JA-17 @ 35.267 xg (16.000 UpM) 15 min zweimal.
   Hinweis: Im Falle der Membran Proteinreinigung, die beschallte Zelllysat nur einmal für 15 min zentrifugiert, weil man nicht weiß, in welcher Fraktion sich die Membranproteine ​​sind, das heißt, entweder im Pellet oder in der Überstandsfraktion. Um zu vermeiden, überschießende Verlust des memMembran-Proteine, drehen wir die Zellen für 15 min bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand wird anschließend zur Reinigung weiterverarbeitet (siehe nachstehend beschrieben), wenn 1% Detergens verwendet wird, um die Membranproteine ​​zu solubilisieren.
8. Der Überstand der Zentrifugation wird vorsichtig Röhre zu einem 50 ml Polypropylen-Falcon-Röhrchen überführt und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die beschallte gefrorenen Zellextrakt wird höchstens für einen Zeitraum von 6 Monaten bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden.

3. Affinitätsreinigung

1. Vor der Verwendung werden 100 ul Anti-Flag-M2-Kügelchen von 10 Volumen AFC-Puffer (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Detergenz und 0,1-0,5 mM TCEP [Tris (2-carboxyethyl) phosphin gewaschen - Salzsäure]) ohne Reinigungsmittel und das Reduktionsmittel TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphin).
2. Der gefrorene, beschallte Zellextrakt wird, indem das Röhrchen in kaltem Wasser aufgetaut. Die aufgetauten Zellen Extrakt wird mit 3 ul von Benzo inkubiertnase Nuklease 30 Minuten bei 4 ° C. Zu dieser Mischung hinzuzufügen nichtionischen Detergens Triton X-100 (Endkonzentration des Detergens 0,1% betragen sollte) und 200 ul Suspensionen von Anti-Flag-M2-Agarose-Kügelchen.
   Anmerkung: Für alle löslichen Proteins Reinigungen, 0,1% Triton X-100 wird verwendet, um nicht-spezifische Adsorption, zu minimieren, wo als zur Reinigung eines Membranproteins, verschiedenen milden nicht-ionischen Detergenzien, wie etwa C12E8 (Octaethylenglykol dodecylether), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltosid) und Maltose-Neopentylglykol (MNG) können bei einer 1% Detergens Konzentration eingesetzt werden, um die Solubilisierung zu verbessern. Da verschiedene Wasch variierenden haben Solubilisierung Effizienz der Membranproteine, ist es empfehlenswert, unabhängige Reinigungen Protein mit mehr als einem Detergens durchzuführen.
3. Der Inhalt wird sanft durch Drehen des Rohres während 3 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines LabQuake Schüttler gemischt. Nach 3 Stunden der Drehung ist das Rohr bei 1.700 xg für 6 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dann rsorgfältig emoved so viel wie möglich, ohne die lose Perlen Pellet.
4. Das Pellet wird in dem verbleibenden Überstand resuspendiert und anschließend in einem 0,8 x 4 cm Bio-Rad Polypropylen prep Spalte. Sicherzustellen, um den Bodenauslaß Stopfen aus der Säule zu entfernen, damit sich die Eluate durch Schwerkraft abfließen. Die Säule wird 5 mal mit TEV-Spaltung Schritt.
5. Nach dem Ablassen der gewaschenen Eluate wird der untere Auslass der Säule geschlossen. Um die gleiche Spalte wird die Spaltung durch Zugabe ~ 5 bis 10 ul (50 Einheiten) von TEV-Protease und 400 ul 1X AFC-Puffer auf die Säule durchgeführt. Sicherzustellen, um den Kopf der Kolonne mit einer Kappe zu schließen. Die Spalte mit den Perlen vorsichtig gedreht Nacht bei 4 ° C über Nacht mit einem LabQuake Shaker.
6. Entfernen der Kappe auf der Oberseite und dem Auslass Stopfen am unteren Ende der Säule, und die Eluate nach dem Drain-TEV-Spaltung in eine frische Säule mit 200 ul Suspensionen von Calmodulin-Sepharose-Kügelchen, die um 10 gewaschen wird zurückgewonnenVolumina von Calmodulin Bindungspuffer.
7. Sowohl die Ober-und die Unterseite der Säule dicht befestigt, und der Inhalt in der Kolonne werden sanft durch Drehen für 3 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines LabQuake Schüttler gemischt.
8. Nach 3 Stunden der Drehung wird das Eluat durch Entfernen der oberen Kappe und der unteren Stopfen der Säule abgelassen. Die Spalte wird viermal mit 200 ul 1X Calmodulin Bindungspuffer durch ein stringentes Waschen mit 400 ul Calmodulin Waschpuffer gewaschen.
9. Das gebundene Protein wird in vier Fraktionen von 50 ul in ein frisches Eppendorf-Röhrchen mit 1X Calmodulin Elutionspuffer eluiert. Die eluierte Fraktion wird in zwei saubere Eppendorf-Röhrchen in gleichen Volumina verteilt. Sowohl die Rohre anschließend getrocknet unter Verwendung einer Geschwindigkeit Vakuum.
10. Das getrocknete Eluat von einem Rohr für den Betrieb eines Silberfärbung Gel verwendet, während die andere in -80 ° C gelagert wird, vor der Verwendung der Massenspektrometrie.

4. Silberfärbung

1. Für Silber staining, wird die Hälfte des Volumens von 3X SDS (Natriumdodecylsulfat) Probenpuffer auf 50 ul des getrockneten Eluat gegeben. Nach Kochen der Mischung für 5 min werden die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel geladen.
2. Nachdem das Gel ausgeführt wurde, wird es vorsichtig in Fixierlösung gelegt (50% Methanol und 10% Essigsäure) und vorsichtig auf einem Schüttler für 20 min gerührt. Das Gel wird dann in 20% Ethanol für 10 min gespült.
3. Die feste Gel wird zweimal gründlich mit 500 ml doppelt destilliertem Wasser für 10 Minuten gewaschen, um niedrige einheitlichen Hintergrund zu gewährleisten.
4. Das Gel wird dann vorsichtig in 500 ml Natrium-Thiosulfat für 1 min, gefolgt von zwei Waschschritten mit destilliertem Wasser für 20 Sekunden gefolgt gerührt.
5. Das Wasser wird verworfen, und das Gel wird in 200 ml 0,1% Silbernitratlösung für 30 min inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Silbernitratlösung entfernt und das Gel mit destilliertem Wasser für 20 sec. gewaschen, um den Überschuss an Silbernitrat entfernen.
6. Das Gel wird schließlich in 75 ml Hand geschütteltder Entwicklungslösung. Wenn die gewünschte Intensität erreicht ist, wird die Entwicklungslösung verworfen und 80 ml Essigsäure wird zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Sicherzustellen, um das Gel in Essigsäure für mindestens 20 min für die richtige Darstellung der Gelbanden inkubieren.

5. Proteolyse und Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie

1. Um der getrockneten Probe werden 50 ul der Verdauung Puffer und 0,9 ul 100 mM TCEP-HCl (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin - Salzsäure) und inkubieren Sie die Mischung für 45 min bei Raumtemperatur für den Reduktionsschritt. Anschließend wird 1 ul 500 mM Iodacetamid zugegeben und in dunklen weitere 40 min zur Probe Alkylierung ermöglichen.
2. Nach der zweiten Runde der Inkubation geben 1 ug immobilisiertem Trypsin zu dem Gemisch und inkubieren entweder bei 37 ° C für 5 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, um die Reaktion durch Zugabe von 1 ul Essigsäure stoppen.
3. Vornässen Millipore Zip-Tip Pipettenspitze durch Absaugen 10 ul der Benetzung und Äquilibrierungslösung. Verzichten die Lösung zu verschwenden. Anschließend absaugen 10 ul der Waschlösung und verzichten die Lösung zu verschwenden. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
4. Für eine effiziente Bindung des Peptids Mischung bis zur Spitze, mischen Pipette die Peptidmischung 20 mal. Das Peptidgemisch, dass zur Spitze geklebt wird durch Ansaugen und Abgeben der Waschlösung gewaschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für eine effiziente Bindung des Peptid-Gemisch an der Spitze.
5. Mit der Spitze mit dem gebundenen Peptid absaugen 10 ul der Benetzung und Äquilibrierungslösung und verzichten in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Nach dem Trocknen der eluierten Proben in der Geschwindigkeit Vakuum kann die Proben sofort durch Massenspektrometrie analysiert oder bei -80 ° C vor der Verwendung.

6. Protein Identifizierung durch LTQ Orbitrap Velos Massenspektrometer

The Polypeptid Komponenten der isolierten Komplexe werden anhand eines LTQ Orbitrap Velos Hybrid-Tandem-Massenspektrometer. Die Orbitrap hat außergewöhnliche Auflösungsvermögen (> 60.000 Full Width Half Maximum oder FWHM) und Masse Genauigkeit (<2 ppm), die MS / MS Probenahme von irrelevanten unspezifischen Hintergrund Verunreinigungen unter Kontrolle Reinigungen erkannt minimiert, während die High-Speed-Velos Ionenfalle Komponente erkennt und Fragment niedriger Häufigkeit Peptide unter Verwendung sowohl Elektronentransfer-Dissoziation und Kollisions-induzierte Dissoziation Modi. Hohes Vertrauen Spiele unter resultierenden MS / MS-Spektren mit Referenz E. kartiert coli Protein-Sequenzen mit Datenbank-Suchalgorithmus wie SEQUEST und jeder passenden Sequenz während einer Wahrscheinlichkeit Algorithmus wie STATQUEST ¹¹ ausgewertet. Die gesamte Spektren Zahl Peptidsequenz Einzigartigkeit und gemeinsamen Hintergrund Kontaminanten in negative Kontrolle (dh. Mock) Reinigungen erkannt werden als eine geringe empirische falsch-dis zu erreichenErholung bewerten. Die folgenden Schritte sind für die Protein-Identifizierung durchgeführt:

1. Die Mikro-Säulen sind mit ~ 10 cm von 3 um Luna-C _18-Harz gepackt sind und eine Schnittstelle mit einem Proxeon Nanoelektrospray Ionenquelle, die in Übereinstimmung mit dem Instrument Orbitrap platziert wird.
2. Eine nano Proxeon Strömung binäre HPLC-Pumpe wird verwendet, um eine stabile Spitze Flussrate von ~ 300 nl min ^-1 während der Peptidtrennungen liefern.
3. Um Peptid-Elution zu erreichen, wird eine organische Puffergradienten bis nach dem Muster der Komplexität gesetzt. Zum Beispiel wird die folgende Gradienten in der Regel bis zum E. eingestellt coli SPA Proben: Lösungsmittel B wird von 2% bis 6% in 1 min erhöht, um 24% in 38 min, bis 100% in den nächsten 4 min, bei 100% für 1 min gehalten, dann sank auf 2% in 1 min, und abschließende Halten bei 2% für 15 min. Die mobile Phase Lösungsmittel A hat 95% HPLC Gradient Wasser und 5% ACN mit 0,1% Ameisensäure, während Lösungsmittel B hat 5% HPLC Gradient Wasser und 95% ACN mit 0,1% Ameisensäure acid. Die Strömungsgeschwindigkeit an der Spitze der Nadel auf 300 nl min ^-1 für 60 min eingestellt.
4. Da die Massenspektrometer Zyklen durch einen vollen Scan Masse bei 60.000 Auflösungen ausführen, werden 10 gleichzeitige Tandem-Massenspektrum Abtastungen für die intensivsten Prekursorionen gesammelt. Dynamische Ausgrenzung, monoisotopische Masse Auswahl und Echtzeit-Daten-abhängigen Akquise-Instrument sind aktiviert.
5. Die Spektren werden mit Hilfe einer Datenbank gesucht Suchalgorithmus wie SEQUEST gegen eine Datenbank von E. coli-Protein-Sequenzen, und das Ergebnis wird statistisch filtriert unter Verwendung eines Wahrscheinlichkeitsmodells Algorithmus wie STAQUEST ^11, um eine niedrige False Fündigkeitsquote gewährleisten. Nur hohes Vertrauen (99% Wahrscheinlichkeit) Kandidaten ausgewählt, während Spiele zeigen mehr als 10 ppm Masse Fehler im Vergleich zu den theoretischen peptide mass von der weiteren Betrachtung ausgeschlossen.

Results

Nachdem markierte Köderproteine, die auf endogenen Ebenen exprimiert werden, affinitätsgereinigt aus logarithmischen Phasenkulturen waren, wurden die Proben auf ein Silberfärbegel geführt, um die einzelnen Polypeptidkomponenten der isolierten stabilen Komplexe sichtbar zu machen. Einen zweiten Teil der affinitätsgereinigten Proteinproben unterzogen wir außerdem einer gelfreien Tandem-Massenspektrometrie (LCMS), um die entsprechenden Polypeptidsequenzen zu identifizieren. Die Wirksamkeit dieses APMS-Verfahrens wird durch ...

Discussion

Ein wichtiger Aspekt des SPA-basierte APMS hier beschriebene Ansatz ist, dass Tagging innerhalb der natürlichen chromosomalen Kontext durchgeführt wird, wodurch eine normale Genregulation wird beibehalten (dh Muttersprache. Köder Promoter erhalten, damit Expression nicht gestört wird) und native stabil-assoziierten Protein-Komplexe werden bei nahezu endogenen zurückgewonnen. Operon Polarität Probleme werden ebenfalls durch Einschließen eines nach außen gerichteten Promotor in der Selektionsmarker vermieden. Die...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibiotika
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
2. Terrific-Bouillon mittel
Bio-Trypton	Bioshop	#TRP 402
Hefeextrakt	Bioshop	#YEX 555
Glycerin	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303<
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR- und Elektrophorese-Reagenzien
Taq DNA-Polymerase	Fermentas	# EP0281
10 x PCR-Puffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Beladung Farbstoff	NEB	#B7021S
Ethidiumbromid	Bioshop	# ETB444
10X TBE Puffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Borsäure	Bioshop	#BOR001
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# E6768
DNA-Leiter	NEB	#N3232L
5. Plasmid-Isolations- und Clean-up-Kits
Plasmid Midi-Kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	#28104<
Thermocycler	BioRad	iCycler
Agarose-Gelelektrophorese	BioRad
Elektroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0,2 cm Elektroporationsküvette	Bio-Rad
42 ° C Wasserbadschüttler		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 Zentrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 ° C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 ° C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 ° C-Platten-Inkubator	Fisher Scientific<
Acrylamid Monomer, N,N'- Methylenbis-acrylamid	Bio-Rad	#161-0125
Ammoniumpersulfat	Bioshop	# AMP001
n-Butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 Filterpapier	Fischer Scientific	#09-806A
Mini-Protean 3 Zellen	Bio-Rad	#165-3301
iBlot Geltransfergerät	Invitrogen	#IB1001
Nitrozellulosemembranen	Bio-Rad	#162-0115
Monoklonaler Anti-Flag M2 Antikörper	Sigma	#F3165
Meerrettichperoxidase	Amersham	#NA931V
Vorgefärbt Protein-Molekulargewichtsstandards	Bio-Rad	#161-0363
Chemilumineszenz-Reagenz	PIERCE	#1856136
Autoradiographie-Film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw Löschpapier	Sigma	#P7796
C2 Plattform Schaukelschüttler	New Brunswick Scientific, USA
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Proteaseinhibitoren	Roche	#800-363-5887
0,5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490<
x 4 cm Bio-Rad Polypropylen-Säule	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase-Nuklease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 Agarose-Kügelchen	Sigma	#A2220
Calmodulin-Sepharose-Kügelchen	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV-Protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558<
	Bioshop	#MET302
Essigsäure	Bioshop	t#ACE222
Natriumthiosulfat	Sigma	#S-7143
Silbernitrat	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyd	Bioshop	#FOR201
Natriumcarbonat	Bioshop	#SOC512
11. Reagenzien und Geräte für die Proteinidentifizierung
Trypsin Gold, Massenspektrometrie Qualität	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitril	Sigma	#A998-4
Ameisensäure Säure	Sigma	#F0507
Wasser in HPLC-Qualität	Sigma	#95304
Iodacetamid	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm von 3 μ m Luna-C18 Harz	Phenomenex
Proxeon Nano HPLC Pumpe	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos Massenspektrometer		Thermo Fisher Scientific
4-Liter-Konuskolben	VWR	#89000-372
50 ml Polypropylen-Falcon-Röhrchen	Beliebiger Anbieter
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Beliebiger Anbieter
250 ml konische Flocken	VWR	#29140-045
15 ml sterile Kulturröhrchen	Thermo Scientific	#366052
Kryo-Fläschchen	VWR	#479-3221-80
° C Gefrierschrank	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific<