Hollow microneedle-baserte Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Summary

Denne artikkelen detaljer bygging av en multiplekset microneedle-baserte sensor. Enheten er utviklet for in situ prøvetaking og elektrokjemisk analyse av flere analytter i en rask og selektiv måte. Vi ser for klinisk medisin og biomedisinsk forskning bruker for disse microneedle-baserte sensorer.

Abstract

Utviklingen av en minimalt invasiv multiplekset overvåkingssystem for rask analyse av biologisk relevante molekyler kunne tilby personer som lider av kroniske medisinske tilstander lettvinte vurdering av deres umiddelbare fysiologiske tilstand. Videre kan det tjene som et analyseverktøy for analyse av komplekse, multifaktorielle sykdommer. For et slikt multianalyte sensor skal realiseres, må det være minimalt invasiv, prøvetaking av interstitiell væske må skje uten smerte eller skade på brukeren, og analyse må være rask, så vel som selektiv.

Opprinnelig utviklet for smerte-fri levering av legemidler, har microneedles blitt brukt til å levere vaksiner og farmakologiske stoffer (f.eks insulin) gjennom huden. ^1-2 Siden disse enhetene tilgang til interstitiell plass, kan microneedles som er integrert med microelectrodes brukes som transdermal elektrokjemiske sensorer. Selektiv påvisning av glukose, glutamat, laktat, hydrogen peroxide, og askorbinsyre har blitt demonstrert ved hjelp av integrerte microneedle-elektrode enheter med karbonfibre, modifiserte karbon pastaer, og platina-belagte polymer microneedles tjenestegjør som transducing elementer. ^3-7,8

Dette microneedle sensorteknologi har aktivert en roman og sofistikert analytisk tilnærming for in situ og samtidig påvisning av flere analytter. Multiplexing tilbyr muligheten for å overvåke komplekse microenvironments, som ellers er vanskelig å karakterisere på en rask og minimalt invasiv måte. For eksempel kan denne teknologien brukes for samtidig overvåking av ekstracellulære nivåer av, glukose, laktat og pH, ⁹ som er viktige metabolske indikatorer på sykdom stater ^7,10-14 (f.eks kreft spredning) og anstrengelsesutløst acidose. ¹⁵

Protocol

1. Microneedle Fabrication

1. Ved hjelp av tredimensjonale modellering programvare Solidworks (Dassault Systemes SA, Velizy, Frankrike), designe en pyramideformet-formet hul microneedle array (figur 1). ^3-5
2. Lag en støtte struktur for microneedle matrisen bruke magi RP 13 programvare (Materialise NV, Leuven, Belgia). Støtten strukturen tillater harpiksen renne fra enheten under fabrikasjon og gir en base som de microneedles er bygget. Et eksempel støtte struktur er vist i figur 1.
3. Den koblede støtte og microneedle matrise filer lastet inn i Perfactory RP programvaren (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Tyskland), som kontrollerer fabrikasjon prosessen. Innenfor denne programvarepakken, velg antall microneedle matriser som skal fabrikkeres og bestemme plassering av enheter på fabrikasjon plate.
4. Kjør kalibrering i ultrafiolett-modus på 180 mW for Perfactory rask prototyping produksjon system og verifisere avvik i energi ligger innenfor ± 2 mW.
5. Når fabrikasjon er fullført, fjerner microneedle arrays fra bunnplate og utvikle i isopropanol i 15 minutter. Tørke arrays med trykkluft og kurere microneedles ved romtemperatur i 50 sekunder i Otoflash Postcuring System (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Tyskland) for å sikre fullstendig polymerisasjon.
6. Valider microneedle fabrikasjon via mikroskopi og kontrollere at hver microneedle boringen er hul og uhindret. Fullt fabrikkert microneedles er vist i figur 2.

2. Fabrikasjon av Carbon Lim elektrode Arrays

1. Bruk en 60 W Model 6,75 CO ₂ raster / vektor laser system (Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ) for å klippe hull og avsløre de underliggende individuelt adresserbare forbinder kobbertråder i en flat fleksibel kabel (21039-0249), som var hentet fra en kommersiell kilde (Molex Connector Corp, Lisle, IL) (Figur 3 (A og B)). Plasser de flate fleksible kabler i en jigg for å skikkelig justere dem på laser ablasjon plate. Bruk en rastering tilnærming for å skape 500 mikrometer i diameter hulrom i isolerende delen av den fleksible kabelen. Oppskrifter for ablasjon er skapt i CorelDraw (Corel, Ottawa) og sendt til laser systemet.
2. Rengjør de modifiserte flate fleksible kabler med en airbrush som sprayer aceton på 40 psi. Avslutt rense dem ved å skylle med isopropanol og avionisert vann. Kontroller under et mikroskop at ingen isolerende film holder seg over de utsatte kobberstrimlene.
3. Det neste trinnet er å opprette et holdingselskap hulrom for pakking av karbon pastaer. Melinex tape (0.002 "tykkelse belagt på én side med trykkfølsom akrylatlim) er ablated med samme mønster som de elektroden strimler, orienterte de ablated elektroden strimler og komprimert på 3000 psi for 2 minutter for å sikre en riktig sammenheng. I dette caSE, er hulrommet diameter 750 mikrometer.
4. Et ekstra lag med Melinex tape (0.004 "tykkelse belagt på to sider med trykkfølsom akrylatlim) blir deretter ablated i samme mønster som ensidig teip og brukes etter justering for å binde de microneedle arrays til karbon lime elektroden arrays .

3. Syntese av Funksjonelle Carbon pasta og Pakking av elektroden Hulrom

1. Den glukose sensitive karbon pasta er basert off av en tidligere oppskrift og oppnås ved å blande 10 mg glukose oksidase og 2,2 mg av poly (ethylenimine) til en homogen blanding er oppnådd. ¹⁶ Til denne blandingen, 60 mg rhodium på karbon pulver ( 5% belastning) er lagt til. 40 mg mineralolje er lagt og deretter blandet. De pastaer lagres ved 4 ° C inntil bruk, massen er brukt opp til en uke etter tilberedning.
2. PH sensitive karbon pasta oppnås ved å blande 30% (w / w) mineralolje og 70% (w / w) grafitt powder. Pakk lime inn i elektroden hulrom som beskrevet i avsnitt 3.4. Gjør løsning av 10 mM Fast Blå RR diazonium salt (4-benzoylamino-2 ,5-dimethoxybenzenediazonium chloride hemi (sink klorid) salt) i 0,5 M fosforsyre. ^17. Sett en 20 mL dråpe av denne løsningen over pakket lim elektrode for 30 minutter til spontant chemisorb Fast Blå PR diazonium salt. Skyll med avionisert vann og oppbevar i buffer eller deionisert vann når den ikke er i bruk.
3. Den laktat sensitive karbon pasta er basert off av en tidligere oppskrift og oppnås ved å blande 2,5 mg rhodium på karbon pulver og 2,5 mg av laktat oksidase, alternerende mellom 5 minutter av sonikator og 5 minutter med virvling for fem rotasjoner. ¹⁸
4. Pakking av de modifiserte pasta i forberedt flate fleksibel kabel oppnås ved å anvende de respektive pastaer over elektroden hulrom. Ved hjelp av et tynt stykke plast (f.eks kanten av en plast veie båt) som en tannsparkel og pakke tHan limer til en glatt overflate er oppnådd. Gjenta med en andre rent veier båt inntil overflødig lim fjernes. Vask med avionisert vann. En skjematisk viser laser ablasjon for å skape hulrom, pakking av karbon pasta, og microneedle integrering (beskrevet i punkt 2 og 3) er presentert i figur 3.

4. Påvisning og sensor kalibrering

1. Laktat deteksjon oppnås ved å måle chronoamperometric respons på sensoren på -0,15 V og opptak gjeldende etter 15 sekunder i 0,1 M fosfat buffer (pH = 7,5). Figur 4 (a) inneholder en skjematisk av electrocatalytic reaksjon for påvisning av laktat .
2. Glukose deteksjon er utført på en lignende måte ved å måle chronoamperometric respons på sensoren på -0,05 V og opptak gjeldende etter 15 sekunder i 0,1 M fosfat buffer (pH 7,0). Figur 4 (b) inneholder en skjematisk av electrocatalytic reaksjon for detection av glukose.
3. pH er overvåket ved å kjøre sykliske voltammetric skanninger fra -0,7 V til 0,8 V ved 100 mV / s og opptak posisjonen til oksidativt høyeste potensiale. En skjematisk av redoksreaksjoner for pH-gjenkjenning er vist i figur 5.
4. Kalibreringsleverandører kurver for glukose og laktat sensorer kan lages ved suksessive tillegg av de respektive analytt; chronoamperometric målinger presterer etter hvert analytten tillegg som beskrevet i pkt. 5.1 og 5.2. Alternativt kan faste potensielle chronoamperometric målinger gjøres under omrøring mens du lar tilstrekkelig tid (~~~HEAD=NNS 10-100 sekunder) mellom hver analytt tillegg for strøm stabilisering.
5. pH kalibrering kurver kan skapes ved å måle posisjonen til den oksidative høyeste potensiale over en rekke kjente pH-verdier 5-8 i 1,0 pH enhet trinn og opptak sykliske voltammograms som beskrevet i pkt. 5.3.

5. Representant Resultater

Ved innhenting chronoamperometric kurver (f.eks for glukose deteksjon eller laktat deteksjon) i sovende løsninger med endret karbon lim-fylt microneedles, vil den nåværende umiddelbart redusere på begjæring fra den respektive deteksjon potensial. Det vil etter hvert råtne til en steady state verdi. En representant Resultatet vises i figur 6, og dette resultatet er hentet fra 2 mm tillegg av laktat og opptak ved laktat microneedle. Løsningen må bli kort røres etter hvert laktat tillegg. Den nåværende etter 15 sekunder stiger på å øke konsentrasjonen av laktat, dagens responsen kan deretter brukes til å bestemme konsentrasjonen av laktat i en ukjent løsning. Alternativt kan kontinuerlig overvåking brukes i en rørt løsning (eller i en strømmende løsning) som viste til en løsning med en økende glukose konsentrasjon (Figur 5). Igjen, økningen i dagens upon økende than konsentrasjonen av glukose kan brukes til å standardisere glukose svar på en ukjent løsning. Tilstrekkelig tid må være tillatt etter hver spiker slik at løsningen for å stabilisere. Sykliske voltammograms ved pH sensitive microneedle i 0,1 M fosfatbuffer er vist over fire forskjellige pH løsninger fra 5 til 8 i en pH-enhet trinn i Figur 6. De oksidative peak potensielle skift med økende pH, dette fenomenet brukes som en indikator på pH-verdi.

Figur 1. Bilder av STL-filen av microneedle matrisen opprettet i Solidworks (A) og av Print Screen, som viser støtte struktur (B).

Figur 2. Scanning elektronmikroskop mikrografer av microneedle array (A) og et enkelt microneedle innenfor denne array (B).

Figur 3. Skjematisk av flat fleksibel kabel. Trinnene er involvert omfatter endre flate fleksible kabelen (A), ablating mønstrede sirkler (B), og legger den i utgangspunktet ablated Melinex lag, som er fylt med karbon pasta (C), samt å legge den andre ablated Melinex lag og parre den microneedle array (D). Klikk her for å se større figur .

Figur 4. Kalibrering av laktat-sensitive pasta med 15 sekunders chronoamperometric skanninger -0,15 V i 0,1 M fosfat buffer (pH = 7,5). Hver økning i dagens tilsvarer en 2 mm tilførsel av laktat.

Figur 5.

Figur 6. Syklisk voltammogram (CV) av pH sensitive karbon lime i 0,1 M fosfatbuffer enn pH 5-8 i 1. pH enheter trinn (teal = 8,0 pH, grønn = pH 7,0, lilla = pH 6,0, rød = pH 5,0). En femte CV ble brukt til analyse versus Ag / AgCl referanse og Pt tråd teller elektroder.

Discussion

Flere aspekter ved utformingen av dette microneedle-baserte sensor ble vurdert før enheten fabrikasjon. For å bruke denne sensoren for sporing i sanntid, må responstiden på sensoren være lav, i denne protokollen, hver testet sensor viste en responstid under femten sekunder. Pastaer som brukes i denne protokollen ble også valgt for sin selektivitet innenfor in vivo miljøer, som inneholder electroactive biomolekyler som kan forstyrre elektrode respons. I tillegg til å lime sammensetning, ble de opererer potensialene valgt å minimere påvirkning av forstyrrende electroactive arter. Vellykket fabrikasjon av microneedle matrisen innebærer valget av en passende microneedle design og microneedle materiale. Disse to aspektene vil avgjøre om microneedle kan punktere huden, beskytter elektrodene mot fysisk skade, og utelukker elektrode-vev kontakt. Det bør bemerkes at en ekstern Ag / AgCl og Pt refererehet og mot elektroder ble brukt under målingene, in vivo bruk av denne enheten med mennesker eller dyr fag ville kreve at disse elektrodene bli innarbeidet i enheten.

Hver komponent av microneedle-baserte sensor har funksjoner som må være godkjente for å sikre riktig funksjonalitet. Kvalitetskontroll under modifisering av den flate fleksible kabelen (figur 3 B) innebærer at det isolerende laget er helt fjernet fra overflaten av tinn-belagt kobbertråder etter laser ablasjon (figur 3). Unnlatelse av å fjerne det isolerende laget fra overflaten av kobbertråd etter laser ablasjon kan føre til uregelmessige svar på grunn av ufullstendig elektrisk kontakt. Laseren-ablated Melinex tape må undersøkes med et mikroskop for å sikre at diameteren av hver åpning er konsekvent som det definerer arbeidsområdet av elektroden. Ved påføring av karbon limer til laser-ablated Melinex tape hulrom,pastaen må samsvare nøyaktig hulldiameteren uten overflødig for å unngå signal variasjoner på grunn av forskjeller i areal. Under chronoamperometric målinger med modifiserte karbon pastaer, må signalet stabiliserer til en grenseverdi før strømmen er registrert. Disse resultatene kan lett variere på grunn blande effekter. Mekanisk testing av microneedle arrays ble utført før sensor inkorporering, i en tidligere studie viste vår gruppe disse matriser var i stand til punktering svin hud, som ble brukt som en analog for human hud ³ microneedle arrays bør ikke gjennomgå deformasjon eller brudd under. gjennom huden siden disse prosessene kan føre til elektroden skade.

Denne protokollen har detaljert bygging av en roman transdermal enhet for elektrokjemisk overvåking. Vi ser for det videre arbeidet involverer microneedle sensorer med en enda større antall individuelt adresserbare microneedles og en større variasjon av stansducers. Denne enheten ble designet for analyse av interstitiell væske i mennesker; bruk med dyr er også mulig med passende artsspesifikke endringer microneedle design. Fremtidige retninger med denne teknologien, men er ikke begrenset til ekstern pasientovervåking, samt kobling med en levering av legemidler enhet for automatisert sensing-levering av legemidler.