Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

Samuel E. Saunders; Jason C. Bartz; Ronald A. Shikiya

doi:10.3791/4075

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Methodenartikel

Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

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DOI:

10.3791/4075

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7. November 2012

Samuel E. Saunders¹ , Jason C. Bartz² , Ronald A. Shikiya²

¹Department of Civil Engineering, University of Nebraska at Lincoln, ²Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Proteinfehlfaltung zyklischen Amplifikation (PMCA) ist ein in vitro-Assay zur Untersuchung von Prionen Umwandlung und Dehnung und Artgrenzen. Es kann auch als ein Prion-Nachweis-Assay verwendet werden.

Zusammenfassung

Prionen sind infektiöse Agenzien, die unweigerlich tödlichen übertragbaren spongiformen Enzephalopathie (TSE) verursachen bei Menschen und Tieren ^9,18. Das Prionprotein hat zwei verschiedene Isoformen, die nicht-infektiösen Host-codierte Protein (PrP ^C) und das infektiöse Protein (PrP ^Sc), eine abnormal gefaltete Isoform von PrP ^{C 8.}

Eine der Herausforderungen bei der Arbeit mit Prion-Agenten ist die lange Inkubationszeit vor der Entwicklung von klinischen Anzeichen nach Host Inokulation ^13. Das traditionell langen und teuren Tier-Bioassay Studien beauftragt. Darüber hinaus werden die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von PrP ^Sc schlecht charakterisiert durch ihre ungewöhnliche Konformation und Aggregation Staaten.

PrP ^Sc kann Saatgut die Umwandlung von PrP ^C zu PrP ^Sc in vitro ^14. PMCA ist ein in vitro-Technik, nimmt advantage dieser Fähigkeit mit Ultraschallbehandlung und Inkubation Zyklen, große Mengen an PrP ^Sc zu erzeugen, mit einer beschleunigten Rate von einer Anlage mit überschüssigen Mengen an PrP ^C und winzige Mengen des PrP ^Sc Saatgut ^19. Diese Technik hat sich als wirksam rekapitulieren die Art und Stamm von PrP ^Sc Spezifität Umwandlung von PrP ^C zu Prionenstamm Interferenz emulieren, und mit sehr geringen Mengen von PrP ^Sc aus infizierten Geweben, Fluiden, und Umweltproben ^{6,7,16 amplifizieren, 23.}

Dieses Papier Details der PMCA Protokoll, einschließlich Empfehlungen zur Minimierung Kontamination Erzeugung konsistente Ergebnisse und Quantifizierung dieser Ergebnisse. Wir diskutieren auch mehrere PMCA Anwendungen, einschließlich der Erzeugung und Charakterisierung von Prion-Stämme, Prionenstamm Störungen, und der Nachweis von Prionen in der Umwelt.

Protokoll

Ein. Vorbereiten der Ausrüstung

Verwenden Sie einen Misonix 3000 oder Misonix 4000 Ultraschallgerät (Farmingdale, NY) mit einem Thermo Electron Neslab EX-7 Wasserbad (Newington, NH), um eine konstante Temperatur von 37 ° C zu halten Beschallen die Proben in 200 ul dünnwandigen PCR-Röhrchen Streifen mit gewölbten Deckeln von Thermo Scientific (Waltham, MA) erhalten.
Ein neues Ultraschallgerät benötigt eine "Pause"-Periode des kontinuierlichen Betriebs ^9. Eine zweimonatige Einfahrzeit besteht aus einem 40-sec Beschallung Burst und 10-minütigen Inkubation Zyklen mit der Amplitude eingestellt bis 10. Man sollte Erosion der gesamten Oberfläche des Titan Mikroplatte Horn (Abbildung 1, Teil B) zu beobachten. Das zirkulierende Wasser aussehen wird weiß-trüb durch Erosion des Titan Mikroplatten Horn. Ersetzen Sie diese Wasser täglich.
Die Verstärkung des PrP ^Sc wird während der Mikrotiterplatte Horn variieren. Die beste PrP ^Sc Amplifikationseffizienz kann innerhalb erhalten werdeneinem Radius von 5 cm von der Mitte der Mikrotiterplatte Horn (Siehe Abbildung 1, Panel C).
Eine Runde PMCA aus 144 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus 5 sec Beschallung und 10 min Inkubation. Dies wird in etwa 24 Stunden pro Runde PMCA ziehen.
Die Leistungsabgabe des Ultraschallbehandlung, auf die Beschallungsvorrichtung Bedienfeld angezeigt werden, variiert mit der Anzahl der PCR-Röhrchen Die in der Sonicator die Zahnstange und der Temperatur des zirkulierenden Wassers aus dem Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass das Wasser äquilibriert bei 37 ° C und füllen nicht mehr als 30% der Sonicator die Röhrchenständer (Abbildung 1, Panel C). Verbreiten Sie die PCR-Röhrchen durch die Mikroplatten Horn. Mindestens eine Reihe von leeren Raum zwischen PCR-Röhrchen-Streifen und damit nicht mehr als vier Röhren zusammen pro Streifen verbunden (Abbildung 1, Panel C).
Die Stärke der Ultraschallbehandlung ist entscheidend für eine erfolgreiche Amplifikation Prionenstamm. Während Beschallen, die Amplitude, um eine Ausgangsleistung habenzwischen 155 ~ 170 Watt. In unserem Labor ist die Sendeleistung zu sechs und sieben für die Misonix 3000 und Misonix 4000 bzw. eingestellt.
Verwenden Sie destilliertes Wasser in das Wasserbad zu vermeiden akkumulieren harten Wasserflecken. Ersetzen Sie diese Wasser wöchentlich. Während der Inkubation und Beschallung Zyklen wird Kondenswasser im Inneren des Mikroplatten-horn Deckel auftreten. Zur Vermeidung von Kondensation, bringen ein kleines Aquarium Heizkissen an die Spitze des Sonicator Gehege, wie in Abbildung 1, Panel A gezeigt

2. Vorbereitung der Proben

Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Creighton University Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Ausschusses und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Vor jedem Gewebe Sammlung, das Tier narkotisiert und muss transkardial perfundiert mit eiskaltem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit 5 mM EDTA bei pH 7,4, um Blut aus dem Gehirn zu entfernen und verhindern die Inhibierung derPMCA Reaktion durch Blut ^7. Sammle tierischen Geweben rasch unter aseptischen Bedingungen und haben engagierte Dissektion Tools für jede Prionenstamm. Nach Dissektion, legen Sie das Gewebe in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, frieren Flash auf Trockeneis, und speichern Sie sie bei -80 ° C bis zur Homogenisierung.
Um die PMCA Substrat (PrP ^C) herzustellen, homogenisieren eine nicht infizierte Hamsterhirn (UN BH) zu einer 10% Gewicht / Volumen (w / v) Lösung mit eiskaltem Kovertierungspuffers (siehe Teil 3) mit einem Tenbroeck Gewebe Mahlwerk. Während Homogenisieren, darauf achten, nicht die Luft im Inneren der Mühle zu erhalten zu vermeiden übermäßige Schaumbildung der Lösung. Klären der Lösung durch Zentrifugieren bei 500 xg für 30 sec und Aliquot des Überstandes in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
Um die PMCA Saatgut (PrP ^Sc)-Lösung herzustellen, ein infektiöses Material homogenisieren (Gehirn, Milz, Lymphknoten, Geweben oder anderen kontaminierten Bodens) zu einer 10% w / v Lösung mit eiskaltem water und aliquoten die Lösung in 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

3. Vorbereiten Conversion Buffer

Wiegen 0,5093 g Triton X-100 in einem 50 ml Messkolben (Ergebnis ist eine 1% Endkonzentration an Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland).
Fügen Sie eine komplette Protease Inhibitor Tablette (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland).
Hinzufügen 0,0931 g EDTA (diese wird in einem 5 mM Endkonzentration von EDTA führen) (Mallinckrodt Baker Inc.; Phillipsburg, NJ).
Den pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH.
Lautstärke auf 50 ml mit Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (Mediatech Inc.; Manassas, VA).
Filtern der Lösung durch einen 0,45 um Nitrocellulosemembran mit einer Vakuumfiltervorrichtung. Die Umwandlung Puffer bei 4 ° C für nicht mehr als einen Monat gelagert werden.

4. Verstärkung des Prion-Stämme mit PMCA

Verdünnt das PMCA Saatgut in den PMCA Substrat in einem Verhältnis von 1:20 (dh Mischung 5 ul der PMCA Saatgut und 95 ul der PMCA Substrat) in einer PCR-Röhrchen. Entfernen und speichern 15 ul Aliquots bei -80 ° C für unsonicated Kontrolle; dies unsonicated Steuerung wird verwendet, um die PrP ^Sc Verstärkung durch Proteinase K (PK) Verdauung durch Western Blot (WB) Analyse folgt quantifizieren. Eine zusätzliche Kontrolle unsonicated könnte durch Platzieren eines zweiten 15 ul Aliquots bei 37 ° C für die Dauer der PMCA Reaktion erzeugt werden. Ein Minimum von drei Wiederholungen wird für statistische Zwecke benötigten.
Gegenstand der Rest der Probe (70 ul) mit einer Runde der PMCA wie auf Abbildung 1 dargestellt, Panel A Schütteln Röhrchen alle 5 Stunden, um eine Wasserkondensation auf dem gewölbten Deckel des PCR-Röhrchen zu vermeiden.
Die Probe Rohren sollten ausgegliedert werden und sanft gevortext (dabei darauf achten, dass die Lösung nicht in den gewölbter Deckel gehen) vor dem Öffnen nach jedem Verfahren, um sicherzustellen, homogeneity und vermeiden mögliche Kontamination.
Für die serielle PMCA (sPMCA) der kurzen Inkubationszeit Stämme (dh HY TME, HaCWD oder 263K), wird der beschallten Material bei einem Verhältnis von 1:20, indem 5 ul der beschallten Probe von Runde eins in 95 ml frisches infizierten Hirnhomogenat (Abbildung 2, Panel B).
Für sPMCA der langen Inkubationszeit Stämmen (dh DY TME, 139h, 22CH, 22Ah oder ME7H), verdünnt das beschallten Materials in einem Verhältnis von 1:1 durch Transferieren 50 ul der beschallten Probe aus der ersten Runde in 50 ml frisches nichtinfizierten Hirnhomogenat (Abbildung 2, Panel B).
Entfernen Sie die zwei 15 ul Aliquots aus dem zuvor verdünnt beschallten Gemisch (aus den Schritten 4,4 bzw. 4,5) und speichern einer von ihnen bei -80 ° C und die andere bei 37 ° C (unsonicated Control-Lösungen für PMCA Runde zwei). Unterziehen die Überreste einer PMCA Runde zwei.
Dieser Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden. In unserem Labor haben wirbis zu fünfzehn PMCA Runden durchgeführt haben, mit den Dehnungs-Eigenschaften bleiben unverändert.
PK verdauen die Proben. Für eine typische WB mischen 5 ul PK 80 ug / ml bis 5 ul Probe (diese Lösung wird eine endgültige PK Konzentration von 40 ug / ml haben) und bei 37 ° C für eine Stunde. Fügen Sie 10 ul Gelladepuffer. Kochen Sie diese Lösung für 10 min. Lassen Sie die Lösung abkühlen und laden 10 ul in das Gel.
Um den Erfolg der Amplifikation zu berechnen führen eine Analyse an den WB PK-verdauten Proben, um die Menge der verstärkten PrP ^Sc durch Vergleich, um entweder zu schätzen, die unsonicated Steuerelementen ^20,21 Abbildung 2, Tafel C oder bekannte Mengen von PK-unverdaute rekombinante PrP.

5. Vermeiden Kreuzkontamination

Critical müssen Maßnahmen ergriffen werden, um Kreuzkontaminationen und das Auftreten von Fehlalarmen durch de novo Bildung von Protease beständige Produkte zu minimieren.

Verwenden Sie einen dedizierten Satz Dissektion Tools (zB Zangen, Pinzetten, Scheren) für die Probenentnahme für jeden Prionenstamm.
Vor Homogenisieren infizierten Gehirnen als PMCA Substrat verwendet werden, wischen Sie die Pipetten mit 1% Bleichmittel. Weichen Sie das Ultraschallgerät die PCR-Röhrchen Rack, Gewebe Homogenisatoren und PCR-Röhrchen Lagerregale mit 1% Bleichmittel für 10 min und anschließend gründlich mit destilliertem Wasser.
Decken Sie die Arbeitsfläche mit einem frischen Versi-Dry Lab Soaker jedes Mal eine neue Probe homogenisiert werden, ist eine neue PMCA Experiment vorbereitet zu sein, oder wenn Aliquotierung zwischen sPMCA Runden.
Verwenden Sie neue Handschuhe jedes Mal neue Proben behandelt (vor allem beim Übertragen Aliquots zwischen sPMCA Runden) werden.
Verwenden Sie kurze Beschallung Bursts für jeden PMCA Zyklus. Cycles of 5 sec Beschallung mit 10 min Inkubation kombiniert ist ausreichend, um Prionen ohne dass de novo PrP ^{Sc 1,20,21,23,24} verstärken. Wie andere Labors haben gezeigt, Erhöhung derBeschallungszeit, die Erhöhung der Beschallung Amplitude und Erweiterung der Anzahl der PMCA-Zyklen erhöht die Wahrscheinlichkeit für die de novo PrP ^Sc Bildung ^2.