Die Beurteilung der Replikation und Beta-Zellfunktion in adenoviral-transduzierten Isoliert Nager Islets

Summary

Dieses Protokoll erlaubt es, Faktoren, die funktionelle Betazellmasse modulieren, um potentielle therapeutische Ziele für die Behandlung von Diabetes zu finden identifizieren. Das Protokoll besteht aus einem optimierten Verfahren zur Insel Replikation und Beta-Zellfunktion in isolierten Ratteninseln nach Manipulation der Genexpression mit Adenoviren zu beurteilen.

Abstract

Glukosehomöostase wird hauptsächlich durch die endokrine Hormone Insulin und Glucagon gesteuert, sekretiert von der Pankreas-Beta und Alpha-Zellen. Funktionelle Betazellmasse wird durch die anatomische Betazellmasse sowie der Fähigkeit der Betazellen zu einer Nährstoffbelastung reagieren bestimmt. Ein Verlust der funktionellen Betazellmasse ist zentral für beide Hauptformen des Diabetes ^1-3. Während die sinkende funktionale Betazellmasse ergibt sich aus einer Autoimmun-Attacke beim Typ 1 Diabetes, bei Typ 2 Diabetes entwickelt sich dieser Dekrement sowohl aus der Unfähigkeit der Beta-Zellen gegenüber Insulin angemessen absondern und die Zerstörung der Beta-Zellen aus einem Kader von Mechanismen. Daher sind Bemühungen um eine funktionale Betazellmasse wieder vorrangig für die bessere Therapie und mögliche Heilmittel für Diabetes.

Es sind Bemühungen im Gange, um molekulare Signalwege, die ausgenutzt, um die Replikation zu stimulieren und verbessern die Funktion der Beta-Zellen identifizieren kann.Im Idealfall würde therapeutische Ziele verbessern sowohl Beta-Zell-Wachstum und Funktion. Vielleicht noch wichtiger ist jedoch zu erkennen, ob eine Strategie, die Beta-Zellen stimuliert das Wachstum auf Kosten der Beeinträchtigung der Beta-Zellen-Funktion (wie mit einigen Onkogene) und umgekehrt wird.

Durch die systematische Unterdrückung oder Überexpression der Expression von Zielgenen in isolierten Ratten-Inseln, kann man potenzielle therapeutische Ziele für die Erhöhung funktionale Betazellmasse ^4-6. Adenovirus-Vektoren können, um effizient überexprimieren oder Knockdown Proteine ​​in isolierten Ratteninseln ^4,7-15 eingesetzt werden. Hier präsentieren wir eine Methode, um die Genexpression Nutzung adenoviralen Transduktion zu manipulieren und zu bewerten Inselchen Replikation und Beta-Zellfunktion in isolierten Ratten-Inseln (Abbildung 1). Diese Methode wurde bereits auf neue Ziele, die Beta-Zell-Vermehrung oder Funktion modulieren ^{5,6,8,9,16,17} zu identifizieren.

Protocol

1. Adenovirale Transduktion und Kultivierung von Ratteninseln

1. Vorbereiten einer 6-Well-Gewebekultur nicht beschichteten Platte durch Zugabe von 2 ml Medium (RPMI 1640 Medium mit 8 mM Glukose, 10% fötales Rinderserum, 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin), um die erforderliche Anzahl von Brunnen. Zum Beispiel kann ein typisches Experiment erfordert drei Vertiefungen - jeweils für einen nicht-Viruskontrolle, ein Virus (zB, GFP-exprimierende Adenovirus), und die experimentelle Gruppe.
2. Erwärmen Sie die Platte auf 37 ° C, indem Sie ihn in eine Gewebekultur-Inkubator für mindestens 30 min.
3. Unmittelbar nach Ratte Inselisoli....

Discussion

Einrichtung Wege, die moduliert werden, um die Replikation stimulieren und die Funktion der Beta-Zellen können relevant sind beiden Hauptformen von Diabetes. Da funktionale Betazellmasse ist abhängig von der Existenz und Funktion von Insulin-sezernierenden Zellen, die Beurteilung dieser Determinanten gleichzeitig hat seine Vorteile. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Protokoll zum Identifizieren, ob die Überexpression oder Unterdrückung eines Proteins an Veränderungen in der funktionellen Betazellmasse in v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
RPMI 1640 Medien	Gibco	11879
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140
6-Well-Platte	BD-Falcon	35-1146	Non-TC behandelt
[Methyl-3 H]-Thymidin	Perkin Elmer	NET027Z001MC	1 mCi / ml
Mikro-Zentrifugenröhrchen	Denville	C2170	1,7 ml
NaCl	Sigma	59888
KCl	Acros	42409
KH 2 </ Sub> PO 4	Acros	20592
MgSO 4	Acros	41348
CaCl 2	Acros	34961
HEPES	Sigma	H0887	1 M Lösung
35% BSA	Sigma	A7979
NaHCO 3	Acros	42427
d-Glucose	Sigma	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% w / v
NaOH	Acros	12426
Szintillationszählung Rohr	Sarstedt	58,536	7 ml, PP
Szintillationszählung Tubenkappe	Sarstedt	65,816
Econo-Safe Zählen Cocktail	RPI	111175
Insulin-RIA	Siemens	TKIN2
BCA Assay Kit	Thermo Scientific	23250
			Ausrüstung
Zentrifugieren	Eppendorf	5415R
Szintillationszählung Röhrchenständer	Sarstedt	93.1431.001
Flüssigkeits-Szintillationszähler	Perkin Elmer	Tri-Carb 2910TR