Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren C elegans

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit zeigt wie man mit kontinuierlichem Fluss Hypoxie Kammern zu verwenden, um Atmosphären mit definierten Konzentrationen von O generieren ₂, Um biologische Reaktionen zu verstehen, um sank O ₂. Dieses System ist einfach einzurichten und zu pflegen, und flexibel genug, um eine breite Palette von O anpassen ₂ Konzentrationen und Modellsysteme

Zusammenfassung

Sauerstoff ist für alle Metazoen, um zu überleben, mit einer Ausnahme ¹ bekannt. Verminderte Verfügbarkeit von O ₂ (Hypoxie) kann Verlauf einer Krankheit, eine normale Entwicklung oder Änderungen der Umgebungsbedingungen ^5.2 entstehen. Das Verständnis der zellulären Signalwege, die bei der Reaktion auf Hypoxie beteiligt sind, konnten neue Einblicke in die Behandlungsstrategien bieten für unterschiedliche menschliche Erkrankungen, Schlaganfall, Krebs aus. Dieses Ziel wurde behindert, zumindest teilweise, durch technische Schwierigkeiten mit kontrollierter hypoxische Exposition in genetisch zugänglich Modell-Organismen verbunden sind.

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ideal als Modellorganismus für das Studium der hypoxischen Reaktion geeignet, da sie einfach zu kultivieren ist und genetisch zu manipulieren. Darüber hinaus ist es möglich, die zellulären Reaktionen auf spezifische hypoxischen O _{2-Konzentrationen,} ohne Verwechslung wirksam, da C zu studieren elegans erhalten O ₂ (und andere Gase) durch Diffusion, um eine erleichterte Atemwege ⁶ gegenüber. Faktoren bekannt, in der Reaktion auf Hypoxie beteiligt sind in C. erhalten elegans. Die tatsächliche Reaktion auf Hypoxie hängt von der spezifischen Konzentration von O ₂ erhältlich ist. In C. elegans, Hypoxie mäßig einen Transkriptions-Reaktion vermittelt wesentlich durch HIF-1 löst, erfordert die hoch-konservierten durch Hypoxie induzierbare Transkription Faktor ^6-9. C. elegans Embryonen HIF-1 in 5.000-20.000 ppm überleben O ₂ ^7,10 . Hypoxie ist ein allgemeiner Begriff für "weniger als normale O _2". Normoxie (normale O ₂₎ können auch schwer zu definieren. Wir betrachten in der Regel Raumluft, die 210.000 ppm O ₂ zu Normoxie zu sein. Es hat sich jedoch gezeigt, dass C elegans hat eine Präferenz für Verhaltens-O _{2-Konzentrationen} von 5 bis 12% (50,000-120,000 ppm O ₂₎ ^11. In larvae und Erwachsene, hif-1 wirkt, um Hypoxie-induzierte Diapause 5000 ppm O ₂ ^{12 zu} verhindern. Allerdings ist hif-1 keine Rolle in der Antwort auf eine niedrigere Konzentration von O ₂ (Anoxie, Arbeitsdefinition <10 ppm O ₂₎ ^13. In Anoxie, C. elegans tritt in einem reversiblen Zustand der verschobenen Animation, in der alle mikroskopisch beobachtbare Aktivität aufhört ^10. Die Tatsache, dass verschiedene physiologische Reaktionen treten bei unterschiedlichen Bedingungen unterstreicht die Bedeutung der mit experimenteller Kontrolle über die hypoxische Konzentration von O _2.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Konstruktion und Anwendung von Umweltmanagementsystemen Kammern, die zuverlässige und reproduzierbare hypoxischen Bedingungen produzieren mit definierten Konzentrationen von O _2. Der kontinuierliche Flow-Verfahren sorgt für eine schnelle Äquilibrierung der Kammer und erhöht die Stabilität des Systems. Zusätzlich kann die Transparenz undErreichbarkeit der Kammern ermöglichen eine direkte Visualisierung von Tieren, die auf Hypoxie ausgesetzt. Wir zeigen weiterhin, eine effektive Methode zur Ernte C. elegans Proben schnell nach Hypoxie, ist die Notwendigkeit, viele der schnell-umgekehrt Änderungen, die in Hypoxie ^10,14 auftreten, zu beobachten. Diese Methode stellt eine wesentliche Grundlage, die leicht für individuelle Bedürfnisse Labor, einschließlich verschiedener Modellsysteme und einer Vielzahl von Gasen kann geändert werden.

Protokoll

1. Bau von Klimakammern

1. Wählen Sie den kleinsten vernünftigen Volumen der Kammer für den Umfang des Projekts erforderlich sind. Kammer muss aus Gas (O ₂₎ undurchlässigen Material. Pyrex Kristallisation Gerichte, Anaeropack Boxen, oder große Stimmen-Acryl-Boxen (Ellard Instrumentation), verwendet werden kann. Wir haben festgestellt, dass 9 50 mm-Platten in einem 100 x 50 Kimex Kristallisationsschale passen. Glasplatten als Deckel für Pyrex Kristallisation Speisen verwendet werden.
2. Bohren Sie ein Loch in der ausgewählten Kammer und passen mit einem Kunststoff Luer zu Schlauchstutzen (Cole Parmer). Fittings können durch Rohrverschraubung oder mit Epoxy gesichert werden. Installieren eines ähnlichen Montage auf der gegenüberliegenden Seite des Behälters zu ermöglichen, um Gas zu fließen und aus der Kammer. Wenn möglich, ausgeglichen werden, um Löcher turbulente Mischung zu erhöhen.
3. Erhalten Druckgasbehältern mit definierten O _{2-Konzentrationen} (saldiert mit N _2), die Standard zertifiziert sind für O _{2 CO}ntent oder, für anoxische Bedingungen, reines N ₂ (<10 ppm O _2). Verwenden Sie automatische Umschaltung Regulatoren für längerfristige Studien zu verhindern, dass der Sauerstoffgehalt in den Kammern.
4. Organismus auf Hypoxie wurde gezeigt, dass temperaturabhängigen ¹⁵ sein. Rl die Kammer in einem Inkubator, können verschiedenen Temperaturen gehalten werden. Die Temperaturen in einem Inkubator kann ungleichmäßig und als solche, ist es ratsam, die Verwendung eines Temperatur-Datenlogger, um ständig die Temperatur im Inneren der Kammer zu machen.

2. Anschließen des Gas zu der Klimakammer

1. Für alle Verbindungen, verwenden Sie ein Achtel-Zoll-Außendurchmesser Schlauch entweder durch Schnappverbindungen oder Klemmringverschraubungen verbunden. Schlauch sollte undurchlässig und nicht reaktiv mit O _2, wie beispielsweise fluoriertes Ethylen-Propylen (FEP) oder Nylon (Cole Parmer). Für eine schematische Darstellung des Setup abgeschlossen, siehe Abbildung 1.
2. Verbinden Sie den COM-gedrückt Gastanks zu einer Absperreinrichtung, wie ein Mass Flow Controller (Sierra Instruments) oder Rotameter (Aalborg). Sicherstellen, dass vor dem Druck des Tanks innerhalb des Bereichs der Durchflußeinrichtung und die Schlauchtülle ist. Zwei-Stufen-Regler werden im Allgemeinen verwendet, mit der zweiten Stufe gesetzt, um den gewünschten Druck [Siehe Abschnitt drei zur Auswahl der geeigneten Flussrate]
3. Hydrat das Gas durch Blasenbildung durch destilliertes Wasser mit einer Gaswaschflasche mit Fritte Zylinder, dann direkt in einen der Anschlüsse auf der Klimakammer, so dass der zweite Beschlag offen für Gas-Ausstoß (siehe Abbildung 1). Für kurzfristige Studien, schützt gegen Feuchtigkeit Gas Platte Austrocknung, sondern Luftfeuchtigkeit Überwachung kann notwendig sein, für Langzeitstudien.
4. Dow Corning Vakuumfett verwendet, um die Kammer abzudichten. Platz Gewichte auf dem Deckel der Kammer, um sicherzustellen, eine luftdichte Abdichtung. Um einen dichten Abschluss und ausreichende Strömung zu bestätigen, halten Sie einen kleinen Pool von Wasser in der Handfläche von yunsere behandschuhten Hand auf die passende aus der Kammer auf und überprüfen Sie die Blasen.

3. Die Auswahl Durchfluss

1. Unter der Annahme, perfekte Mischung, gibt es 90% Gasaustausch der gasförmigen Atmosphäre jedes Mal das Volumen der Kammer Fassung (Fick-Gesetz) ist. Zum Beispiel in einem 100 ccm Kammer mit einer Flussrate von 100 cm ³ / min, wird das ursprüngliche Haus Luft in der Kammer mit 90% des von Ihnen gewünschten Gas nach 1 Minute ausgewechselt werden, und wird asymptotisch vollständigen Austausch von 90% pro Minute danach.
2. Höhere Fließgeschwindigkeiten und kleinere Behälter wird Ihre gewünschte Sauerstoffkonzentration schneller zu erreichen. Für 100 x 50 Kimex Containern (400 cc), einer Flussrate von 120 cm ³ / min erreicht 99,9% Austausch in 10 Minuten (3 Austausch). Diese Durchflussrate ist für die meisten Sauerstoff-Bedingungen. Nach unserer Kenntnis hat es nicht eine systematische Untersuchung, wie sich die Rate der Änderung der O _{2-Konzentration} beeinflusst die Reaktion in C. elegans.

1. Worms die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt häufig entkommen die Oberfläche der Agarplatten. Um dies zu verhindern, das einen Ring aus Palmitinsäure (10 mg / ml in Ethanol) um den Rand der Platten. Die Palmitinsäure wird aus der Lösung, wie die Ethanol verdampft und bildet eine physische Barriere. Palmitinsäure Barrieren wirken sich nicht auf Rate von Eier-und Fruchtbarkeit oder Lebensdauer in C. elegans ^16,17. Burrowing nicht häufiger auftreten in hypoxischen Bedingungen, so sind zusätzliche vorbeugende Maßnahmen in der Regel nicht erforderlich.
2. 1. Generieren Sie synchronisierten Populationen durch Bleichen graviden Erwachsenen in einem kleinen Tropfen alkalische Bleichmittel-Lösung auf ungesetzte Nematodenwachstum Media (NGM) Platten ^18. Im Gegensatz zu Standard-Großserienfertigung Hypochloritbleiche Protokolle, Pick 1-100 Tiere in einem Tropfen Bleichmittel-Lösung auf der Oberfläche eines NGM Platte, dann können die Bleichmittel-Lösung in die Platte aufnehmen
   2. Vermeiden Sie es, gebleicht Embryonen zu Hypoxie, da dies die Lebensfähigkeit ¹³ reduzieren können. Um jungen Embryonen (2-4 Zellen) zu sammeln, können trächtige Erwachsene in einer kleinen Menge Wasser mit einer Rasierklinge und Embryonen bewegt, um Platten mit dem Mund pipettieren für nachfolgende Exposition gegenüber Hypoxie gehackt werden.
3. Dichtungsplatten in der Klimakammer. Kontrolltiere sollte Normoxie (Haus Luft) bei der gleichen Temperatur wie behandelten Würmern zu halten. Es gibt keinen Unterschied zwischen beobachtbaren Proben im Haus Luft gelassen und diese in einem identischen Haus mit Kammer strömende Luft über ihnen aufrechterhalten. Initiieren Sie Gasfluss und pflegen Belichtung für die gewünschte Zeit. Um die Einheitlichkeit in der Rampe zu gewährleisten, achten Sie darauf,ersetzen Sie das Wasser in der Gaswaschflasche vor der Belichtung.
4. Zum Nachweis Überleben von Embryonen, können die Würmer für 48 h nach Rückkehr in Raumluft zu entwickeln, zu welchem ​​Zeitpunkt sie sollte vierten Larvenstadium / Tag Erwachsene. Ergebnis für das Überleben, Zensur keine Würmer, die nicht berücksichtigt werden können.
5. Mit Tieren in Kontakt, um eine Hypoxie zu visualisieren, zu bewegen Würmer zu einem Rückgang der M9 auf einem 22 mm ² Deckglas, und schwenken auf ein Kissen aus 2% Agarose in ^M9-18. Falls erforderlich, Levamisol (25 mM) oder Natriumazid (10 mM) als Anästhetikum verwendet. Natriumazid und Levamisol kann verwirren einige Beobachtungen aufgrund der Toxizität und sollte überlegt eingesetzt werden ^19.

5. Schnelle Ernte des Hypoxie-exponierte Worms (Beispiel: Vorbereitung von Proben für HIF-1 Western-Analyse)

Viele Hypoxie-induzierte Effekte sind schnell bei der Rückkehr in Raumluft umgekehrt, einschließlich der Wiederaufnahme der Eierproduktion ^12, die Phosphorylierung von mitotischen Epitopein der Embryogenese ¹³ und den Abbau des HIF-1-Protein ^9,20. Schnelle Isolierung von Tieren ausgesetzt Hypoxie ist erforderlich, um reproduzierbare Effekte in diesen Bedingungen zu erhalten. Mit diesem Setup können Tiere geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren in weniger als zwei Minuten. Während Handschuhfach Hypoxie Kammern für die Manipulation von Proben ermöglichen in anoxischen Bedingungen, beschränken ihre Kosten und Praktikabilität für die andere Bedingungen als Anoxie ihre Nützlichkeit.

1. Wachsen Bristol N2 Würmer auf 4 10 cm hohe Wachstumsraten (HG)-Platten, bis ein Großteil der Würmer graviden Erwachsenen sind ^18. Waschen Sie Würmer in ein 15 ml konischen Röhrchen, das eine 1:5 alkalische Bleichmittel-Lösung und Inkubation mit Rotation, bis Würmer zu lösen, nicht mehr als 5 Minuten ⁹ beginnen. Waschen Sie die Würmer dreimal mit M9, Abzentrifugieren bei 1500 xg zwischen jedem Waschen ohne Bremsen.
2. Platte gebleichten Embryonen auf 8 150 mm NGM-Platten und ermöglichen auf L4-Larven (~ 48 Stunden für Bristol N2 bei 22 ° C) zu entwickeln.Bewegen Platten zu Klimakammern und entlarven zu hypoxischen (1.000 ppm, 5.000 ppm) und anoxische (N2) Bedingungen für 4 Stunden. Die Belichtungszeiten werden je nach Versuchsaufbau variieren. Während der Exposition gegenüber Hypoxie hat eine unmittelbare Auswirkung auf Rate der Eiablage, zwei Zell-Embryonen nach 16-18 Stunden der Exposition ¹² sterben. Mit diesem Aufbau Hypoxie Kammer wird der untere Grenzwert für die Belastung durch die Geschwindigkeit der Atmosphärenaustausch bis das Gleichgewicht erreicht beschränkt.
3. Beschriften Sie ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen und eine 15 ml konischen Röhrchen für jede experimentelle Probe. Würmer ausgesetzt Hypoxie eher zu den Seiten des Rohres während der Ernte zu halten. Um dies zu verhindern, Platz 100 ul 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in den einzelnen 15 ml konischen Röhrchen. Wenn SDS inhibiert Downstream-Anwendungen, Rinderserumalbumin (BSA) verwendet Festsitzen zu verhindern werden. Der routinemäßige Einsatz von SDS oder BSA scheint nicht eine scheinbare Unterschied haben. In 50 ul 2x Protein Loading-Farbstoff (4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol und einverfolgen Bromphenolblau in 30% Glycerin (w / v)) in den 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werfen Sie einen Dewar mit flüssigem Stickstoff bereit.
4. Zeit die Schritte nach dem Entfernen der Würmer von Hypoxie und aufzeichnen. Nehmen Sie den Deckel auf die Hypoxiekammer, nehmen Sie eine Probe Platte, und verschließen die Kammer. Verwenden Sie destilliertes Wasser, um die Würmer auf eine Nylon-Filter waschen und gießen Sie dann in das 15 ml konischen Röhrchen. Drehen Sie die Würmer, die in einem Desktop-Zentrifuge bei 1500 xg für 15-20 Sekunden mit Bremse.
5. Verwendung eines Vakuums an die meisten der aus dem Glas zu entfernen, wobei die Schnecke Pellet unberührt.
6. Mit einer Pipette, bewegen Sie den Wurm Pellet in 50 ul auf die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die Tube und tauchen Sie ein in flüssigem Stickstoff.
7. Wiederholen, bis alle Proben isoliert worden. Befolgen Sie diese Verfahren für die Stallluft Kontrollproben für Konsistenz. Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden

6. Repräsentative Ergebnisse

Organismal Effekte von Hypoxie zu sehendurch Prüfung der Realisierbarkeit bis zum Erwachsenenalter von C. elegans (Abbildung 2). Embryonen, die durch Wildtyp-Bristol (N2) und HIF-1 (IA04) Deletionsmutanten gelegt sind alle im Haus Luft O _{2-Konzentrationen} (210.000 ppm O ₂₎ zu überleben. N ₂ Würmer sind in der Lage, sich anzupassen und Erwachsenenalter überleben in 5.000 ppm O _2, während HIF-1-Embryonen nicht lebensfähig sind. Dies zeigt, dass HIF-1 essentiell für die Anpassung an die wechselnden Konzentrationen von Sauerstoff in der Umgebung ¹⁰ ist. Weder noch N2 HIF-1-Tiere können überleben Exposition gegenüber 1.000 ppm O _2.

Visualisierung Wurm direkt in Hypoxie ist machbar mit der Verwendung eines Binokular und durchsichtigen Behälter (Abbildung 3). Durch die direkte Platzierung der Hypoxie Kammer auf der Binokular, gibt es keine Notwendigkeit, die Würmer aus Hypoxie Organismen zu entfernen, Reaktionen zu beobachten. Der Umfang kann mit Fluoreszenz-Flatscreen ausgestattet werden (wie in Abbildung 3

Abbildung 1. Beispiel Hypoxie Kammer. Richtung der Gasströmung durch Pfeile angedeutet. Das Gas wird in Druckgasbehältern mit definierten O _{2-Konzentrationen} (1) und einer Zweistufen-Druckregleranordnung befestigt ist (2) gespeichert. Gas tritt in den Boden des Strömungsrohrs (3), beim Verlassen des an der richtigen Strömungsrate. Gas strömt dann in die Blase Kolben (4), Hydratisieren des Gases (die korrekte Verbindung der Blase Kolben durch Beobachtung Blasen). Hydratisierte Gas strömt dann in die Kammer bei der Hypoxie Zuflussventilmechanismus (5), Aussetzen der Proben auf Hypoxie. Das Gas schließlich Öffnungen in den Raum durch eine Auslassloch in der Kammer gebohrt.

Abbildung 2. Die Lebensfähigkeit von Embryonen ausgesetzt bis 1.000 ppm O _2, 5000 ppm O _2). Embryonen wurden jeweils Sauerstoffgehalt als Embryonen für 24 Stunden in einem kontinuierlichen Fluß Sauerstoffkammern ausgesetzt. Worms wurden normoxischen Bedingungen, dürfen bis zum Erwachsenenalter für 48 Stunden entwickeln bewegt, und dann trafen für die Lebensfähigkeit bis zum Erwachsenenalter. n> 50, n = 5.

Abbildung 3. Visualisierung von C. elegans in Hypoxie mit Mikroskopie. Worms sind auf die Hypoxie mit den beschriebenen Methoden ausgesetzt. Die transparente Klimakammer (gebaut mit einer Pyrex Kristallisierschale und Glasplatte) wird direkt auf der Bühne eines Binokular gelegt. Zwei Ansichten werden gezeigt, darunter die gesamte ein Gasstrom einrichten, die andere nur mit der Kammer auf dem Mikroskoptisch.

Diskussion

Dieses Verfahren stellt eine Strategie zur Konstruktion einer hypoxischen Umgebung, die für Umgebungen mit präzisen Konzentrationen von Sauerstoff, der im Labor gehalten werden können. Diese Kammern bieten eine einfache Methode zur Belichtung von Organismen auf bestimmte niedrige Konzentrationen von O ₂ und die Überwachung der molekularen und physiologischen Ausgänge. Die Klimakammer beschrieben wird durch das Labor statt im Handel erworben und können so modifiziert werden, um die Bedürfnisse des Experiments ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Schlauch (FEP und PTFE)	Cole Parmer Tygon	YO-95821-00 (1/8 "FEP) 06.605 bis 27 (1/16 x 1/8 "PTFE)" R-3603
Klemmringverschraubungen	Seattle Fluid Systems	06.363 bis 58 (M. Koppler 1/16 ") 06.363-62 (F-Koppler 1/16 ") 06.363 bis 60 (M. Koppler 1/8 ") 06.363-61 (F-Koppler 1/8 ")
Messkonus	Aalborg	PMR3-010073 (3 Ausgang) PMR1-013520 (1 Ausgang)
Mass Flow Controller	Sierra Instruments	810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2)
Druckgasbehälter	Airgas	Auf Bestellung
Kunststoff Luer zu Schlauchtülle	Cole Parmer	45505-41 (Serie 500 1/16 ")
Gegossenes Acrylglas-Boxen	Ellard Instrumentation	Auf Bestellung
Rohrverbindungsstücke (Messing oder Edelstahl)	Seattle Fluid Systems	B-402-1 (1/4 "Überwurfmutter) B-200-3 (1/8 "T-Stück) B-400-Set (1/4 "Aderendhülsen) B-QM2-B1-200 (QM Körper QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "male conn)
Dow Corning Vakuumfett	Sigma-Aldrich	Z273554
AnaeroPack Box	Misubishi Gas Chemical Company	R684004 (0,4 Liter) R685025 (2,5 Liter) R685070 (7,0 Liter)
Pyrex Gaswaschflasche	Sigma-Aldrich	CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml)
Palmitinsäure	Sigma-Aldrich	P0500
Ziege anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase	Southern Biotechnology Associates	1032-05
SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrat	Pierce Chemical	34077
100 x 50 Glaskristallisationsverfahren Gerichte	Kimax Kimble	23000