Die vorliegende Arbeit zeigt wie man mit kontinuierlichem Fluss Hypoxie Kammern zu verwenden, um Atmosphären mit definierten Konzentrationen von O generieren 2, Um biologische Reaktionen zu verstehen, um sank O 2. Dieses System ist einfach einzurichten und zu pflegen, und flexibel genug, um eine breite Palette von O anpassen 2 Konzentrationen und Modellsysteme
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Methodenartikel
Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Sauerstoff ist für alle Metazoen, um zu überleben, mit einer Ausnahme 1 bekannt. Verminderte Verfügbarkeit von O 2 (Hypoxie) kann Verlauf einer Krankheit, eine normale Entwicklung oder Änderungen der Umgebungsbedingungen 5.2 entstehen. Das Verständnis der zellulären Signalwege, die bei der Reaktion auf Hypoxie beteiligt sind, konnten neue Einblicke in die Behandlungsstrategien bieten für unterschiedliche menschliche Erkrankungen, Schlaganfall, Krebs aus. Dieses Ziel wurde behindert, zumindest teilweise, durch technische Schwierigkeiten mit kontrollierter hypoxische Exposition in genetisch zugänglich Modell-Organismen verbunden sind.
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ideal als Modellorganismus für das Studium der hypoxischen Reaktion geeignet, da sie einfach zu kultivieren ist und genetisch zu manipulieren. Darüber hinaus ist es möglich, die zellulären Reaktionen auf spezifische hypoxischen O 2-Konzentrationen, ohne Verwechslung wirksam, da C zu studieren elegans erhalten O 2 (und andere Gase) durch Diffusion, um eine erleichterte Atemwege 6 gegenüber. Faktoren bekannt, in der Reaktion auf Hypoxie beteiligt sind in C. erhalten elegans. Die tatsächliche Reaktion auf Hypoxie hängt von der spezifischen Konzentration von O 2 erhältlich ist. In C. elegans, Hypoxie mäßig einen Transkriptions-Reaktion vermittelt wesentlich durch HIF-1 löst, erfordert die hoch-konservierten durch Hypoxie induzierbare Transkription Faktor 6-9. C. elegans Embryonen HIF-1 in 5.000-20.000 ppm überleben O 2 7,10 . Hypoxie ist ein allgemeiner Begriff für "weniger als normale O 2". Normoxie (normale O 2) können auch schwer zu definieren. Wir betrachten in der Regel Raumluft, die 210.000 ppm O 2 zu Normoxie zu sein. Es hat sich jedoch gezeigt, dass C elegans hat eine Präferenz für Verhaltens-O 2-Konzentrationen von 5 bis 12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. In larvae und Erwachsene, hif-1 wirkt, um Hypoxie-induzierte Diapause 5000 ppm O 2 12 zu verhindern. Allerdings ist hif-1 keine Rolle in der Antwort auf eine niedrigere Konzentration von O 2 (Anoxie, Arbeitsdefinition <10 ppm O 2) 13. In Anoxie, C. elegans tritt in einem reversiblen Zustand der verschobenen Animation, in der alle mikroskopisch beobachtbare Aktivität aufhört 10. Die Tatsache, dass verschiedene physiologische Reaktionen treten bei unterschiedlichen Bedingungen unterstreicht die Bedeutung der mit experimenteller Kontrolle über die hypoxische Konzentration von O 2.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Konstruktion und Anwendung von Umweltmanagementsystemen Kammern, die zuverlässige und reproduzierbare hypoxischen Bedingungen produzieren mit definierten Konzentrationen von O 2. Der kontinuierliche Flow-Verfahren sorgt für eine schnelle Äquilibrierung der Kammer und erhöht die Stabilität des Systems. Zusätzlich kann die Transparenz undErreichbarkeit der Kammern ermöglichen eine direkte Visualisierung von Tieren, die auf Hypoxie ausgesetzt. Wir zeigen weiterhin, eine effektive Methode zur Ernte C. elegans Proben schnell nach Hypoxie, ist die Notwendigkeit, viele der schnell-umgekehrt Änderungen, die in Hypoxie 10,14 auftreten, zu beobachten. Diese Methode stellt eine wesentliche Grundlage, die leicht für individuelle Bedürfnisse Labor, einschließlich verschiedener Modellsysteme und einer Vielzahl von Gasen kann geändert werden.
Protokoll
1. Bau von Klimakammern
- Wählen Sie den kleinsten vernünftigen Volumen der Kammer für den Umfang des Projekts erforderlich sind. Kammer muss aus Gas (O 2) undurchlässigen Material. Pyrex Kristallisation Gerichte, Anaeropack Boxen, oder große Stimmen-Acryl-Boxen (Ellard Instrumentation), verwendet werden kann. Wir haben festgestellt, dass 9 50 mm-Platten in einem 100 x 50 Kimex Kristallisationsschale passen. Glasplatten als Deckel für Pyrex Kristallisation Speisen verwendet werden.
- Bohren Sie ein Loch in der ausgewählten Kammer und passen mit einem Kunststoff Luer zu Schlauchstutzen (Cole Parmer). Fittings können durch Rohrverschraubung ....
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Diskussion
Dieses Verfahren stellt eine Strategie zur Konstruktion einer hypoxischen Umgebung, die für Umgebungen mit präzisen Konzentrationen von Sauerstoff, der im Labor gehalten werden können. Diese Kammern bieten eine einfache Methode zur Belichtung von Organismen auf bestimmte niedrige Konzentrationen von O 2 und die Überwachung der molekularen und physiologischen Ausgänge. Die Klimakammer beschrieben wird durch das Labor statt im Handel erworben und können so modifiziert werden, um die Bedürfnisse des Experiments .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Mitglieder der Miller-Labor für die Diskussion und die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem New Investigator Award von der Nathan Shock Center of Excellence in der Basic Biologie des Alterns zu DLM und den National Institutes of Health Award R00 AG030550 zu DLM unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
| Schlauch (FEP und PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8 "FEP) 06.605 bis 27 (1/16 x 1/8 "PTFE)" R-3603 | |
| Klemmringverschraubungen | Seattle Fluid Systems | 06.363 bis 58 (M. Koppler 1/16 ") 06.363-62 (F-Koppler 1/16 ") 06.363 bis 60 (M. Koppler 1/8 ") 06.363-61 (F-Koppler 1/8 ") | |
| Messkonus | Aalborg | PMR3-010073 (3 Ausgang) PMR1-013520 (1 Ausgang) | |
| Mass Flow Controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Druckgasbehälter | Airgas | Auf Bestellung | |
| Kunststoff Luer zu Schlauchtülle | Cole Parmer | 45505-41 (Serie 500 1/16 ") | |
| Gegossenes Acrylglas-Boxen | Ellard Instrumentation | Auf Bestellung | |
| Rohrverbindungsstücke (Messing oder Edelstahl) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4 "Überwurfmutter) B-200-3 (1/8 "T-Stück) B-400-Set (1/4 "Aderendhülsen) B-QM2-B1-200 (QM Körper QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "male conn) | |
| Dow Corning Vakuumfett | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack Box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0,4 Liter) R685025 (2,5 Liter) R685070 (7,0 Liter) | |
| Pyrex Gaswaschflasche | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml) | |
| Palmitinsäure | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Ziege anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrat | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 Glaskristallisationsverfahren Gerichte | Kimax Kimble | 23000 |
Referenzen
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Ce....
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Nachdrucke und Genehmigungen
