Method Article

C. elegans Tracking und Behavioral Measurement

DOI:

10.3791/4094

⸱

November 17th, 2012

 ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, 3Okinawa Institute of Science and Technology, 4Department of Physics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben ein Video-Rate Tracking Mikroskop-System aufzeichnen und quantifizieren können entwickelt C. elegans Verhalten bei hoher Auflösung und hohen Geschwindigkeiten. Wir haben auch Rechenverfahren, um die Dimensionalität der Schnecke Bilder auf einen grundlegenden Satz von Messungen, die vollständig beschreiben die Form der Schnecke, entwickelt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben Instrumente, Bildverarbeitung und Datenanalyse-Techniken entwickelt, um die motorischen Verhalten von C. Quantifizierung elegans, wie es auf der Oberfläche einer Agarplatte kriecht. Für die Untersuchung der genetischen, biochemischen und neuronalen Grundlagen von Verhalten, C. elegans ist ein idealer Organismus, da sie genetisch gefügig, zugänglich Mikroskopie ist, und zeigt eine Reihe von komplexen Verhaltensweisen, einschließlich Taxis, Lernen und soziale Interaktion 1,2. Verhaltensanalyse auf das Verfolgen der Bewegungen der Würmer wie sie kriechen auf Agarplatten Basis haben sich als besonders nützlich bei der Untersuchung von sensorischen Verhalten 3, Fortbewegung 4 und 5 allgemein Mutations Phänotypisierung. Unser System funktioniert, indem die Kamera und Beleuchtungssystem die Würmer kriecht auf einer stationären Agarplatte, die keine mechanischen Reiz auf die Schnecke übertragen wird gewährleistet. Unser Tracking-System ist einfach zu bedienen und enthält eine semi-automatische Kalibrierung. Ein challenge aller Video-Tracking-Systeme ist, dass es eine enorme Menge an Daten, die intrinsisch hohe Dimensionsstabilität ist, erzeugt. Unsere Bildverarbeitung und Datenanalyse-Programme befassen sich mit dieser Herausforderung, indem die Würmer Form in einer Reihe von unabhängigen Komponenten, die umfassend rekonstruieren die Würmer Verhalten als Funktion von nur 3-4 Abmessungen 6,7. Als ein Beispiel für den Prozess gezeigt, dass die Schnecke und Auswurf aus deren Umkehrung Zustand in einer Phase spezifischen Weise.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein. Beschreibung von Tracking-Mikroskop

  1. Eine Agarplatte wird durch eine Faser-Lichtquelle beleuchtet und abgebildet mit einer Kamera. Dieses System wird auf einen X, Y Translationstisch montiert ist.
  2. Die Stufe wird durch Standard-Schrittmotoren, die mit einem Schrittmotor-Controller verbunden bewegt werden.
  3. Der Controller und die Kamera mit dem Computer verbunden ist und durch individuelle Programme in LabVIEW geschrieben.
  4. Die Kamera Bilder der Oberfläche einer Agarplatte und identifiziert dunkle Objekte auf einem hellen Hintergrund.
  5. Die Bildqualität wird so eingestellt, dass Computerprogramm kann Objekte in Echtzeit zu quantifizieren. Die Verstärkung, der Helligkeit und Verschlußzeit der Kamera eingestellt werden, um einen dunklen Objekts auf einem weißen Hintergrund zu liefern.
  6. A Eichmarke für die automatische Kalibrierung wird durch Stossen die Agar-Oberfläche mit einem Wurm Pick gemacht.
  7. Die gefilterten binären Bildes, das durch den Tracking-Programm verwendet wird, kann geprüft werden.
  8. Die software hat eine Auto-Kalibrierung Funktion, die Kalibriermatrix berechnet, indem ein Testobjekt einen festen Abstand.
  9. Abstände in Pixeln zu den Schritten von dem Schrittmotor durch die Kalibrierungsmatrix genommen kalibriert.
  10. Nach der Kalibrierung ist das System bereit zu gehen und muss nicht neu kalibriert werden, wenn die Vergrößerung verändert wird oder wenn die Kamera neu positioniert.

2. Vorbereiten Spurplatten und C. elegans für Tracking

  1. Ein Kupfer-Ring wird verwendet, um die Würmer corral und halten sie von der Migration auf die Kante der Platte. Das Kupfer stellt eine lokale chemische Barriere und beeinflusst nicht die Bewegung der Schnecke sonst für die Dauer des Experiments (<1 h). Heizen Sie den Ring zuerst, indem sie auf einem Heizblock oder gleichwertig.
  2. Muffel auf eine frische Agarplatte (1,7% Bacto Agar, 0,25% Bacto-Pepton, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM Kaliumphosphatpuffer, 5 pg / mlCholesterin), und drücken Sie leicht nach unten, um es in der Agar-Oberfläche einbinden.
  3. Wählen L4 Bühne oder jungen erwachsenen Würmer auf eine Agarplatte mit einigen NGM-Puffer (0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM Kaliumphosphatpuffer) gefüllt, um sie von Speiseresten zu waschen. Lassen Sie die Würmer schwimmen für ein paar Minuten.
  4. Vorsichtig eine einzige Schnecke auf das Tracking Platte nahe der Mitte des Rings. Und legen Sie dann die Platte auf dem Wurm-Tracker.

3. Worm-Tracking

  1. Führen Sie das LabVIEW-Programm und wählen Sie Optionen, wenn nötig (Speicherort für Bilder, Arten von Abbildungen, Maße, Kamera-Einstellungen).
  2. Mit dem Joystick das Mikroskop bis ein Bild des Wurms ist im Sichtfeld (Computer-Bildschirm). Drücken Sie auf "Track", um die Tracking-Programm engagieren.
  3. Das Computerprogramm misst direkt die Bewegungen eines binären gefilterten Bilder wie gezeigt und können Messungen über dieses Bild in Echtzeit zu machen
  4. Achterner Verfolgen einer Rekonstruktion der globalen Bewegungsbahn aus den Schrittmotor Bewegungen ausgeführt werden, während die lokalen Formänderungen der Schnecke im Detail gesehen werden kann.

4. Data Analysis

  1. Führen Skelettieren script (MATLAB) des Wurms Formen parametrieren. (Abbildung 2)
  2. Berechnen Eigenmoden der skelettierten Daten. (Abbildung 3,4)
  3. Zeigen Abbildung 5. Lesen Figur Legende oder repräsentative Ergebnisse.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beispiel: bei der Futtersuche, C. elegans Übergänge von vorwärts auf rückwärts Bewegung, oft Durchführung einer Neuorientierung (omega Umdrehung) vor der Rückkehr in die Vorwärtsbewegung Zustand. Quantifizierung dieser Übergang ist für das Verständnis der Nahrungssuche Bewegungsmuster und auch in der Wurm-Motorsteuerung wichtig. Die Befugnis zur subtilen Details der Fortbewegung Verhalten zeigen, zu sehen mit unseren Tracker-Gerät werden.

Als Beispiel betrachten wir die vorwärts auf...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie der Fortbewegung und natürliches Verhalten erfordert nicht-invasive Tracking-Techniken in den Partnerländern mit Datenreduktion Techniken. Hier haben wir eine einfache gezeigt, dass Tracking-System, das detaillierte Bilder von C. Datensätze verwenden elegans Verhalten, wie es auf der Oberfläche einer Agarplatte kriecht. Die Menge der Informationen in diesen Bildern enthalten ist riesig und High-dimensional, und so haben wir auch Methoden, um die Dimensionalität der Daten in nur vier grundleg...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Name des Teils Firma Katalog-Nummer Kommentare (optional)
CCD-Kamera Basler A601f
Objektiv Edmund Optics MMS-Serie
Fiber Beleuchtung Dolan Jenner DC-950H
Übersetzung der Bühne Deltron LS3-4
Stepper Motor US Digital MS23C
Schrittmotorantrieb Gecko G201
Schrittmotorsteuerung SimpleStep SSXYZ
Alle Programmcode vorhanden ist. Bitte senden Sie eine Anfrage E-Mail an den entsprechenden Autor.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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