Dünndarmtransplantation hat sich zu einem anerkannten Behandlungsoption für Patienten mit irreversiblen intestinalen Versagen. Unsere experimentellen Modell der orthotopen Dünndarm Transplantation in Ratten dient als zuverlässiges Werkzeug, um zugrunde liegenden immunologischen und entzündlichen Prozessen, die Darmtransplantatempfängern erschweren anzugehen.
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Methodenartikel
Orthotopen Dünndarm Transplantation in Ratten
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dünndarmtransplantation hat sich zu einem anerkannten klinischen Option für Patienten mit Kurzdarmsyndrom und Misserfolg der parenteralen Ernährung (irreversible intestinalen Versagen). In spezialisierten Zentren verbesserten operativen und Management-Strategien haben hervorragende kurz-und mittelfristig Patient und Transplantat-Überlebens geführt, während eine hohe Lebensqualität 1,3. Anders als in den häufigeren Transplantation anderer solider Organe (dh Herz, Leber) viele zugrunde liegenden Mechanismen der Graft-Funktion und immunologischen Veränderungen durch Darmtransplantatempfängern induziert werden nicht vollständig bekannt 6,7. Folgen der akuten Abstoßung, Sepsis und chronischen Graft Scheitern sind die Haupthindernisse noch einen Beitrag zu weniger günstigen Langzeitergebnisse und behindern eine weitere Verbreitung der Beschäftigung des Verfahrens trotz einer wachsenden Zahl von Patienten nach Hause parenterale Ernährung, die potenziell von einer solchen Transplantation profitieren würden. Der Dünndarm enthälteine große Anzahl von Passagieren Leukozyten gemeinhin als Teil des darmassoziierten Lymphsystem (GALT) diese als Teil der Grund für die hohe Immunogenität des intestinalen Transplantats. Das Vorhandensein und die Nähe vieler Kommensalen und Krankheitserreger im Darm erklärt die Schwere der Sepsis Folgen einmal Pfropf mukosalen Integrität beeinträchtigt wird (zum Beispiel durch Abstoßung). Um das Feld der Darm-und Multiorganversagen Transplantation mehr Daten aus zuverlässigen und machbar Tiermodelle generiert voranzutreiben benötigt wird. Das Modell hier bereitgestellten vereint die Zuverlässigkeit und Machbarkeit einmal in einer standardisierten Art und Weise aufgebaut und können wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden komplexen molekularen, zellulären und funktionellen Mechanismen, die durch Darmtransplantatempfängern ausgelöst werden liefern. Wir haben erfolgreich eingesetzt und verfeinert die beschriebene Vorgehensweise über mehr als 5 Jahre in unserem Labor 8-11. Die JoVE video-basiertes Format ist besonders nützlich, um die komplexe Verfah demonstrierenDure und vermeiden anfängliche Stolpersteine für Gruppen planen, eine orthotopen Tiermodell untersucht Darmtransplantatempfängern etablieren.
Protokoll
Ein. Donor Betrieb
- Der Spender Ratte sollte gehalten Fasten für 24 Stunden (freier Zugang zu Wasser / Glucose-Lösung) werden.
- Um Isofluran Inhalationsnarkose zu induzieren, mit 2% auf Standard-Zerstäuber beginnen und dann zu reduzieren, um 1% nach Durchführung Laparotomie. Führen Sie einen Zeh Prise zu Sedierung zu überprüfen.
- Shave den Bauch und reinigen mit der Haut prep 3 mal (Kodan). Führen Sie anschließend einen Medianschnitt nach subkutaner Verabreichung des Schmerzmittels.
- Nachdem das Transplantat in Kochsalzlösung getränkter Gaze gehüllt wird, trennen die physiologische Adhäsionen zwischen der Bauchspeicheldrüse und des Colon ascendens vorsichtig mit einem Q-Tip (unter dem Operationsmikroskop mit 6-fache Vergrößerung).
- Ligieren und teilen die ileocecal & Recht & colica Schiffe mit 7-0 Seide. Nach dem Colon ascendens wird auf der rechten Seite der V. mesenterica superior (SMV) zu verbreiten, können die ileocecal, rechts und colica Schiffe für die Ligation und Division mit 7-0 Verbindungen identifiziert werden.
- Einfahren des Magens aufwärts, so dass die gesamte SMV durchgeführt wird und begradigt ausgesetzt. Verwenden Sie eine Mücke Klemme für den Rückzug. Die Klammer wird durch Knete Masse in Form ausgebildet, wie nötig gehalten.
- Ligieren und teilen die pankreatiko-Zwölffingerdarm-Adern aus der SMV. Alle kleinen pankreatiko-Zwölffingerdarm-Adern, die aus der SMV sorgfältig ermittelt werden, ligiert mit 7-0 Seide und geteilt, bevor das Pankreasgewebe aus dem Transplantat entfernt werden kann.
- Ligieren und teilen die verlieren Bindegewebe einschließlich aller Lymphgefäße zwischen der SMV und der Bauchaorta. Mit dem Transplantat noch auf der rechten Seite des Bauches, verlieren das Bindegewebe einschließlich aller Lymphgefäße zwischen der SMV und der Bauchaorta zugänglich ist. Dieses Bindegewebe muss ligiert mit 7-0 Seide und geteilt, um postoperative lymphorrhea aus dem Darm Transplantat zu vermeiden.
- Ligieren und teilen die rechte Nierenarterie. Nachdem das Bindegewebe wird geteilt, wird die rechte Nierenarterie accessible und ligiert und durchtrennt mit 7-0 Seide.
- Systemisch heparinise die Ratte mit 200 Einheiten Heparin iv über den Penis Vene.
- Ligieren der marginalen Arterien, und teilen den Dünndarm an der duodeno-jejunal Kreuzung und am terminalen Ileum.
- Die Aorta wird proximal zum Ursprung des SMA ligiert. Die Pfortader liegt am Zusammenfluss mit dem Milzvene durchtrennt. Dann wird das Transplantat mit seinen Gefäßstiel bestehend aus den SMA mit einem Aortasegment geerntet.
2. Backtable Procedure
- Perfundieren das Transplantat mit 3 ml der University of Wisconsin-Lösung (UW) bei 4 ° C über die Aorten-Leitung und bewässern das Darmlumen aus dem Jejunum Ende mit 30 ml Uro-Nebacetin N-Lösung bei 4 ° C (Lumen Bewässerung ist obligatorisch) .
Unmittelbar nach Gewinnung des Transplantats ist die Aorta Leitung für Perfusion mit 3 ml gekühltem UW-Lösung verwendet. Dazu wird eine 20 G iv Katheter aufeine 10 ml Spritze verwendet. Das Perfusat beobachtet werden, um frei abfließen aus dem geteilten Pfortader werden. Für die Darmspülgerät mit Nebacetin wird eine 50 ml Spritze verwendet.
- Bewahren Sie das Transplantat in UW-Lösung bei 4 ° C während der Vorbereitung des Empfängers.
3. Empfänger Betrieb
- Der Empfänger Ratte sollte gehalten Fasten für 24 Stunden (freier Zugang zu Wasser / Glucose-Lösung) werden.
- Um Isofluran Inhalationsnarkose zu induzieren, mit 2% auf Standard-Zerstäuber beginnen und dann zu reduzieren, um 1% nach Durchführung Laparotomie. Führen Sie einen Zeh Prise zu Sedierung zu überprüfen.
- Shave den Bauch und reinigen mit der Haut prep 3 mal (Kodan). Führen Sie anschließend einen Medianschnitt nach subkutaner Verabreichung von Carprofen 5 mg / kg sc zur intraoperativen Analgesie.
- Wickeln Sie den Empfänger Darm in normaler Kochsalzlösung getränkten Gaze und legen Sie es auf der Empfängerseite Brust.
- Öffnen Sie die Retroperitoneum unverblümt mit Q-Tips, und setzen die abdominal Aorta und Vena cava inferior knapp unterhalb der renalen Gefäße bis auf die Ebene der lliakalgefäße gegebenenfalls auch Mikroschere. Ligieren die kleinen Lenden-und Wirbelsäulen-tribuaries aus der Aorta und Vena cava mit 7-0 Seide Blutverlust zu vermeiden. (Um dies zu tun, ändern das Operationsmikroskop zoom zu 16x).
- Kreuzklemme die Aorta und die IVC unterhalb der linken Nierengefäße proximal und oberhalb der Bifurkation iliaca distal mit Mikrogefäßzellen Clips. Nur eine Klemme proximal als auch gebrauchte distal beide Schiffe gleichzeitig zu spannen. Einschneiden beide Schiffe nach vorn mit einem microknife und auswaschen restlichen Blut.
- Erstellen einer Ende-zu-Seite-Anastomose zwischen dem Transplantat Aortasegment und die des Empfängers infrarenalen Aorta unter Verwendung einer kontinuierlichen Naht Prolene 10-0 .. Zunächst wird das Transplantat auf der rechten Seite des Bauches (der Kopf der Ratte bei 12 Uhr positioniert), um die Rückwand Maschen der arteriellen Anastomose und binden der unteren Haltefaden durchführen platziert. Then, wird das Transplantat auf die linke Seite des Bauches (der Kopf der Ratte bei 9 Uhr positioniert) zu entlarven und zu vernähen die Vorderwand der Anastomose eingeschaltet.
- Eine Ende-zu-Seite-Anastomose zwischen dem Transplantat Pfortader und des Empfängers IVC wird ebenfalls durch laufende Fäden mit 10-0 Prolene durchgeführt. Mit der Ratte noch Seitenlage (Kopf in 9-Uhr-Position), wird das Transplantat auf der linken Seite des Bauches positioniert und eine untere Haltefaden platziert ist. Die Anastomose mit der Rückwand von der Innenseite des Behälters begonnen. Nachdem der untere Haltefaden gebunden ist, können die Vorderwand Maschen von außen durchgeführt werden.
- Entfernen Sie die distale Klemmen ersten, durch die oberen Klammern gefolgt. Jede Anastomosen Blutung durch direkten Druck mit Q-Tips gesteuert. Das Transplantat sollte für gleiche und schnelle Reperfusion überprüft werden.
- Resezieren des gesamten Empfängers Dünndarm nach Ligation der Mesenterialgefäße. Empfänger unterziehen Wert Enterektomie, Erhaltung 2-3 cm proximal Jejunum und 1 cm des distalen Ileum.
- Wiederherstellen enterischen Kontinuität durch proximale (Jejuno-Jejunostomie) und distalen (Ileo-Ileostomie) Ende-zu intestinalen Anastomosen mit einem Ein-Schicht unterbrochen Nahtmaterial mit 6-0 Monocryl enden. Etwa 16 Nähte erforderlich sind, um die Anastomosen abzuschließen.
- Spülen Sie die Bauchhöhle mit physiologischer Kochsalzlösung, bis sie sauber. Verabreichen 2 ml physiologischer Kochsalzlösung intraperitoneal für Fluid Ersatz. Dann schließen Sie den Bauch mit einer fortlaufenden Naht mit 3-0 Vicryl für die Muskel-Schicht plus einer kontinuierlichen Hautnaht.
- In der postoperativen Phase die Ratten sollten aufbewahrt Fasten (mit Zugang zu Wasser und Glucose-Lösung) für weitere 24 Stunden neu gestartet auf Standard-Rattenfutter und Wasser ad libitum. Analgesie mit Carprofen sollte für 3 Tage (siehe Dosierung unten) verabreicht werden.
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Ergebnisse
Normale postoperative Verlauf
Die transplantierten Tiere sollten schnell wieder aus dem Verfahren unter einer Wärmelampe für ca. 1 Stunde. Unterkühlung ist eine der Hauptursachen für postoperative Mortalität und sollte sorgfältig vermieden intra-und postoperativ. Intraoperative Flüssigkeitsverluste müssen durch sc Injektion von 2,5 ml Kochsalzlösung plus 2,5 ml Glucose 5% pro 8 Stunden für die ersten 24 Stunden ersetzt werden. Die Ratten sollten auch freien Zugang zu Glucose-Lösung (oder Gel Er...
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Diskussion
Während Darm-Transplantation Modellen an Ratten bereits haben, wie in den 1970er Jahren 5 beschrieben worden meisten der kürzlich verwendeten Modelle beinhalten heterotope Darmtransplantatempfängern mit verschiedenen Techniken 13. Während die heterotope Verfahren im Allgemeinen den Vorteil der leichteren mikrochirurgischen Techniken und leichter Zugänglichkeit des Transplantats für die Beurteilung haben, hat heterotope Darmtransplantatempfängern den großen Nachteil, der nicht unter Berücksichtigung...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| University of Wisconsin (UW)-Lösung (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Uro-Nebacetin N Lösung | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicillin | Ratiopharm | ||
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Prolene 10-0 unresorbable Nahtmaterial | Ethicon | ||
| Monocryl 6-0 resorbierbaren Nahtmaterial | Ethicon | ||
| Vicryl 3-0 resorbierbaren Nahtmaterial | Ethicon | ||
| iv Katheter G 20 1.1x33 mm | Braun | ||
| iv Katheter G 22 0.9x25 mm | Braun | ||
| Kodan Skin Prep | Schülke | ||
| NaCl 0,9% Infusionslösung | Braun | ||
| Gebogene Pinzette kleine | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Micro Pinzette gebogen | AESCULAP | BD 333 | |
| Micro Pinzette gebogen | AESCULAP | FD281R | |
| Micro Pinzette gerade 1 | WPI | 5 | |
| Micro Pinzette gerade 2 | WPI | 2 | |
| Micro Nadelhalter | WPI | 14081 | |
| Micro Schere | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Mikroskalpell | MANI | Ophthalmic Messer | |
| Micro Klemmen | AESCULAP | FB329R |
Referenzen
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- Zhao, Y., et al. The establishment of a new en bloc combined liver-small bowel transplantation model in rats. Transplant. Proc. 39 (1), 278(2007).
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Nachdrucke und Genehmigungen
