Methodenartikel

Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/4108

⸱

7. August 2012

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Angesichts Speichel Probenahme für zukünftige klinische Anwendung wurde ein Lollipop-ähnliche Ultrafiltration (LLUF) Sonde hergestellt, um in die menschliche Mundhöhle passen. Direkte Analyse von unverdauten Speichel mit nanoLC-LTQ Massenspektrometrie zeigten die Fähigkeit von LLUF Sonden, um große Proteine ​​und hohe Abundanz Proteine ​​zu entfernen, und machen Low-reiche Peptide mehr nachweisbar.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwohl menschlichen Speichel Proteom-und Peptidoms worden 1-2 offenbart haben sie majorly von tryptischen Verdaus von Speichel-Proteine ​​identifiziert. Identifizierung von indigenen Peptidoms von menschlichem Speichel ohne vorherige Spaltung mit exogenen Enzyme wird aber notwendig, da nativen Peptide im menschlichen Speichel mögliche Werte stellen für die Diagnose von Krankheiten, die Vorhersage Fortschreiten der Erkrankung sowie die Überwachung therapeutische Wirksamkeit. Entsprechende Probenahme ist ein wichtiger Schritt für die Verbesserung der Identifikation der menschlichen Speichel indigenen Peptidoms. Traditionelle Methoden der Probenahme menschlichen Speichel mit Zentrifugation, um Verschmutzungen zu entfernen 4.3 kann zu zeitaufwendig anwendbar zu sein für den klinischen Einsatz. Darüber hinaus kann Müllbeseitigung durch Zentrifugation nicht in der Lage, die meisten der infizierten Krankheitserregern reinigen und entfernen Sie die hohe Abundanz Proteine, die oft behindern die Identifikation von geringer Menge Peptidoms.

Herkömmliche Ansätze Proteomik, dass priLinie nutzen zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE Gelen) in Konjugation mit in-Gel-Verdau, imstande sind, viele Proteine ​​Speichel 5-6. Allerdings ist dieser Ansatz im Allgemeinen nicht ausreichend empfindlich gegenüber niedrigen Häufigkeit Peptide / Proteine ​​zu detektieren. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) basierten Proteomik ist eine Alternative, die Proteine ​​ohne vorherige 2-DE Trennung identifizieren können. Obwohl dieser Ansatz bietet eine höhere Empfindlichkeit, muss es in der Regel vor Proben-Fraktionierung 7 und vor dem Verdau mit Trypsin, was es schwierig für den klinischen Gebrauch macht.

Um das Hindernis in der Massenspektrometrie durch Probenvorbereitung zu umgehen, haben wir eine Technik, die als Kapillare Ultrafiltration (CUF) Sonden 8-11 entwickelt. Daten aus unserem Labor gezeigt, dass die Sonden, die CUF Erfassung Proteine ​​in vivo aus verschiedenen Mikroumgebungen bei Tieren in einem dynamischen und minimal invasiven Weise 8 -11. Keine Zentrifugation ist notwendig, da ein Unterdruck durch einfaches Herausziehen Spritze während der Probenahme erstellt wird. Die CUF-Sonden mit LC-MS kombiniert erfolgreich identifizierten tryptischen-verdaute Proteine ​​11.08. In dieser Studie wurden aufgerüstet wir die Ultrafiltration Sampling-Technik, indem sie einen Lutscher-wie Ultrafiltration (LLUF) Sonde, die sich leicht in die menschliche Mundhöhle kann passen. Die direkte Analyse mittels LC-MS ohne Trypsin-Verdau zeigte, dass menschliche Speichel enthält viele indigenously Peptidfragmente aus verschiedenen Proteinen abgeleitet sind. Probenahme mit Speichel LLUF Sonden vermieden Zentrifugation aber effektiv entfernt viele größere und hohe Abundanz Proteine. Unsere massenspektrometrischen Ergebnisse dargestellt, dass viele geringer Menge nachweisbar Peptide nach Herausfiltern von größeren Proteinen mit LLUF Sonden wurde. Erkennung von Peptiden geringer Menge Speichel war unabhängig von mehrstufigen Stichprobe Trennung mit Chromatographie. Für die klinische Anwendung, verfügen die Sonden LLUFd mit LC-MS könnte möglicherweise in der Zukunft genutzt werden, um den Krankheitsverlauf aus Speichel zu überwachen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Erstellung von LLUF Probes

  1. Die Polyethersulfonmembranen (2 cm 2) wurden mit Polypropylen-Dreieck Paddel (University of California, San Diego) durch Kleben mit Epoxy-Membranen an den Grenzen der Paddel versiegelt. Ein negativ geladenes Polyethersulfonmembran mit einem Molekulargewicht cut-off (MWCO) bei 30 kDa verwendet wurde.
  2. Ein Teflon fluorierten Ethylen-Propylen-(innerer Durchmesser / äußerer Durchmesser 0.35/0.50 cm) wurde einem Zylinder Ausgang eines Dreiecks Polypropylen Paddel befestigt, so dass die Sonde an eine LLUF 20 ml Spritze verbunden werden kann.
  3. Nach dem Einweichen die Polyethersulfonmembran in menschlichem Speichel in der Kulturschale (50 mm Durchmesser) wurde Unterdruck, der durch Entnahme einer Spritze erstellt. Die Spritze mit Unterdruck gefahren Die Ultrafiltration zur Entnahme von Speichel-Proteine.
  4. Die Sonden wurden mit 70% Alkohol über Nacht vor der Verwendung sterilisiert. Um eine einwandfreie Abdichtung zu demonstrieren, positionierten wir LLUF Sonden in eine LösungMicellenlösung mit blauem Dextran (50 mg / ml) mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000 kDa für 2 Stunden. Das Fehlen von blauem Dextran in den gesammelten Proben zeigte, dass keine Leckagen während des Fertigungs-und Probenahme-Sonde entwickelt.

2. Speichelsammelsystem

  1. Ganze Speichel wurde von drei gesunden Probanden (zwei Männer und eine Frau im Alter zwischen 20 und 40) nehmen keine Medikamente gesammelt, ohne deutliche Zeichen für eine Gingivitis oder Hohlräume 6.
  2. Nach dem Spülen des Mundes mit Wasser wurden die gesamten Speichelproben durch Spucken gesammelt, ohne chemische Stimulation, in einer eisgekühlten Behälter.
  3. Alle Proben wurden gesammelt und auf Eis gehalten während der Sammelprozedur.
  4. Unmittelbar nach der Sammlung, wurde Speichel (200 ul) für die Probenahme mit LLUF Sonden angewendet. Die Probenahme erfolgte in einem 4 ° C Raumtemperatur durchgeführt.
  5. Speichel-Proteine ​​(1,0 ug / ul) mit oder ohne Sonde LLUF Sammlung wurden direkt an Nano-LC-Masse-s ausgesetztpectrometry Analyse ohne tryptischen Verdauung. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bio-Rad Protein Assay 12.

3. NanoLC-LTQ MS-Analyse

  1. Die UN-verdauten Speichelproben (5 ul) wurden direkt an die Trap-Säule des Eksigent NanoLC System durch den Autosampler geladen, mit 100% Puffer A (2% acetonitrile/0.1% Ameisensäure). Die NanoLC wurde on-line mit einem Finnigan LTQ Massenspektrometer gekoppelt.
  2. Nach Probe geladen und Waschen wurde das Ventil umgeschaltet und 500 nl / min linearem Gradient wurde zu dem Abscheider und der Trennsäule (10 cm Länge, 100 um ID, im eigenen Haus mit Synergi 4 um C18 verpackt) geliefert. Der Gradient war 0 bis 50% Puffer B (80% acetonitrile/0.1% Ameisensäure) in 45 min.
  3. Die nanoLC-LTQ MS Instrumente wurden in der Daten abhängig von Xcalibur-Modus betrieben. MS / MS-Spektren von den vier stärksten MS Ionen oberhalb einer Intensität von 1 × 10 5 wurden mit der dynamischen Ausschluss gesammeltaktiviert ist und die Aufprallenergie bei 35% festgelegt.
  4. Jede Probe wurde zweimal von der Nano-LC-MS LTQ System laufen. Die Proben aus drei verschiedenen Präparaten verwendet wurden. Diese Peptide nachweisbar in drei separaten Proben wurden in Supplemental Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Vertreter der nanoLC-LTQ MS-Spektren wurde in Abbildung 3 dargestellt.

4. Datenanalyse und Protein-Datenbank Suche

  1. Jeder RAW-Datei wurde in eine Datei mit mzXML Readw.exe umgewandelt.
  2. Die Datei war mzXML Eingang in ein SEQUEST Sorcerer 2-System und suchte gegen einen menschlichen Datenbank aus dem entsprechenden National Center for Biotechnology Information (NCBI) Protein-Datenbank unter Verwendung von nicht-Enzym-Spezifität generiert. Die Masse Toleranz von Vorläufer-Ion wurde bei 1,5 Da setzen. Ein Molekulargewicht von 16 Da wurde Methionin-Differential Suche auf angemeldet zur Oxidation zugegeben.
  3. Nach SEQUEST suchen, waren die Ergebnisse automatisch gefiltert, validiert eind durch PeptideProphet und ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)] angezeigt. PeptideProphet schätzt ein umfassendes Wahrscheinlichkeit (P) Ergebnis, dass ein Peptid Zuordnung "richtige" vs "falsch" auf den Grundlagen der es SEQUEST Scores (XCORR, ΔCn, Sp, RSP) und weitere Informationen der einzelnen Peptid-Sequenz identifiziert ist. ProteinProphet berechnet einen Wahrscheinlichkeitswert 0-1 für jedes Protein auf der Grundlage von Peptiden zugeordneten MS / MS-Spektren.
  4. Um falsch positive Identifizierungen zu minimieren verwendeten wir strenge Filterkriterien. Zunächst wird die minimale Punktzahl P Cutoff von 0,8 für alle akzeptierten Peptid gesetzt zu sehr niedrige Fehlerrate (viel weniger als 3%) und recht gute Empfindlichkeit zu gewährleisten. Zweitens müssen alle Peptide mit> 0,8 P Punktzahl haben hohe Kreuzkorrelation (XCORR) erzielt ein Tor zur gleichen Zeit: 1,9, 2,2 und 3,0 für 1, 2, 3 und Ladung.

5. Entfernung von Bakterien in der Mundhöhle mit LLUF Probes

  1. Um die Leistungsfähigkeit von LLUF Sonden ermitteln, um die zu entfernenBakterien in der Mundhöhle, Speichel vor und nach LLUF Sonde Sammlung (Abschnitt 3) wurde auf Agarplatten für Nachweis von Bakterien zu verbreiten.
  2. Aerobe Bakterien wurden auf einem Antibiotika-freie Lauria-Bertani (LB)-Agar-Platte bei 37 ° C für einen Tag zugenommen.
  3. Anaerobe Bakterien wurden auf einer Antibiotika-freien Brucella-Bouillon-Agar-Platte (BD, Sparks, MD) unter anaeroben Bedingungen mit Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) bei 37 ° C für einen Tag gewachsen.

6. Repräsentative Ergebnisse

1. Herstellung von Sonden und LLUF Probenahme Speichel in einer nachgeahmten Mundmilieu

Wenn Probenahme Speichel als das Saugen einen Lutscher durchgeführt werden können, wird das Verfahren vermeiden den Abbau von aufgespießt Speichel in Auffangvorrichtungen 13-14. Wichtig ist, dass es auch möglich geworden, Patienten dynamisch und lokal zu überwachen von Mundhöhle. Darüber hinaus, wenn Probenvorbereitung mit Speichel vereinfacht werden könnten, würde Kliniker leicht faciltern die Vorgehensweise, um ihre Entscheidung auf der nächsten klinischen Betrieb zu beschleunigen. Massenspektrometrie ist eine der am empfindlichsten zu detektieren und sogar Sequenz Proteine ​​in einem sehr kurzen Zeitraum. Allerdings haben komplizierte Verfahren für die Probenvorbereitung behindert mit dieser Technik in der Klinik. Weiterhin ist es bekannt, dass höhere Mengen vorhandenen Proteine ​​oder Proteine ​​mit hohem Molekulargewicht in klinischen Proben (z. B. Amylase im Speichel) Maske geringen Mengen vorhandenen Proteine ​​für die massenspektrometrische Analyse 15-16. Um die Hürden zu überwinden oben erwähnt, haben wir ein Lollipop-ähnliche Gerät mit dem Namen Ultrafiltration LLUF Sonden (Abbildung 1). Ein negativ geladenes Polyethersulfon-Membran mit einem MWCO von 30 kDa (1A, a) wurde auf einer Polypropylen-Schaufel (1A, b) verklebt ist. Es wurde vor dem LLUF Sonde mit der Absicht Herausfiltern größere Proteine ​​im Speichel angeordnet ist. Um die menschliche Mundhöhle (Abbildung 1A, g nachahmen) Wurde ein Schwamm (Abbildung 1A, e) in den Speichel in der Kulturschale (Abbildung 1A, f) getränkt. Nach dem vollständigen Zurückziehen der Spritze (1A, d), filtriert begonnen Speichel Bewegen entlang eines verbundenen Rohr (1A, c) und wurde gesammelt.

2. Identifizierung von indigenen Speichel Peptidoms mit nanoLC-MS LTQ

Vergleichen LC-Chromatogramme, fanden wir verschiedene Chromatogramme von Speichel vor und nach LLUF Abtasten (2), was anzeigt, dass es verschiedene Protein-Zusammensetzungen im Speichel nach LLUF Probenahme. Um die Protein-Zusammensetzungen zu bestimmen, verwendeten wir NanoLC-LTQ Massenspektrometrie, die bekanntermaßen in der Lage, schnell Sequenz Peptide von einem Vielfachen Proteingemisch wird. Noch wichtiger ist, an die Probenvorbereitung für klinische Zwecke zu vereinfachen, wurde ganze Speichel ohne chemische oder enzymatische Verdauung für nanoLC-LTQ MS-Analyse angewandt. Unerwarteterweise, 131 Peptide wirunverdaut im Speichel (Supplemental Tabelle 1) identifiziert erneut. Diese Peptide sind Fragmente von verschiedenen Prolin reiche Proteine, Actin, alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, beta-Globin, histain 1, Keratin 1, Muzin 7, polymeren Immunglobulin-Rezeptor, satherin, und S100A9 abgeleitet. Sechsundzwanzig einzigartige Peptide wurden im Speichel nach dem Filtern mit LLUF Sonden (Supplemental Tabelle 2) identifiziert. Diese Peptide sind Bruchstücke hauptsächlich aus verschiedenen Prolin-reiche Proteine ​​abgeleitet. Peptide aus Proteinen, wie dem polymeren Immunglobulin-Rezeptor (83,24 kDa) und alpha-Amylase abgeleitet nicht erkannt werden konnten, was die Fähigkeit LLUF Sonden zur Entfernung von größeren und vorkommenden Proteine. Eine MS / MS-Spektrum der PFIAIHAEAESKL Peptid, das eine interne Peptid alpha-Amylase in 3A dargestellt. Am verblüffendsten ist, nach dem Entfernen größerer Proteine, wurden 18 von 26 sequenzierten Peptide in der LLUF-Sonde abgetastet Speichel (Tabelle nachweisbar1). Diese 18 Peptide wurden von Prolin-reiche Proteine ​​oder hypothetischen Proteinen, die mit einem Prolin (P) beendet abgeleitet -. Glutamin (Q) (-VE),-SR,-SP oder PP-C-Terminus 3B gezeigt, eine MS / MS Spektrum der PQGPPQQGGHPRPP Peptid, das in der LLUF-Sonde abgetastet Speichel nachgewiesen wurde. Das Peptid konnte von Prolin-reiche Protein HaeIII Unterfamilie 1 und 2 (Tabelle 1) abgeleitet werden.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Zusammensetzungen LLUF Sonden und Probenahme von Speichel von ganzen imitieren menschlichen Mundhöhle Panel A:. (A) eine semipermeable Polyethersulfon mit einer Molekulargewichtsschwelle von 30 kDa, (b) ein Polypropylen Paddel, (c) eine Teflon-fluoriertem Ethylen-Propylen-Rohr; (d) eine 20 ml Spritze Panel B:. ein Schwamm (e) (a nachgeahmten Zunge) wurde in einer Kulturschale (f) mit menschlichem Speichel zu schaffen getränkteine künstliche menschliche Mundhöhle (g). Der entstehende Unterdruck durch die vollständige Entnahme einer Spritze erstellt treibt die gesammelte Flüssigkeit entlang einer Röhre verbunden (Pfeil) und hin zu einem Raum geschaffen (Pfeilspitze) in der Spritze zu bewegen. Bar: 2,0 cm.

figure-protocol-2
Abbildung 2. Differentielle LC / MS / MS-Chromatogramme von Speichel vor und nach der Probenahme LLUF. Proteine ​​(1,0 ug / ul) in menschlichen Speichel ganzen wurden ohne oder mit einer Sonde LLUF gefiltert. Proteine ​​ohne tryptischen Verdau wurden direkt an NanoLC-LTQ MS, konjugiert mit einem Eksigent Nano-LC-System wurde wie in Material und Methoden beschrieben ist. Die Basis-Peak Chromatogramme (mit 44-mim Retentionszeiten) von Speichel vor (A) und nach (B) LLUF Probenahme wurden dargestellt.

figure-protocol-3
Abbildung 3. UVEKtion von Speichel Peptidoms mit nanoLC-LTQ MS-Sequenzierung. Speichel-Proteine ​​vor (A) und nach (b) Probenahme mit LLUF Sonden wurden durch Nano-LC-MS LTQ wie im experimentellen Verfahren beschrieben, analysiert. Speichel Peptidoms aus natürlichen menschlichen Speichel ohne tryptischen Verdau abgeleitet wurden Zusätzliche Tabellen 1 und 2 gezeigt. Ein Peptid (PFIAIHAEAESKL) aus alpha-Amylase aus ausschließlich in einer Speichelprobe ohne Erhebung mit LLUF Sonden (A) erfasst wird, zeigt, dass die Fähigkeit LLUF Sonden bei der Entfernung von großen Proteinen. Viele Peptide mit PQ-,-SR,-SP oder PP-C-Terminus waren nur in Proben nach der Ultrafiltration LLUF Sonden. Ein (PQGPPQQGGHPRPP) von Peptiden aus verschiedenen prolinreichen Proteinen abgeleitet wurden (B) gezeigt. MS / MS-Spektren mit charakteristischen "y" und "b"-Serie Ionen bestätigte die Identität der beiden Peptide.

figure-protocol-4
Abbildung 4. Entfernung von Bakterien in der Mundhöhle mit Hilfe während LLUF Sonden. Eine Sonde wurde LLUF ausgebildet, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Die Sonde wurde in den menschlichen Speichel innerhalb eines imitierten oralen Milieu (1) angeordnet ist. Die Spritze am Ende LLUF Sonde wurde entfernt, um einen negativen Druck, der Ultrafiltration für Speichel Probenahme fuhren erstellen. Bei der Probenahme, querte die Speichel selektiv durch die Polyethersulfonmembran und akkumuliert in einer Spritze. Ganze Speichel vor der Abtastung mit einem LLUF Sonde diente als Kontrolle. Speichel (10 ul) vor und nach der Probenahme LLUF Sonde wurde auf Agarplatten für Nachweis von Bakterien verbreiten Panel A:. Speichel mit (+ LLUF) und ohne (+ LLUF) LLUF Probennahme wurde Seite an Seite auf einer Antibiotika-freien verbreiten LB-Agar-Platte bei 37 ° C für einen Tag Panel B:. Speichel mit und ohne LLUF Probennahme wurde auf einer Antibiotika-freie Brucella-Bouillon-Agar-Platte verteiltunter anaeroben Bedingungen mit Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) bei 37 ° C für einen Tag. Bakterien nicht auf Agarplatten mit LLUF-Sonde abgetastet Speichel verbreiten wachsen, was die Fähigkeit der LLCF Sonden bei der Beseitigung von aeroben sowie anaeroben Bakterien in der Mundhöhle. Bar: 1,0 cm.

Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2
Peptidsequenz / Gemessene peptide mass Zugangsnummer Name
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485,3 		gi | 41349484 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 2-Vorläufer
gi | 41349482 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer
gi | 60301553 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576,9 		gi | 4826944 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2
gi | 9945310 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126,2 		gi | 37537692 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 4-Precursor
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028,3 		gi | 113423660 Vorhergesagt: hypothetisches Protein
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077,8 		gi | 113423262 Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5
gi | 41349482 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer
gi | 60301553 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2
gi | 113423663 Vorhergesagt: hypothetisches Protein
gi | 41349484 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 2-Vorläufer
gi | 41349486 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 3 Vorläufer
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918,5 		gi | 9945310 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131,3 		gi | 113423660 Vorhergesagt: hypothetisches Protein
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030 		gi | 113423663 Vorhergesagt: hypothetisches Protein
gi | 41349482 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer
gi | 113423262 Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5
gi | 60301553 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866,6 		gi | 4826944 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713,8 		gi | 9945310 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1
gi | 4826944
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083,1 		gi | 9945310 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1
gi | 4826944 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512,6 		gi | 4826944 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2
gi | 9945310 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720,2 		gi | 113423262 Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5
gi | 113423663 Vorhergesagt: hyhypothetischen Protein
14 PQGPPQQGGHPRPP
1450,1 		gi | 9945310 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1
gi | 4826944 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791,1 		gi | 4826944 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 2
gi | 9945310 Prolinreichen Proteins HaeIII Unterfamilie 1
16 SPPGKPQGPPPQ
1186,9 		gi | 113423262 Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5
gi | 41349482 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer
gi | 60301553 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2
gi | 113423663 Vorhergesagt: hypothetisches Protein
gi | 41349484 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 2-Vorläufer
gi | 41349486 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform 3 Vorläufer
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720,3 		gi | 113423663 Vorhergesagt: hypothetisches Protein
gi | 41349482 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 1 Isoform ein Vorläufer
gi | 113423262 Vorhergesagt: hypothetisches Protein Isoform 5
gi | 60301553 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870,9 		gi | 37537692 Prolinreichen Proteins BstNI Unterfamilie 4-Precursor

Tabelle 1. Die Peptide wurden ausschließlich nachweisbar LLUF-gesammelten Proben.

Ergänzende Tabelle 1. Klicken Sie hier zur Ansicht ergänzende Tabelle 1 .

Ergänzende Tabelle 2. Klicken Sie hier zur Ansicht ergänzende Tabelle 2 .

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben festgestellt, dass viele Peptidfragmente in menschlichen unverdaute Speichel abgegeben. Diese Peptidfragmente sind Derivate aus verschiedenen Formen von Prolin-reiche Proteine, Actin, alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, beta-Globin, histain 1, Keratin 1, Muzin 7, polymeren Immunglobulin-Rezeptor, satherin, S100A9. Es könnte viele Faktoren, die die Produktion von Peptiden mit ungeklärter Spaltstellen sein. Zum Beispiel können einige Peptidfragmente natürlich vorhanden sein in menschlichem Gesamtblut Speichel. Viele ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 und R21-I58002-01) unterstützt. Wir danken C. Niemeyer für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
Polyethersulfonmembranen Pall Corporation 30 kDa MWCO
Teflon fluorierten Ethylen-Propylen-Rohr Upchurch Scientific
Blaudextran Sigma
Nano-LC-System Eksigent
C18-Trap-Säule Agilent 5065-9913
LTQ linearen Ionenfallen-Massenspektrometer Thermo Fisher
Sorcerer 2 Sage-N ReseaRCH
Acetonitril-0.1% Ameisensäure JT Baker 9832-03 LC / MS-Klasse
Wasser-0,1% Ameisensäure JT Baker 9834-03 LC / MS-Klasse

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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