Herstellung und Verwendung von Mikroumgebung Microarrays (MEArrays)

Zusammenfassung

Eine kombinatorische funktionelle Screening-Methode für Einblicke in die Auswirkungen der molekularen Zusammensetzung der Mikroumgebung auf zelluläre Funktionen beschrieben. Das Verfahren nutzt bestehende Biochip-basierten Technologien, um Arrays von definierten kombinatorischen Mikroumgebungen, dass Zelladhäsion und funktionelle Analyse unterstützt generieren.

Zusammenfassung

Die Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Umgebung Mikroumgebung funktionelle Konsequenzen für zelluläres Verhalten. Auf der einzigen Zelle Ebene können unterschiedliche Mikroumgebungen verhängen Differenzierung, Migration und Proliferation Phänotypen, und auf der Gewebe-Ebene die Mikroumgebung verarbeitet so komplex wie Morphogenese und Tumorentstehung ^1. Nicht nur, dass die Zell-und Molekularbiologie Inhalt Mikroumgebungen Auswirkungen die Zellen innerhalb, aber so tun die Elastizität ² und Geometrie ³ des Gewebes. Definiert als die Summe der Zell-Zell-,-ECM und löslichen Faktor Wechselwirkungen neben physikalischen Eigenschaften ist der Mikroumgebung komplex. Die Phänotypen von Zellen innerhalb eines Gewebes sind teilweise auf Grund ihrer genomischen Inhalt und teilweise auf die Wechselwirkungen mit der kombinatorischen microenviroment. Eine große Herausforderung ist es, bestimmte Kombinationen von Mikroumgebung Komponenten mit charakteristischen Verhaltensweisen zu verknüpfen. ent "> Hier präsentieren wir die Mikroumgebung Mikroarray (MEArray)-Plattform für zellbasierte funktionelles Screening von Wechselwirkungen mit kombinatorischen Mikroumgebungen ^4. Das Verfahren erlaubt die gleichzeitige Steuerung der molekularen Zusammensetzung und der Elastizitätsmodul und kombiniert die Verwendung von allgemein verfügbar Microarray und Mikrostrukturierung Technologien. MEArray Bildschirme benötigen so wenige wie 10.000 Zellen pro Array, welches funktionelle Studien von seltenen Zelltypen wie adulte Progenitorzellen erleichtert. Eine Begrenzung der Technik ist, dass ganze Gewebe Mikroumgebungen nicht vollständig auf MEArrays rekapituliert werden. jedoch Vergleich Antworten in der gleichen Zelltyp zu zahlreichen verwandten Mikroumgebungen beispielsweise paarweise Kombinationen von ECM-Proteinen, die eine gegebene Gewebes zu charakterisieren, werden Erkenntnisse, wie Mikroumgebungsbedingungen Komponenten hervorzurufen gewebespezifischen funktionellen Phänotypen bereitzustellen.

MEArrays gedruckt unter Verwendung einer Vielzahl von rekombinantem gro werdenwth Faktoren, Cytokine und gereinigtes ECM Proteine, und Kombinationen davon. Die Plattform wird nur durch die Verfügbarkeit von spezifischen Reagenzien begrenzt. MEArrays zugänglich sind Zeitraffer Analyse, aber am häufigsten für Endpunkt-Analysen von Zellfunktionen, die messbar sind mit fluoreszierenden Sonden verwendet. Zum Beispiel werden DNA-Synthese, Apoptose, Akquisition von differenzierten Zustände oder Produktion spezifischer Genprodukte häufigsten gemessen. Kurz gesagt, ist der grundlegende Ablauf eines MEArray Experiment Folien mit Druck Substrate beschichtet vorzubereiten und die Master-Platte von Proteinen, die gedruckt werden sollen, vorbereitet. Dann werden die Arrays mit einem Mikroarray-Roboter gedruckt werden Zellen erlaubt zu befestigen, in Kultur zu wachsen, und werden dann chemisch bei Erreichen der experimentellen Endpunkt fixiert. Fluoreszierenden oder kolorimetrische Assays, mit traditionellen Mikroskopen oder Microarrayscannern abgebildet wird, werden verwendet, um relevante molekularen und zellulären Phänotypen (Abbildung 1) offenbaren.

Protokoll

Ein. Printing Substrata Vorbereitung

Die Entscheidung, Polydimethylsiloxan (PDMS)-beschichteten oder Polyacrylamid (PA)-beschichteten Folien verwenden, hängt von den wichtigsten Parameter des experimentellen Designs. Der Elastizitätsmodul der beiden Polymere kann abgestimmt, um die Steifigkeit der verschiedenen Geweben durch Veränderung des Base / Heilung Verhältnis von PDMS und das Acrylamid / Bisacrylamid-Verhältnis von PA imitieren. PDMS kann steifer Geweben in dem Bereich von 1-10MPa (Knorpel, Hornhaut und Arterienwände) zu imitieren, und PA können weicheren Gewebe im Bereich von 100 Pa-100kPa (z. B. Brust-, Hirn-, Leb....

Diskussion

Die MEArray hier vorgestellte Methode ermöglicht funktionelle Analysen von Zell-und kombinatorischen Mikroumgebung Interaktionen ^4. MEArray Analyse kombiniert Verwendung von basischen Mikrostrukturierung Technologien, Zellbiologie, und Microarray-Druck Roboter und Analyse-Geräte, die in vielen Multiuser-Labore sind. MEArray Bildschirme sind kompatibel mit den meisten adhärente Zelltypen, wenn serumfreie Medien Formulierungen müssen möglicherweise in einigen Fällen eingestellt werden zu BSA oder <1% Serum, .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalognummer	Kommentare (optional)
Glasplättchen 25 mm x 75 mm	VWR	48311-600
Deckgläschen (Nr.1) 24 mm x 50 mm	VWR	48393-241
Färbekasten (oder Coplan jar)	VWR	25461-003
Petrischalen (15 cm)	BD Falcon	351058
NaOH (1,0 N)	Sigma-Aldrich	S2567
APES (> 98% (3-Aminopropyl) triethoxysilan)	Sigma-Aldrich	A3648
Glutaraldehyd	Sigma-Aldrich	G7651	50% in Wasser
APS (> 98% Ammoniumpersulfat)	Sigma-Aldrich	A3678	Bereiten Sie 10% funktionierende Lösung mit ddH 2 O
TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethylendiamin)	Sigma-Aldrich	T9281
Acrylamid (40%)	Sigma-Aldrich	A4058
Bis-Acrylamid (2% w / v)	Fisher BioReagents	BP1404-250
0,45 um Spritzenfilter 4-mm Nylon-	Nalgene	176-0045
FITC	Sigma-Aldrich	F4274
PDMS (Polydimethylsiloxan)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Elastomer-Kit über Ellsworth Adhesives
2-Kammer-Objektträgern	NUNC	177380
Pluronic F108	BASF	30089186
Aquarium Dichtstoff	Dow Corning	DAP 00688
Fluormount-G	Southern Biotech	0100-01
Einweg-Plastikbecher
Mundspatel
Nitril-Handschuhe
Plastic Objektträger-Boxen
Spin Coater	WS-400B-6NPP/LITE	Laurell Technologies Corporation
Ofen
Digitale Kochplatte
384-Well-Platten			Eine Marke geeignet für die Mikroarray-Roboter
Microarray-Druck-Roboter
Inverted Phase und Fluoreszenz-Mikroskop
Axon Microarrayscannern	Molecular Devices		Mehrere Konfigurationen existieren