Methodenartikel

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

DOI:

10.3791/4193

13. Oktober 2012

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

Zusammenfassung

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Die Entdeckung von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (kollektiv als neuralen Vorläuferzellen) (NPC) im erwachsenen Gehirn von Säugetieren ist an einem Körper der Forschung auf die Nutzung der multipotenten und proliferativen Eigenschaften dieser Zellen für die Entwicklung von Strategien neuroregenerative gerichtet geführt. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Mobilisierung von NSC Richtung einer Läsionsstelle nach Transplantation oder exogene, um die Reaktion der endogenen Vorstufen, die in der periventrikulären Region des ZNS gefunden werden verbessern. Dementsprechend ist es wichtig, die Mechanismen, die zu fördern leiten, und verbessern NPC Migration verstehen. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Nutzung von Gleichstrom elektrische Felder (dcEFs) zu fördern und zu direkten NPC Migration - ein Phänomen, das als Galvanotaxis bekannt. Endogenen physiologischen elektrischen Feldern funktionieren als kritische Hinweise für die Zellwanderung während der normalen Entwicklung und Wundheilung. Pharmakologische Unterbrechung dertrans-Neuralrohr Potenzial Axolotl Embryonen verursacht schweren Entwicklungsstörungen Fehlbildungen 1. Im Rahmen der Wundheilung, wird die Rate der Reparatur der verwundeten Hornhaut direkt mit der Größe der Wunde epithelialen Potential, das nach der Verletzung auftritt korreliert, als durch pharmakologische Verstärkung oder Störung dieses dcEF 2-3 gezeigt. Wir haben gezeigt, dass adulte subependymale NPCs rasche und gerichteten Migration kathodenseitigen in vitro durchlaufen, wenn sie einem von außen angelegten dcEF ausgesetzt. In diesem Protokoll beschreiben wir unser Labor die Techniken für die Schaffung eines einfachen und effektiven Galvanotaxis Assay für hochauflösende, langfristige Beobachtung der Regie Zellkörper Translokation (Migration) auf einer Ebene einzelner Zellen. Dieser Assay wäre geeignet für die Untersuchung der Mechanismen, dcEF Transduktion in zelluläre Motilität regulieren durch die Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäuse, short interfering RNA oder spezifischen Rezeptor Agonisten / Antagonisten.

Protokoll

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Alle Verfahren, die Behandlung der Tiere wurden von der University of Toronto Animal Care Committee in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts (Protokoll Nr. 20.009.387) zugelassen. Die folgenden Methoden sollten unter Verwendung steriler Instrumente und Techniken in einer Sterilbank, soweit zutreffend.

Im Protokoll-Text bezieht sich der Ausdruck "EFH-SFM" zu serumfreiem Medium mit epidermalen Wachstumsfaktor, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Heparin ergänzt. EFH-SFM wird verwendet, wenn die Untersuchung der Galvanotaxis undifferenzierter NPCs, weil diese Mitogene NPCs in ihrem undifferenzierten Zustand 4 zu....

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Ergebnisse

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Kinematische Analyse zeigt, daß in Gegenwart von 250 mV / mm dcEF, undifferenzierte NPCs sehr gerichtet und rasche Galvanotaxis Richtung der Kathode (5A, Kinofilm 1) aufweisen. In Abwesenheit eines dcEF wird zufällige Bewegung der Zellen beobachtet (5B, Film 2). Zu dieser Feldstärke> 98% von undifferenzierten NSCs für die gesamte 6-8 h, für die sie abgebildet migrieren, und da tote Zellen nicht migrieren dies legt nahe, dass sie lebensfähig bleiben während dieses Zeitraums in Abwesen.......

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Diskussion

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Dieses Protokoll wurde von den etablierten Methoden der früheren Studien 7-9 angepasst. Galvanotactic Kammern kann unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Techniken, einschließlich der Errichtung eines separaten Glas gut für Einschluss Zellaussaat oder mit Hilfe von CO 2-Laser-Ablation zur Mikrofabrikation des zentralen Rinne 10,11 werden. Einige Techniken können mehr mühsam oder kostspieliger als andere. Wir haben eine einfache und kostengünstige Konstruktion eines Assays für .......

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird durch die Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant # 249669 und # 482986) und Heart and Stroke Foundation of Canada (Grant # 485508) gefördert. Die Autoren danken Youssef El-Hayek und Dr. Qi Wan für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der experimentellen Protokolle.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bezeichnung des Gegenstands Firma Katalog-Nummer Kommentare
Neuronale Vorläuferzellen Isolation
2 M NaCl Sigma S5886 11,688 g in 100 ml dH 2 O gelöst
1M KCl Sigma P5405 7,456 g in 100 ml dH 2 O gelöst
1M MgCl 2 Sigma M2393 20,33 g in 100 ml dH 2 O gelöst
155 mM NaHCO 3 Sigma S5761 1,302 g in 100 ml dH 2 O gelöst
0,5 M Glucose Sigma G6152 9,01 g gelöst in 100ml dH 2 O
108 mM CaCl 2 Sigma C7902 1,59 g in 100 ml dH 2 O gelöst
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070
Rinderpankreas Trypsin Sigma T1005
Sheep Hoden Hyaluronidase Sigma H6254
Kynurensäure Sigma K3375
Ovomucoid Trypsininhibitor Worthington LS003086
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 21700075
30% Glucose Sigma G6152
7,5% NaHCO 3 Sigma S5761
1M HEPES Sigma H3375 23,83 g in 100 ml dH 2 O gelöst
L-Glutamin Gibco 25030
EGF Invitrogen PMG8041 Rekonstituieren in 1 ml Hormon-Mix und Aliquote in 20 ul Einheiten.
FGF Invitrogen PHG0226 Rekonstituieren in 0,5 ml Hormon-Mix und Aliquote in 20 ul Einheiten.
Heparin Sigma H3149
Apo-Transferrin R & D Systems 3188-AT 0,1 g in 4 ml dH 2 0 gelöst
Putrescin Sigma P7505 Auflösen 9,61 mg in Apo-Transferrin solution
Insulin Sigma I5500 25 mg in 0,5 ml 0,1 N HCl und fügen Sie 3,5 ml dH 2 0
Selen Sigma S9133
Progesteron Sigma P6149
Standard Dissection Werkzeuge Fine Science Tools
Dissektionsmikroskop Zeiss Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Vorbereitung
Platz Glasabdeckung Dias VWR 16004
6N Salzsäure VWR BDH3204-1
Hochvakuumfett Dow Corning
60 mm Petrischalen Fisher Scientific 0875713A
Poly-L-Lysin Sigma P4707
Matrigel BD Biosciences 354234 Tauwetter und Aliquot in 150 ul-Einheiten
FBS Invitrogen 10082139 Nur verwenden, wenn induzieren NPC Differenzierung, ansonsten SFM + EFH Kulturmedien wie oben angegeben
Zählen Mikroskops Olymp CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silberdraht Alfa Aesar 11434
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Hitze Inactivated FBS Sigma 16140071
PVC-Schlauch Fisher Scientific 80000006 3/32 "ID x 5/32" OD
Bleichmittel Clorox
10-ml-Spritze BD 309604
18-Gauge-Nadel BD 305195
Dremel Bohrmaschine Dremel Modell 750
Inverses Mikroskop mit befeuchteten, bebrütete Kammer ausgestattet Zeiss Axiovert-200M

Rezepte

Artikel Volumen
2 M NaCl 6,2 ml
1M KCl 0,5 ml
1M MgCl 2 0,32 ml
155mm NaHCO 3 16,9 ml
1M Glucose 1 ml
108 mM CaCl 2 0,09256 ml
Penicillin-Streptomycin 1 ml
Wasser autoklaviert 74 ml

Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit

Artikel Volumen oder Masse
Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit 30 ml
Rinderpankreas Trypsin 40 mg
Sheep Hoden Hyaluronidase 22,8 mg
Kynurensäure 5 mg

Trypsin-Lösung

Artikel Volumen oder Masse
SFM 15 ml
Ovomucoid Trypsininhibitor 10 mg

Trypsininhibitorlösung

Artikel Volumen
Wasser autoklaviert 37 ml
10X DMEM/F12 10 ml
30% Glucose 2 ml
7,5% NaHCO 3 1,5 ml
1M HEPES 0,5 ml
Transferrin, Putrescin-Lösung 4 ml
25 mg Insulin-Lösung 4 ml
Selen 100 & mu; L
Progesteron 100 ul

Hormone Mix (100 ml insgesamt bei -20 ° C)

Artikel Volumen
Wasser autoklaviert 37,5 ml
10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml
30% Glucose 1 ml
7,5% NaHCO 3 0,75 ml
1M HEPES 0,25 ml
Hormone mix 5 ml
L-Glutamin 0,5 ml
Penicillin-Streptomycin 0,5 ml

Serum Free Media EFH-SFM: add 10 ul EGF, 10 ul FGF und 3,66 ul Heparin FBS-SFM: 0,5 ml FBS

Artikel Volumen
Matrigel 150 ul
SFM 3,6 ml

Matrigel Lösung Matrigel Aliquot sollte in einer Box von Eis gelegt werden und langsam auftauen über 4-5 Stunden, um eine viskose Flüssigkeit vor dem Mischen mit SFM bilden. Dadurch wird die Bildung einer glatten Schicht aus Matrigel Substrat. Wenn nicht aufgetaut langsam, wird das resultierende Substrat enthalten Klumpen von Matrigel, möglicherweise behindern Zellmigration.

Artikel Volumen oder Masse
UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH 2 0
SFM
Hitzeinaktiviertem FBS
8 ml
2 ml

MatrigelLösung Mix 8 ml SFM mit 2 ml hitzeinaktiviertem FBS in einer 15 cc Falcon-Röhrchen. Mischung Agarose mit 10 ml ddH 2 0 in einem Erlenmeyerkolben und Hitze in einer Mikrowelle für 30 sec. in 10-sec Intervallen, wodurch die Lösung aus der Mikrowelle zu entfernen, nachdem jedes 10-Sekunden-Intervall und gründlich zu mischen. Nach dem abschließenden 10-sec Mikrowelle Zeitraum mischen die Agarose-Lösung mit der SFM / FBS-Lösung und an einem 57 ° C Wasserbad.

Referenzen

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  1. Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
  2. Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D.

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Schlagwörter

Neural Precursor CellsGalvanotaxis AssayDirect Current Electric FieldCell Migration KineticsSubependymal NPC IsolationGalvan Axxis ChamberTime Lapse ImagingCathodal MigrationNestin Marker ExpressionGFAP Differentiation Marker

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