A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Zusammenfassung

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

Zusammenfassung

Die Entdeckung von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (kollektiv als neuralen Vorläuferzellen) (NPC) im erwachsenen Gehirn von Säugetieren ist an einem Körper der Forschung auf die Nutzung der multipotenten und proliferativen Eigenschaften dieser Zellen für die Entwicklung von Strategien neuroregenerative gerichtet geführt. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Mobilisierung von NSC Richtung einer Läsionsstelle nach Transplantation oder exogene, um die Reaktion der endogenen Vorstufen, die in der periventrikulären Region des ZNS gefunden werden verbessern. Dementsprechend ist es wichtig, die Mechanismen, die zu fördern leiten, und verbessern NPC Migration verstehen. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Nutzung von Gleichstrom elektrische Felder (dcEFs) zu fördern und zu direkten NPC Migration - ein Phänomen, das als Galvanotaxis bekannt. Endogenen physiologischen elektrischen Feldern funktionieren als kritische Hinweise für die Zellwanderung während der normalen Entwicklung und Wundheilung. Pharmakologische Unterbrechung dertrans-Neuralrohr Potenzial Axolotl Embryonen verursacht schweren Entwicklungsstörungen Fehlbildungen ^1. Im Rahmen der Wundheilung, wird die Rate der Reparatur der verwundeten Hornhaut direkt mit der Größe der Wunde epithelialen Potential, das nach der Verletzung auftritt korreliert, als durch pharmakologische Verstärkung oder Störung dieses dcEF ^2-3 gezeigt. Wir haben gezeigt, dass adulte subependymale NPCs rasche und gerichteten Migration kathodenseitigen in vitro durchlaufen, wenn sie einem von außen angelegten dcEF ausgesetzt. In diesem Protokoll beschreiben wir unser Labor die Techniken für die Schaffung eines einfachen und effektiven Galvanotaxis Assay für hochauflösende, langfristige Beobachtung der Regie Zellkörper Translokation (Migration) auf einer Ebene einzelner Zellen. Dieser Assay wäre geeignet für die Untersuchung der Mechanismen, dcEF Transduktion in zelluläre Motilität regulieren durch die Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäuse, short interfering RNA oder spezifischen Rezeptor Agonisten / Antagonisten.

Protokoll

Alle Verfahren, die Behandlung der Tiere wurden von der University of Toronto Animal Care Committee in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts (Protokoll Nr. 20.009.387) zugelassen. Die folgenden Methoden sollten unter Verwendung steriler Instrumente und Techniken in einer Sterilbank, soweit zutreffend.

Im Protokoll-Text bezieht sich der Ausdruck "EFH-SFM" zu serumfreiem Medium mit epidermalen Wachstumsfaktor, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Heparin ergänzt. EFH-SFM wird verwendet, wenn die Untersuchung der Galvanotaxis undifferenzierter NPCs, weil diese Mitogene NPCs in ihrem undifferenzierten Zustand ⁴ zu....

Ergebnisse

Kinematische Analyse zeigt, daß in Gegenwart von 250 mV / mm dcEF, undifferenzierte NPCs sehr gerichtet und rasche Galvanotaxis Richtung der Kathode (5A, Kinofilm 1) aufweisen. In Abwesenheit eines dcEF wird zufällige Bewegung der Zellen beobachtet (5B, Film 2). Zu dieser Feldstärke> 98% von undifferenzierten NSCs für die gesamte 6-8 h, für die sie abgebildet migrieren, und da tote Zellen nicht migrieren dies legt nahe, dass sie lebensfähig bleiben während dieses Zeitraums in Abwesen.......

Diskussion

Dieses Protokoll wurde von den etablierten Methoden der früheren Studien ^7-9 angepasst. Galvanotactic Kammern kann unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Techniken, einschließlich der Errichtung eines separaten Glas gut für Einschluss Zellaussaat oder mit Hilfe von CO _{2-Laser-Ablation} zur Mikrofabrikation des zentralen Rinne ^10,11 werden. Einige Techniken können mehr mühsam oder kostspieliger als andere. Wir haben eine einfache und kostengünstige Konstruktion eines Assays für .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bezeichnung des Gegenstands	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
			Neuronale Vorläuferzellen Isolation
2 M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g in 100 ml dH 2 O gelöst
1M KCl	Sigma	P5405	7,456 g in 100 ml dH 2 O gelöst
1M MgCl 2	Sigma	M2393	20,33 g in 100 ml dH 2 O gelöst
155 mM NaHCO 3	Sigma	S5761	1,302 g in 100 ml dH 2 O gelöst
0,5 M Glucose	Sigma	G6152	9,01 g gelöst in 100ml dH 2 O
108 mM CaCl 2	Sigma	C7902	1,59 g in 100 ml dH 2 O gelöst
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070
Rinderpankreas Trypsin	Sigma	T1005
Sheep Hoden Hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurensäure	Sigma	K3375
Ovomucoid Trypsininhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7,5% NaHCO 3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23,83 g in 100 ml dH 2 O gelöst
L-Glutamin	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Rekonstituieren in 1 ml Hormon-Mix und Aliquote in 20 ul Einheiten.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Rekonstituieren in 0,5 ml Hormon-Mix und Aliquote in 20 ul Einheiten.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-Transferrin	R & D Systems	3188-AT	0,1 g in 4 ml dH 2 0 gelöst
Putrescin	Sigma	P7505	Auflösen 9,61 mg in Apo-Transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	25 mg in 0,5 ml 0,1 N HCl und fügen Sie 3,5 ml dH 2 0
Selen	Sigma	S9133
Progesteron	Sigma	P6149
Standard Dissection Werkzeuge	Fine Science Tools
Dissektionsmikroskop	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Vorbereitung
Platz Glasabdeckung Dias	VWR	16004
6N Salzsäure	VWR	BDH3204-1
Hochvakuumfett	Dow Corning
60 mm Petrischalen	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-Lysin	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Tauwetter und Aliquot in 150 ul-Einheiten
FBS	Invitrogen	10082139	Nur verwenden, wenn induzieren NPC Differenzierung, ansonsten SFM + EFH Kulturmedien wie oben angegeben
Zählen Mikroskops	Olymp	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silberdraht	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Hitze Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC-Schlauch	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Bleichmittel	Clorox
10-ml-Spritze	BD	309604
18-Gauge-Nadel	BD	305195
Dremel Bohrmaschine	Dremel	Modell 750
Inverses Mikroskop mit befeuchteten, bebrütete Kammer ausgestattet	Zeiss	Axiovert-200M
			Rezepte Artikel Volumen 2 M NaCl 6,2 ml 1M KCl 0,5 ml 1M MgCl 2 0,32 ml 155mm NaHCO 3 16,9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl 2 0,09256 ml Penicillin-Streptomycin 1 ml Wasser autoklaviert 74 ml Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit Artikel Volumen oder Masse Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit 30 ml Rinderpankreas Trypsin 40 mg Sheep Hoden Hyaluronidase 22,8 mg Kynurensäure 5 mg Trypsin-Lösung Artikel Volumen oder Masse SFM 15 ml Ovomucoid Trypsininhibitor 10 mg Trypsininhibitorlösung Artikel Volumen Wasser autoklaviert 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7,5% NaHCO 3 1,5 ml 1M HEPES 0,5 ml Transferrin, Putrescin-Lösung 4 ml 25 mg Insulin-Lösung 4 ml Selen 100 & mu; L Progesteron 100 ul Hormone Mix (100 ml insgesamt bei -20 ° C) Artikel Volumen Wasser autoklaviert 37,5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7,5% NaHCO 3 0,75 ml 1M HEPES 0,25 ml Hormone mix 5 ml L-Glutamin 0,5 ml Penicillin-Streptomycin 0,5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 ul EGF, 10 ul FGF und 3,66 ul Heparin FBS-SFM: 0,5 ml FBS
Artikel	Volumen
Matrigel	150 ul
SFM	3,6 ml

Artikel	Volumen oder Masse
UltraPure Agarose	300 mg in 10 ml ddH 2 0
SFM Hitzeinaktiviertem FBS	8 ml 2 ml