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Methodenartikel

Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit

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DOI:

10.3791/4228

⸱

3. Oktober 2012

 , 
1German Center for Neurodegenerative Diseases, DZNE, 2Laboratory of Functional Neurogenomics, Department of Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research, University of Tübingen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Fibroblasten von Patienten mit Mutationen in der Parkinson-Krankheit verursachenden Gene stellen ein leicht zugängliches Ex vivo Modell krankheits-assoziierte Phänotypen studieren. Live Cell Imaging bietet die Möglichkeit, morphologische und funktionelle Parameter in lebenden Zellen zu studieren. Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Fibroblasten und anschließende Überwachung der mitochondrialen Phänotypen.

Zusammenfassung

Parkinson-Krankheit (PD) ist die zweithäufigste Bewegungsstörung und betrifft 1% der Menschen im Alter von über 60 1. Da Altern ist der wichtigste Risikofaktor, wird Fälle von PD in den nächsten Jahrzehnten 2 zu erhöhen. Weiter zu pathologischen Proteinfaltung und eingeschränkter Protein Abbauwege wurden Veränderungen der mitochondrialen Funktion und Morphologie als weitere Markenzeichen der Neurodegeneration bei PD 3-11 hingewiesen.

Nach Jahren der Forschung in murinen und humanen Krebszellen in vitro Modellen zur molekularen Mechanismen der Parkinson sezieren, hat die Verwendung von menschlichen Fibroblasten von Patienten und entsprechende Kontrollen als Ex-vivo-Modelle zu einem wertvollen Recherche-Tool, wenn potenzielle Einschränkungen berücksichtigt werden. Anders als unsterblich, sondern künstliche Zelle Modelle primären Fibroblasten von Patienten tragen krankheits-assoziierte Mutationen scheinbar reflektieren wichtige pathologische Merkmale of die humane Erkrankung.

Hier beschreiben das Verfahren der Einnahme Hautbiopsien, Kultivierung humaner Fibroblasten und mit detaillierten Protokollen für wesentliche mikroskopischen Techniken zu mitochondrialen Phänotypen zu definieren. Diese wurden verwendet, um verschiedene Funktionen mit PD verbunden, die relevant für die Funktion der Mitochondrien und Dynamik untersuchen. Ex vivo kann Mitochondrien über den lysosomalen Weg im Hinblick auf ihre Funktion, Morphologie, Kolokalisation mit Lysosomen (die Organellen abbauenden dysfunktionellen Mitochondrien) und Degradation analysierenden . Diese Phänotypen höchst relevant sind für die Identifizierung von frühen Zeichen der PD und können klinische motorischen Symptome in menschlichen Krankheiten Genträgern vorausgehen. Somit können die hier dargestellten Assays als wertvolle Werkzeuge verwendet werden, um pathologische Merkmale von Neurodegeneration identifizieren und dazu beitragen, neue therapeutische Strategien PD definieren.

Protokoll

Ein. Haut-Biopsie und Kultivierung von humanen Fibroblasten

  1. Die Hautbiopsie muss von einem erfahrenen Arztes eingenommen werden. Der Eingriff erfolgt unter sterilen Bedingungen und erfordert örtlicher Betäubung. Typische Stellen für die Biopsie verwendet werden, sind die innere Seite der oberen Schulter, Arm oder Rücken.
  2. Sie können 4x4mm oder 6x6mm Durchmesser Probe durch Stanzbiopsie zu ergreifen, um genügend Gewebe für die Kultivierung humaner Fibroblasten erhalten.
  3. Schneiden Sie die Haut in gleiche kleine Stücke Biopsie unter sterilen Bedingungen, um sie in 2-4 T25-Kolben zu trennen. Jeder Kolben sollte 2-3 Stück der Epidermis. Kulturmedienvorrichtung enthält 15% FCS, 1,1% Natriumpyruvat und 1% Penicillin / Streptomycin in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium.
  4. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Die erwartete Laufzeit bis zum ersten Fibroblasten wachsen aus dem epidermalen Probe 1-2 Wochen. Wenn das Wachstum dennoch Probleme auftreten, können Sie Gebrauch machen von Fibroblasten-Wachstumsfaktor factor (5-10 ng / ml FGF2) Verbesserung Wachstums von Zellen.
  5. Sobald eine Zelle Konfluenz von 50-70% erreicht ist, können die primären humanen Fibroblasten eingefroren. Die Zeit, bis 50-70% Konfluenz erreicht ist, unterscheidet sich unter Zelllinien. Frieren Sie die Fibroblasten in 90% FCS plus 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).

2. Vorbereitung des menschlichen Fibroblasten für das Live Cell Imaging Microscopy

Im Allgemeinen sollten Versuche mit humanen Fibroblasten mit Durchgängen unter 10 durchgeführt werden, wie Seneszenz-assoziierten Veränderungen können Eigenschaften von Zellen nach mehreren Durchgängen zu ändern. Im Zweifelsfall kann beta-Galactosidase-Assays verwendet, um die Induktion von Alterungsprozessen in den jeweiligen Zellen beurteilen. Im Allgemeinen verwenden Sie keine alten Fibroblasten (siehe oben). Weiterhin mehrere Zelllinien zu vergleichen, mit der gleichen Anzahl von Durchgangs jeder Zelllinie arbeiten. Vergleich verschiedener genetisch homogen Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen empfohlen. Wie jedoch manchmalPatienten, die spezifische Mutationen selten sein, kann dies bedeuten, dass Hautbiopsien von nur einem Patienten mit einer bestimmten Textstelle, Anzahl und verschiedene Steuerleitungen berücksichtigt werden müssen - hier ist es wichtig, die gleiche Passage Anzahl aller Zeilen enthalten gewährleisten. Wenn eine Zelle Konfluenz von 50-70% erreicht ist, aber kein Experiment geplant, sollte Fibroblasten eingefroren.

  1. Am ersten Tag des Experiments, wäscht die beigefügten Fibroblasten einmal mit PBS. Dann lassen sie aus dem Kolben mittels eines unteren Zellablösung Lösung von proteolytischen Enzymen DNase (dh ACCUMAX).
  2. Zählen Sie Ihre Zellen und Samen 50.000-70.000 Zellen in jeder Vertiefung einer 4-Kammer-Deckglas (1,8 cm 2 Kulturfläche pro Well). Dementsprechend wird für den 8-Kammer coverglas, ist die Hälfte der Zellzahl oder ein wenig weniger geeignet (0,8 cm 2 Kulturfläche pro Well). Es ist wichtig, Saatgut sondern eine kleine Anzahl von Zellen, um reale einzellige Analyse durchzuführen. Keine spezielle Beschichtung für den Kammern is benötigt.
  3. Nach 24-48 Stunden kann das Live Cell Imaging Experiment durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass das Live Cell Imaging Mikroskop mit einem Inkubator, der Temperatur und CO 2 Ebenen steuert ausgestattet. Während der Bildaufnahme, eine Atmosphäre von 37 ° C und 5% CO 2 sollte beibehalten werden.
  4. Jeder Live Cell Imaging Messung sollte in mindestens drei unabhängigen Experimenten durchgeführt werden. Insgesamt sollte ein Minimum von 50 Zellen pro Zelllinie abgebildet werden. Die Live Cell Imaging Experimente sowie die Off-line-Analysen müssen unter verblindeten Bedingungen unvoreingenommene Datenerfassung garantiert durchgeführt werden.

3. Messung der mitochondrialen Funktion in lebenden menschlichen Fibroblasten

Für herkömmliche Messung der mitochondrialen Funktion über Mitochondrienmembranpotential (MMP)-abhängigen Farbstoffe, fluoreszierend ist Zellsortierung (FACS) die primäre Methode. Im Fall der humanen Fibroblasten, zelluläre autofluorescence wird häufig beobachtet und können falsch positive Ergebnisse durch Interferenz mit dem eigentlichen Testsystem Signal verursachen. Autofluoreszenz der Regel stärker ausgeprägt mit höheren Zahlen von Passagen von Fibroblasten. Daher bevorzugen wir die Funktion der Mitochondrien der menschlichen Fibroblasten durch live cell imaging microscopy beurteilen.

  1. 24-48 Stunden nach der Aussaat, inkubiere die Fibroblasten in 50 nM des MMP-abhängigen Farbstoff tetramethylrodamine ethylester (TMRE) in RPMI Medium. Diese RPMI Medium sollte fehlt Phenolrot, da dies negative Auswirkungen auf die Bildqualität. 1,6 uM Hoechst-Färbung sollte hinzugefügt werden, um Kerne zu visualisieren.
  2. Inkubieren vorbereiteten Zellen in Färbelösung vom Licht für 15 min geschützt bei 37 ° C und 5% CO 2.
  3. Ersetzen Sie die Färbelösung mit RPMI-Medium (ohne Phenolrot). Gehen Sie ohne Waschschritt und sofort Bildzellen. Verwenden 63x Vergrößerung und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Technik (alternativ Fluoreszenzmikroskopie mitApotome Technik) zu definieren, einzelne Schichten von Zellen. Anwenden 37 ° C und 5% CO 2 bis Zellen während Abbildungsverfahren.
  4. Bei der Abbildung die Fibroblasten, maximale Aufmerksamkeit auf die Anwendung Belichtungszeit von Fluoreszenzlicht TMRE Färbung ausbleichen schnell. Definieren Sie Ihre passende Belichtung Zeit zwischen 200 und 300 ms und nicht mehr als dieses Intervall. Die Bildaufnahme unter standardisierten Einstellungen ist sehr wichtig, da man nicht in der Lage sein würde, um Vergleiche anhand Intensität machen, wenn die Einstellungen verschiedener zwischen Zelllinien sind.
  5. Als definierten Radius um die abgebildeten Zellen wird nach der Belichtung gebleicht, halten Sie die nächsten Gesichtsfeld ausreichend weit von der photogebleichten Abschnitt.
  6. Off-line-Analysen erfolgen mit ImageJ Software (Wayne Rasband; National Institutes of Health, USA).
  7. Wählen Sie Ihre Zelle von Interesse mit einem Auswahl-Werkzeug.
  8. Wandelt Bilder in 8-Bit (Image
  9. Reduzieren unspezifische Lärm by mit dem "Flecken Entfernen"-Funktion (Process
  10. Wählen Sie die "Lookup Tables - Fire" Zustand (Image
  11. Schalten Sie in der Schwelle Funktion dem "Over / Under"-Funktion und stellen Schwelle (Image
  12. Wählen Sie den "analysieren Teilchen"-Option, die Ihnen die mittleren Grauwert für jeden mitochondrialen Partikel nachweisbar (Analyze
  13. Offene Ergebnis-Datei in Excel-Programm und der Mittelwert der mittleren Grauwert der mitochondrialen Strukturen (angezeigt als "Mittel" in der gegebenen excel Ergebnisliste).
  14. Eine Fläche Grundstück zu erstellen, wählen Sie das Plugin "Interaktive 3D-Oberflächen Plot" in "3D" plugin Abschnitt. Hier können Sie weiter anpassen das Grundstück mit verschiedenen Display-Optionen. Ändern der "Original Colors" auf "Spectrum LUT" gibt die Intensität Maßstab für die entsprechende Handlung.
  15. Alternativzur Verwendung TMRE zum Analysieren des mitochondrialen Funktion des menschlichen Fibroblasten via lebender Zellen, einer Kombination aus dem MMP-unabhängigen Farbstoff Mitotracker Grün FM und der MMP-abhängigen Farbstoff Mitotracker CM-H 2 Xros verwendet werden können. Nochmals zum humanen Fibroblasten leben Zelle Mikroskopie bevorzugt wird, aber im Allgemeinen diese Alternative ist auch verwendet worden unter Verwendung von FACS-Analyse in anderen Art von Zellen 12. Bei der Verwendung dieser alternativen Ansatz zur mitochondrialen Funktion in menschlichen Fibroblasten, Schritt 3-7 des Protokolls Abschnitt 5 zu messen "Measurement of mitochondrio-lysosomalen Kolokalisation in lebenden menschlichen Fibroblasten" angewendet werden soll. Damit wird die Überlagerung von Signalen, sowohl von Mitochondrien positiv für Mitotracker Grün FM und Mitotracker CM-H 2 Xros berechnet und gibt die Menge an funktionellem Mitochondrien als Verhältnis zu allen Mitochondrien vorliegt.

4. Messung der mitochondrialen Morphologie in lebenden menschlichen Fibroblasten

  1. 24-48h nach dem Aussäen inkubieren Zellen in 200 nM Mitotracker Grün FM in RPMI-Medium (ohne Phenolrot) vor Licht für 15 min geschützt bei 37 ° C und 5% CO 2. 1,6 uM Hoechst-Färbung sollte verwendet werden, um Kerne hervorzuheben. Mitotracker Grün FM ist ein MMP-unabhängige Farbstoff, der Flecken alle mitochondrialen Strukturen präsentieren.
  2. Vorsichtig waschen die Zellen einmal mit PBS.
  3. Fügen Sie frisches RPMI-Medium (ohne Phenolrot), um Zellen und sofort Bildzellen. Verwenden 63x Vergrößerung und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Technik (alternativ Fluoreszenzmikroskopie mit ApoTome Technik), um einzelne Schichten von Zellen zu definieren.
  4. Offline-Analysen werden unter Verwendung von Software ImageJ entnommen.
  5. Wählen Sie Ihre Zelle von Interesse mit einem Auswahl-Werkzeug.
  6. Wandelt Bilder in 8-Bit (Image
  7. Reduzieren unspezifische Geräusche mit dem "Säubern"-Funktion (Process
  8. Verwenden Sie die Faltung Filter Mitochondrien markierendrial Strukturen (Prozess
  9. Der Schwellenwert eingestellt werden, so dass das Signal-zu-Rausch-Verhältnis geeignet ist (Bild
  10. Durch die Verwendung der "analysieren Teilchen"-Option wird die automatische Identifizierung von mitochondrialen Strukturen basierend auf einer gewählten Pixelgröße eingeleitet (Analysieren
  11. Öffnen Ergebnis-Datei in Excel-Programm. Bei Verwendung von solchen Parametern können Analysen Mitochondrienmorphologie durchgeführt werden. Dies umfasst die Bestimmung des Formfaktors die den Grad der Verzweigung eines mitochondrialen Netzwerk [Formel: (Umfang 2) / (4 * PI () *-Bereich)] sowie das Längenverhältnis, die die Länge der Mitochondrien (Formel: major Achsen / Nebenachse).

5. Messung der Mitochondrio-lysosomalen Kolokalisation in lebenden menschlichen Fibroblasten

  1. 24-48 h nach dem Aussäen inkubieren Zellen in 200 nM Mitotracker Grün FM und 100 nM Lyostracker Red DND-99 in RPMI-Medium (ohne Phenolrot) vor Licht für 15 min geschützt bei 37 ° C und 5% CO 2. 1,6 uM Hoechst-Färbung wird verwendet, um Kerne zu markieren.
  2. Ersetzen Sie das Medium durch frisches RMPI Medium (ohne Phenolrot) mit 100 nM Lyostracker Red DND-99. Dieser Farbstoff hat, um während der gesamten Bildgebungssitzung vorliegt. Waschen Sie die Zellen nach Inkubationszeit. Unmittelbar Bild der Zellen. Verwenden 63x Vergrößerung und konfokale Technik (alternativ ApoTome Technik), um einzelne Schichten von Zellen zu definieren.
  3. Offline-Analysen werden unter Verwendung von Software ImageJ entnommen.
  4. Öffnen Sie die beiden jeweiligen Bilder, die Sie gerne in Bezug auf Kolokalisation Status analysieren würde.
  5. Wandelt Bilder in 8-Bit (Image
  6. Reduzieren unspezifische Geräusche mit dem "Säubern"-Funktion in beiden Bildern (Process
  7. Wählen Sie das Plugin "Jacop" als Kolokalisation Analyse-Tool, das Ihnen für die jeweiligen Kanäle und berechnet die Pearson-Koeffizient, überlappen Koeffizienten und Manders 'Koeffizient (Plugins

6. Repräsentative Ergebnisse

Die Funktion der Mitochondrien in lebenden menschlichen Fibroblasten können via live cell imaging-Technik ausgewertet werden. Für funktionelle Assays korreliert die TMRE Fluoreszenzsignal mit der mitochondrialen Membranpotentials (MMP). Unter normalen Bedingungen MMP ist der TMRE Fluoreszenz signifikant höher (Abbildung 1A, obere Reihe) als auch unter pathologischen Bedingungen, durch einen reduzierten MMP (1A, untere Reihe) aufweist. Diese Fluoreszenzintensität wird durch Berechnen des Durchschnitts der mittleren Grauwert jedes Mitochondrienstruktur gemessen ( Abbildung 1B). Die Fluoreszenzintensität über ImageJ Software gemessen werden. Hier wird die Verwendung der Option "interaktive Oberfläche plot" ermöglicht die Darstellung verschiedener Intensitäten (Abbildung 1A, rechte Seite).

Neben der Beurteilung des mitochondrialen Funktion in humanen Fibroblasten, können lebender Zellen Mikroskopie verwendet werden, um verschiedene Parameter des Mitochondrienmorphologie definieren. Durch die Verwendung des Farbstoffs Mitotracker Grün FM Mitochondrienstrukturen visualisiert unabhängig von ihrer jeweiligen MMP (Abbildung 2). Dies ist wichtig, um die Einbeziehung aller mitochondrialen Strukturen Gegenwart in der Analysen zu gewährleisten. Mit ImageJ Software wird die Morphologie auf der Grundlage von binären Zahlen analysiert, da nur hier Mitochondrienmorphologie Parametern beurteilt werden kann (Abbildung 2, "binary") werden. Beispiele für Mitochondrienmorphologie Analysen in Bezug auf Form-Faktor sowie Seitenverhältnis wurden kürzlich 6, 1 veröffentlicht3. Ein weiteres wichtiges Merkmal, das in lebendem menschlichen Fibroblasten gemessen werden kann, ist die Verschlechterung der Mitochondrien-Strukturen. Der erste Schritt in dieser Entwicklung kann durch mitochondrio-lysosomalen Kolokalisation im Live Cell Imaging Mikroskopie beurteilt werden. Bestimmten pathologischen Bedingungen zu einem erhöhten Colokalisation Mitochondrien mit Lysosomen (Abbildung 3A). Wiederum wird Mitotracker Grün FM zur mitochondrialen Strukturen unabhängig von ihrer jeweiligen MMP färben. Darüber hinaus Färbung mit LysoTracker Red DND-99 ermöglicht die Visualisierung lysosomalen Strukturen. Es ist kritisch, dass die LysoTracker Red Farbstoff vorhanden ist während des bildgebenden Verfahrens, wie Waschschritte reduzieren das Signal, das zu niedrig ist für die Visualisierung. Kolokalisation erhält klare gelbe Fluoreszenz-Signale aufgrund der Überlappung der grünen (Mitotracker Grün FM) und Rot (LysoTracker Red DND-99) Färbung (weiße Pfeile, Fig. 3A) dargestellt werden, und durch Berechnung des Pearson coe bestimmtizient (Abbildung 3B).

Im Allgemeinen wird für Off-Line-Analysen mit ImageJ Software, ist es hilfreich, eine Zelle pro Bild sichtbar zu machen, so daß die Definition einer bestimmten Region von Interesse (ROI) vermieden werden kann.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Messung der Fluoreszenz TMRE Signal, das den mitochondrialen Membranpotentials (MMP) in lebenden menschlichen Fibroblasten durch Lebendzelldichte Bildgebungstechnik. (A) ein fluoreszierendes TMRE MMP-abhängigen Farbstoff, dessen Fluoreszenz-Intensität korreliert mit der MMP. Hoechst-Farbstoff wurde verwendet, um Kerne (blau) zu färben. Unter normalen Bedingungen MMP (obere Reihe), ist die TMRE Fluoreszenz signifikant höher als unter pathologischen Bedingungen durch eine reduzierte MMP (untere Reihe) aufweist. Fluoreszenzintensität wird zusätzlich angezeigtdie Intensität Oberfläche Grundstück. Maßstab zeigt 10 um. (B) Statistische Analysen der beispielhaften Fibroblasten in (A) gezeigt. Unter pathologischen Bedingungen wird eine verringerte TMRE Fluoreszenz der Mitochondrien im Vergleich zum normalen MMP Zustand gemessen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

figure-protocol-2
Abbildung 2. Messung der mitochondrialen Morphologie in lebenden menschlichen Fibroblasten durch Live Cell Imaging-Technik. Mitotracker Grün FM (grün) verwendet wird, um mitochondriale Strukturen sichtbar zu machen, dafür ist es unabhängig von der MMP. Hoechst-Farbstoff wurde verwendet, um Kerne (blau) zu färben. Mit ImageJ Software kann die Morphologie der binären Zahlen analysiert werden. Maßstab zeigt 10 um. Klicken hier, um eine größere Ansicht Figur.

figure-protocol-3
Abbildung 3. Messung der Kolokalisation von Mitochondrien mit Lysosomen in lebenden menschlichen Fibroblasten durch Live Cell Imaging-Technik. (A) Mitotracker Grün FM (grün) verwendet wird, um Mitochondrienstrukturen färben, Lyostracker Red DND-99 (rot) visualisiert lysosomalen Strukturen. Hoechst-Farbstoff wurde verwendet, um Kerne (blau) zu färben. Erfolgreiche Kolokalisation unter pathologischen Bedingungen wird durch eine gelbe Signal aufgrund der LysoTracker Rot und Mitotracker Grün-Färbung (weiße Pfeile) überschneiden angezeigt. Maßstab zeigt 10 um. (B) Statistische Analysen der beispielhaften Fibroblasten in (A) gezeigt. Ein höheres Maß an mitochondrio-lysosomalen Kolokalisation führt zu einer erhöhten Pearson Koeffizientenwert./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

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Diskussion

Patient Hautfibroblasten als ex vivo Modelle stellen ein wichtiges Instrument zur krankheits-assoziierte genetische Defekte zu charakterisieren. Darüber hinaus sind Haut-abgeleiteten Fibroblasten leicht zugänglich und kann bei Kultivierung erweitert werden. Daher sind primäre Zellen von Patienten tragenden PD-assoziierten genetischen Mutationen erhaltenen gegenüber der Verwendung von Tumorzelllinien bevorzugt, da sie nicht nur das endogene krankheitsverursachende Gen, sondern das gesamte genetische Hintergrund ...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Fritz-Thyssen-Stiftung (10.11.2.153, RK), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KR2119/3-2 und KR2119/8-1, RK), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF unterstützt , NGFNplus; 01GS08134, RK) und durch ein Promotionsstipendium von der gemeinnützigen Hertie-Stiftung [zu LFB]. Wir danken Carolin Obermaier und Julia Westermeier für ihre Unterstützung während der Videoaufnahme.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Namen Reagenz Firma Katalog-Nr.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium 1640 Invitrogen 52400-025
RPMI 1640 Medium, kein Phenolrot Invitrogen 11835-063
Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) Invitrogen 14190-094
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) PeproTech 100-18B
ACCUMAX (Ablösung Lösung) PAA L11-008
Lab-TekTMII chambered Deckgläsern Nalge Nunc International 115382
Tetramethylrodamine ethylester (TMRE) Invitrogen T-669
Mitotracker Grün FM Invitrogen M-7514
Mitotracker CM-H2XRos Invitrogen M-7513
Lyostracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
Hoechst 33342 Invitrogen H-3570

Tabelle 1. Spezifisch Reagenzien und Ausrüstung.

Referenzen

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