Compact Quantum Dots für Einzelmolekül-Imaging

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Herstellung von kolloidalen Quantenpunkten mit minimierter hydrodynamische Größe für Einzel-Molekül-Fluoreszenz-Imaging. Im Vergleich zu herkömmlichen Quantenpunkte sind diese Nanopartikel in der Größe ähnlich zu globularen Proteinen und sind für Einzel-Molekül-Helligkeit, Stabilität gegen Photodegradation und Beständigkeit gegen unspezifische Bindung an Proteine ​​und Zellen optimiert.

Zusammenfassung

Single-Molecule Imaging ist ein wichtiges Instrument für das Verständnis der Mechanismen der biomolekularen Funktion und zur Visualisierung der räumlichen und zeitlichen Heterogenität der molekularen Verhaltensweisen, die Zellbiologie ^1-4 zugrunde liegen. Zum Abbilden eines einzelnen Moleküls von Interesse, ist es typischerweise konjugiert an einen fluoreszierenden Marker (Farbstoff, Protein, Kügelchen oder Quantenpunkt) und beobachtet mit Epifluoreszenz oder Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie. Während Farbstoffe und fluoreszierende Proteine ​​gewesen die Hauptstütze der Fluoreszenz-Bildgebung Jahrzehnten ist ihre Fluoreszenz unter hohem Photonenflüsse notwendig, einzelne Moleküle zu beobachten instabil, was nur wenige Sekunden der Beobachtung vor dem vollständigen Verlust des Signals. Latexkügelchen und Farbstoff-markierten Kügelchen eine verbesserte Signalstabilität aber auf Kosten drastisch größere hydrodynamische Größe, die nachteilig zu verändern, kann die Diffusion und das Verhalten des untersuchten Moleküls. ntent "> Quantum Dots (QDs) bieten eine Balance zwischen diesen beiden problematischen Regime. Diese Nanopartikel aus Halbleitermaterialien bestehen und kann mit einem hydrodynamisch kompakte Größe mit außergewöhnlicher Beständigkeit gegen Photodegradation ⁵ konstruiert werden. So ist in den letzten Jahren QDs wurden in ermöglicht instrumental Langzeitbeobachtung von komplexen makromolekularen Verhalten auf der Ebene einzelner Moleküle. Allerdings sind diese Teilchen noch gefunden zu einer Beeinträchtigung der Diffusion in überfüllten molekularen Umgebungen wie dem Zytoplasma und der neuronalen synaptischen Spalt, wo ihre Größen sind immer noch zu groß ^4,6 aufweisen ^{, 7.}

Vor kurzem haben wir die Kerne und Oberflächenbeschichtungen von QDs für minimierte hydrodynamischen Größe ausgelegt, während Balancing Offsets kolloidalen Stabilität, Photostabilität, Helligkeit und unspezifische Bindung, die den Nutzen der kompakten QDs behindert haben in der Vergangenheit ^8,9. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigendie Synthese, Modifizierung und Charakterisierung dieser optimierten Nanokristalle aus einem legierten Hg _x Cd _1-x Se-Kern mit einer isolierenden Cd _y Zn _1-y S Schale, weiter mit einem mehrzähnigen Liganden mit kurzer Polymer Polyethylenglykol modifiziert beschichtet ist ( PEG)-Ketten (Abbildung 1). Verglichen mit herkömmlichen CdSe-Nanokristalle, bieten Hg _x Cd _1-x Se-Legierungen größer Quantenausbeuten der Fluoreszenz Fluoreszenz bei rotem und nahes Infrarot-Wellenlängen für verbessertes Signal-zu-Rauschen in Zellen, und Anregung bei nicht zytotoxische sichtbaren Wellenlängen. Mehrzähnigen Polymerbeschichtungen binden an den Nanokristalloberfläche in einem geschlossenen und flache Konformation hydrodynamischen Größe zu minimieren, und PEG neutralisiert die Oberflächenladung auf unspezifische Bindung an Zellen und Biomolekülen zu minimieren. Das Ergebnis ist ein hell fluoreszierende Nanokristall mit Emission zwischen 550-800 nm und insgesamt hydrodynamische Größe der Nähe von 12 nm. Dies ist in der same Größenbereich so viele lösliche globuläre Proteine ​​in Zellen, und wesentlich kleiner als bei konventionellen PEGylierte QDs (25-35 nm).

Protokoll

Die folgenden Synthese-Verfahren beinhalten Standard luftfreien Techniken und die Verwendung einer Vakuum / Inertgas Verteiler; detaillierte Methode können in Referenzen 10 und 11 gefunden werden. MSDS für alle potenziell toxischen und brennbaren Stoffen sollten vor Gebrauch konsultiert werden und alle brennbaren und / oder Luft-labile Verbindungen sollten in Septum verschlossenen Fläschchen in einem Handschuhfach oder Handschuhsacks aliquotiert werden.

Ein. Synthese von Mercury Cadmium Selenide (Hg _x Cd _1-x Se) Quantum Dot Cores

1. Bereiten Sie eine 0,4 M Lösung von Selen in Trioctylphosphin (TOP). Fügen Sel....

Ergebnisse

2 zeigt repräsentative Absorptions und Fluoreszenzspektren für CdSe-Nanokristalle, Hg _x Cd _1-x Se-Nanokristallen nach Kationenaustausch und Hg _x Cd _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S-Nanokristallen auf Granate Wachstum. Die Kern CdSe-Nanokristalle eine Quantenausbeute der Fluoreszenz der Nähe von 15% (einschließlich langwelligen tief-Trap-Emission), aber dieser Wirkungsgrad sinkt auf weniger als 1% nach Quecksilber Austausch, wahrscheinlich aufgrund .......

Diskussion

Im Vergleich zu herkömmlichen CdSe Quantenpunkten, können ternäre Legierung Hg _x Cd _1-x Se-Nanokristalle in der Größe und Fluoreszenzwellenlänge unabhängig eingestellt werden. Die Größe wird zuerst während der Synthese von CdSe Nanokristall Kernen ausgewählt und der Fluoreszenzwellenlänge in einem sekundären Quecksilber Kationenaustauschschritt, welche im Wesentlichen nicht verändern die Nanokristallgröße ⁹ übernommen. Es ist wichtig, damit das gereinigte Hg _x Cd _1-x

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Selen	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphin	Strem	15-6655	97% rein, Luft instabil
Cadmiumoxid	Sigma-Aldrich	202894	Sehr giftig: Vorsicht
Tetradecylphosphonsäure	PCI Synthese	4671-75-4
Octadecene	Alfa Aesar	L11004	Technische Qualität
Hexadecylamin	Sigma-Aldrich	H7408
Diphenylphosphine	Sigma-Aldrich	252964	Pyrophore
Quecksilberacetat	Sigma-Aldrich	456012	Sehr giftig: Vorsicht
1-Octanthiol	Sigma-Aldrich	471836	Starker Geruch
Ölsäure	Sigma-Aldrich	W281506
Zinkacetat	Alfa Aesar	35792
Cadmium acetathydrat	Sigma-Aldrich	229490	Sehr giftig: Vorsicht
Oleylamin	Fisher Scientific	AC12954	Luft instabil
Schwefel	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphinoxid	Strem	15-6661	99%
Pyridin	VWR	EM-PX2012-6	Wasserfrei
Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M1753	Starker Geruch
Triethylamin	Sigma-Aldrich	471283	Wasserfrei
Dialyseschlauch	Spectrum Labs	131342	Cutoff 20 kDa
Zentrifugalfilter	Millipore	UFC801024	Cutoff 10 kDa
Mono-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4 - (4,6-Dimethoxy-1 ,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium-chlorid-Hydrat	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus-Chromatographie-System	GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL Chromatographiesäule	GE HealthCare	17-5172-01
Agarose, Omnipur	VWR	EM-2120
			Anhang Synthese von Quecksilber octanethiolate: Langsam eine Methanollösung von Quecksilberacetat (1 eq.) Zu einer gerührten Lösung von 1-Octanthiol (3 Äq.) Und Kaliumhydroxid (3 Äq.) In Methanol bei Raumtemperatur. Isolieren Sie das Quecksilber (II) octanethiolate Niederschlag durch Filtration, waschen zweimal mit Methanol und einmal mit Ether und dann im Vakuum getrocknet. Synthese von mehrzähnigen Polymer: Lösen Polyacrylsäure (1 g, 1.773 Da) in 25 ml Dimethylformamid (DMF) in einem 150 ml-Dreihalskolben und Blase mit Argon für 30 min. Fügen Sie eine wasserfreie Lösung von Cysteamin (374 mg, 4,87 mmol) in 10 ml DMF. Bei Raumtemperatur unter kräftigem Rühren langsam wasserfreies Diisopropylcarbodiimid (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) über 30 min, gefolgt von Triethylamin (170 ul, 1,22 mmol) gefolgt, und um die Reaktion für 72 Stunden bei 60 ° C. Hinzufügen Mercaptoethanol (501 mg, 6,41 mmol), um die Reaktion zu quenchen, und rühre für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Entfernen DMF durch Rotationsverdampfung und Isolierung des Polymers mit dem Zusatz von einem 2:1-Gemisch von eiskaltem Aceton: Chloroform, gefolgt von Zentrifugation. Lösen des Polymers in ~ 5 ml wasserfreiem DMF, Filter, Niederschlag nochmals mit Diethylether, und wiederholen. Trocknen Sie das Produkt unter Vakuum und speichern unter Argon. Bestimmung von CdSe Kerndurchmesser: Von der UV-Vis-Absorptionsspektrum bestimmt die Wellenlänge des ersten Exciton-Peak (λ in nm), die am längsten Wellenlängenspitze (z. B. etwa 498 nm für CdSe in Abbildung 2a), und verwenden Sie die Dimensionierung Kurve Mulvaney und Mitarbeiter 12: Bestimmung von CdSe Nanokristall Konzentration: Aus einem Hintergrund-subtrahierten UV-Vis-Spektrum einer optisch klaren Lösung von CdSe-Nanokristallen, bestimmen die Absorption bei 350 nm Wellenlänge. Reihenverdünnungen kann ermittelt werden, wenn die optische Absorption innerhalb des linearen Bereichs des Beerschen Gesetz ist. Der Nanokristall Konzentration (QD, in M) durch Einstecken des Nanokristalls Durchmesser (D, in nm), der optischen Absorption Wert (A 3sa) und der Küvette Weglänge (l, in cm) in die folgende Gleichung bestimmt werden aus die empirische Korrelation von Bawendi und Mitarbeiter 13: