Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Marko Popovic; Xin Gao; Dejan Zecevic

doi:10.3791/4261

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Methodenartikel

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

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DOI:

10.3791/4261

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29. November 2012

Marko Popovic¹ , Xin Gao¹ , Dejan Zecevic¹

¹Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein bildgebendes Verfahren zur Überwachung des Membranpotentials Änderungen mit sub-Mikrometer-räumlichen und Sub-Millisekunden zeitlicher Auflösung beschrieben. Die Technik, auf Laseranregung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht Messungen von Signalen in Axonen und Axon Kollateralen, Terminal dendritische Äste, und einzelne dendritischen Dornen.

Zusammenfassung

Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften und funktionelle Organisation der einzelnen Neuronen und wie sie Informationen verarbeiten ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis, wie das Gehirn funktioniert. Die primäre Funktion einer beliebigen Nervenzelle ist, um elektrische Signale, in der Regel von verschiedenen Quellen verarbeiten. Elektrische Eigenschaften neuronaler Prozesse sind außerordentlich komplex, dynamisch und in der allgemeinen Fall unmöglich, in Abwesenheit von detaillierte Messungen vorauszusagen. Um eine solche Messung würde man erhalten, idealerweise gerne in der Lage zu überwachen, an mehreren Standorten, unterschwelligen Ereignisse, wie sie von den Websites der Herkunft auf die neuronale Prozesse und summieren an bestimmten Orten zu Aktionspotential Einleitung beeinflussen reisen. Dieses Ziel wurde in keiner Neuronen aufgrund technischer Einschränkungen von Messungen, die Elektroden beschäftigen erreicht worden. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist es höchst wünschenswert, um den Patch-Elektrode Ansatz mit bildgebenden Verfahren, die umfangreiche parallel recordin ermöglichen ergänzengs von allen Teilen eines Neurons. Hier beschreiben wir eine solche Technik - optische Aufzeichnung des Membranpotentials Transienten mit organischen spannungsabhängigen Farbstoffen (V _m-imaging) - gekennzeichnet durch Sub-Millisekunden-und Sub-Mikrometer-Auflösung. Unsere Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten zur Spannungs-sensitive molekulare Sonden ² basiert. Viele Aspekte der anfänglichen Technologie wurden kontinuierlich über mehrere Jahrzehnte ^{3, 5, 11} verbessert. Zusätzlich früheren Arbeiten zwei wesentliche Merkmale von V _m-imaging dokumentiert. Erstens sind Fluoreszenzsignale linear proportional zu Membranpotentials über den gesamten physiologischen Bereich (-100 mV bis +100 mV, ^{10, 14, 16).} Zweitens, Be-Neuronen mit der Spannung-empfindlichen Farbstoff welche hier (JPW 3028) nicht nachweisbare pharmakologische Wirkungen. Die aufgezeichneten Verbreiterung der Spitze während der Farbstoff Laden ist vollständig reversibel ^{4, 7.} Zusätzlich zeigt experimentelle Hinweise, dass es möglich ist, zu erhalteneine beträchtliche Anzahl (bis zu hundert) von Aufnahmen vor nachweisbare phototoxische Effekte ^{4, 6, 12, 13.} Derzeit nutzen wir die hervorragende Helligkeit und Stabilität einer Laserlichtquelle bei nahezu optimale Wellenlänge, um die Empfindlichkeit des V _{m-Bildgebungstechnik} zu maximieren. Die aktuelle Sensitivität ermöglicht mehreren Standorten optische Aufnahmen von V _m Transienten aus allen Teilen eines Neurons, einschließlich Axonen und Axon Sicherheiten, Terminal dendritischen Zweigen, und einzelne dendritische Dornen. Die erfassten Informationen zu Signals Wechselwirkungen kann quantitativ als auch direkt visualisiert in Form eines Films analysiert werden.

Protokoll

Ein. Aufstellbedingungen

Schritt 1.1. Imaging Setup

Der Schlüssel zur Aufzeichnung Spannung Farbstoff Signale entsprechende Setup-Design. Wir verwenden eine aufrechte Mikroskop (BX51WI Olympus oder Zeiss AxioExaminer) mit drei Kameras ausgestattet. Das Setup wird für die Beleuchtung von einzelnen Neuronen in Hirnschnitten von Anregungslicht in Auflicht-Fluoreszenz, Weitfeldmikroskopie-Modus entweder mit Nikon 60X/1.0 NA oder Zeiss 63X/1.0 NA Wasser Eintauchen Ziele entwickelt. Unsere Mikroskope sind eine Schwingungsisolierung Tisch verschraubt und mit motorisierten beweglichen Stufen. Jedes Mikroskop ist mit drei K....