Modellering intracerebral blødning i Mus: Injeksjon av autologt blod eller bakteriell collagenase

Summary

Klinisk relevante dyremodeller av intracerebral blødning (ICH) for å utvide vår kunnskap om hjerneslag og å undersøke nye terapeutiske strategier. I denne studien beskriver vi og vurdere to ICH modeller som implementerer ensidige injeksjoner av enten autologt fullblod eller bakteriell collagenase i basalgangliene (corpus striatum) av mus.

Abstract

Spontan intracerebral blødning (ICH) definerer en potensielt livstruende nevrologisk sykdom som står for 10-15% av alle hjerneslag-relaterte sykehusinnleggelser og som ingen effektiv behandling er tilgjengelig for å date ^1,2. På grunn av heterogeniteten av ICH hos mennesker, er ulike prekliniske modeller måtte grundig utforske potensielle terapeutiske strategier ^3. Eksperimentell ICH er ofte indusert i gnagere ved intraparenchymal injeksjon av enten autologt blod eller bakteriell collagenase ^4. Den aktuelle modellen velges basert på patofysiologien for blødning induksjon og skade progresjon. Blodet injeksjon modellen etterligner en raskt framover blødning. Alternativt, bakteriell collagenase enzymatisk forstyrrer basal lamina av hjernen kapillærer, forårsaker en aktiv blødning som vanligvis utvikler seg over flere timer ^5. Resulterende perihematomal ødem og neurofunctional underskudd kan kvantifiseres from begge modellene. I denne studien, beskrev vi og evaluert en modifisert dobbelt injeksjon modell av autologt helblod ⁶ samt en ICH injeksjon modell av bakteriell kollagenase ^7, som begge er rettet mot basalgangliene (corpus striatum) av mannlige CD-1 mus. Vi vurderte neurofunctional underskudd og hjerne ødem ved 24 og 72 timer etter ICH induksjon. Intrastriatal injeksjon av autologt blod (30 pl) eller bakteriell collagenase (0.075U) forårsaket reproduserbare neurofunctional underskudd i mus og betydelig økt hjerne ødem på 24 og 72 timer etter operasjonen (p <0,05). I konklusjonen, begge modellene gi konsistente hemoragisk infarkt og representerer grunnleggende metoder for preklinisk ICH forskning.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og godkjent av Animal Care og bruk komité ved Loma Linda University.

1. Presurgical Forberedelser

Aseptiske teknikker anbefales for alle kirurgiske prosedyrer. Desinfisere stereotactic apparater og forberede sterile kirurgiske verktøy før operasjonen. Bruk personlig verneutstyr (PVU) under alle dyr håndtering. Bruk en varmepute under kirurgi for å opprettholde dyrets fysiologiske kroppstemperatur.

1. Vei 8-12 uker gamle mus med en trippel bjelke dyr skala.
2. Co-injisere ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) intraperitonealt så la 7-10 min for anestesi skal tre i kraft (monitor for en tilstrekkelig sedasjon).
3. Plasser musen på et varmeteppe og barbere hodebunnen.
4. Påfør ophthalmic sårsalve til begge øynene.
5. Sikreluftveier, ved å forsiktig bevege tungen sideveis, og nøye sikre musen hodet på stereotactic apparatet. Merk: Hodet må festes horisontalt til grunnlaget for stereotaktisk ramme.
6. Desinfiser den kirurgiske området med Betadine, og skyll med 70% etanol. Gjenta alternerende anvendelser av Betadine og 70% etanol for totalt tre ganger. Bomull-tipped applikatorer kan brukes til dette formålet.

2. Blood Injection Model

1. Lage en 1 cm lang midtlinjesnitt av hodebunnen med en # 10 skalpell blad.
2. Bruk bomull spisser applikatorer å rydde bort bløtvevet dekker skallen, for å eksponere den vinkelrette skjæringspunktet den koronale og sagittal sutur (bregma).
3. Monter Hamilton sprøyten (250 pl) på innsprøytningspumpen, og stereotaxically direkte nålen (26 Gauge) over bregma.
4. Deretter justere stereotactic manipulator armene for å plassere nålen 0,2 mm anterior og 2mm lateralt til høyre. På disse koordinatene lage et lite cranial Burr hull, med en variabel hastighet drill med en 1 mm bor.
5. Suspender dyrets hale og desinfisere sin nedre overflate med 70% etanol.
6. Punktering den sentrale halen arterien med en steril nål (f. eks 26 Gauge) og samle den arterielle blod inn en unheparinized kapillarrør.
7. Overfør blodet raskt fra kapillærrøret i glasset fat av Hamilton sprøyten, og deretter sette stempelet.
8. Sett den nå 30 pl eller flere av arterielt blod som inneholder Hamilton sprøyte på injeksjonspumpen og sett nålen (med sin skråkant vendt mot sagittal sutur) gjennom graden hull like før sin bevel er ikke lenger synlig.
9. Fra dette punktet forhånd nålen 3 mm ventrally og injisere 5 pl av autologt blod med en hastighet på 2 ul / min.
10. Etter ferdigstillelse av den første injeksjonen forhånd nålen 0,7 mm lenger i dybden.
11. Vent til5 min og deretter injisere 25 pl av blod inn i høyre striatum.
12. Ved gjennomføring av den andre injeksjonen, la nålen i stilling for ytterligere 10 min, før uttak det med en hastighet på 1 mm / min.
13. Forsegle graden hullet med bein voks og sy igjen huden.
14. For postoperativ analgesi injisere 0,05 mg / kg av buprenorfin subkutant i forvarmede væsker (normalt saltvann).

3. Collagenase Injection Model

1. Etter de presurgical preparater, gjenta trinn 1-4 som beskrevet for blod injeksjon modellen.
2. Fyll Hamilton sprøyten (10 ul) med 0.075U av bakteriell (clostridial) kollagenase VII-S oppløst i 0,5 pl saltvann. Unngå dannelse av luftbobler.
3. Sett Hamilton sprøyten på injeksjonspumpen og sett nålen (26 gauge), gjennom graden hull like før sin bevel er ikke lenger synlig.
4. Advance nålen 3,7 mm ventrally og injisere 0.075U av collagenase into høyre striatum ved en hastighet på 2 ul / min.
5. Ved gjennomføring av injeksjonen, la nålen i stilling for ytterligere 10 min, før uttak det med en hastighet på 1 mm / min.
6. Forsegle graden hullet med bein voks og sy igjen huden.
7. Injisere 0,05 mg / kg av buprenorfin subkutant i forvarmet postoperative væsker.

4. Humbug Drift

1. Etter de presurgical preparater, gjenta trinn 1-4 som beskrevet for blod injeksjon modellen.
2. Sett nålen (26 Gauge) 3,7 mm ventrally gjennom graden hullet. Nålen bør forbli i posisjon i 10 min før de ble trukket med en hastighet på 1 mm / min.
3. Forsegle graden hullet med bein voks og sy igjen huden.
4. Injisere 0,05 mg / kg av buprenorfin subkutant i forvarmet postoperative væsker.

5. Representant Resultater

Eksperimentell intrastriatal blødning fremkaller morfologiske somsamt atferdsendringer hos gnagere. Disse endringene kan evalueres for å sikre en tilstrekkelig gjennomføring av prosedyren, eller å undersøke effektene av mulige behandlinger. Generere blø i en målrettet hjernen (f.eks basal ganglia) er mest avgjørende for en reproduserbar tilnærming, og kan bekreftes på brutto eller histologisk beiset hjernen seksjoner (figur 1-2). Skade på basalgangliene resultater i motoriske underskudd, som kan kvantifiseres gjennom ulike atferdsmessige vurderinger. Resultater av hjørnet turn testen viste at etter eksperimentell høyresidig ICH, mus slått vesentlig oftere ipsilaterally og bort fra svekket kontralaterale (venstre) side, enn forloren opererte dyr ved 24 og 72 timer etter operasjonen (figur 3 A). Videre evne til adekvat plassere det svekkede (venstre) forbena på en overflate, etter vibrissae stimulering, ble evaluert via forbena plassere testen. På 24 og 72 timer etter operasjonen, mus subdefekter utsettes til høyresidig ICH viste signifikant færre plasseringer enn humbug opererte dyr. Måling av hjerneødem er ofte ansatt for å kvantifisere omfanget av hjerneskade etter eksperimentell ICH. Intracerebral injeksjoner av autologt blod (30 pl) eller bakteriell collagenase (0.075 U) førte til en betydelig økning av hjernen vanninnhold i ipsilaterale cortex og basalgangliene på 24 (figur 4 A) og 72 timer (figur 4 B) etter kirurgi ( sammenlignet med sham). Utfallet av atferden testene (figur 3) og i hvilken grad av hjerneødem (figur 4) viste ingen forskjell mellom blodet og kollagenase injeksjon modeller ved gitte volumer.

Figur 1. Modeling ICH hos mus. (A) Det forenklede skjematisk av en koronale hjerne seksjon 0,2 mm anterior av bregma illustrerer proposed plassering av autologt blod eller collagenase injeksjon. Den laterale ventrikkel er merket LV. Cpu står for caudatus-putamen, en del av striatum, og GP identifiserer globus pallidus. Begge, striatum samt globus pallidus tilhøre en gruppe av sub-kortikal atomkjerner, også kjent som basalgangliene. (B) Representative mikrofotografi av en koronale hjerne seksjon 0.2mm anterior av bregma, oppnådd ved 24 timer etter injeksjon av intrastriatal autologt helblod.

Figur 2. Histologisk manifestasjon av hematom. Representant hematoxylin og eosin (H & E) farget koronale cryosection (10 mikrometer) av en mus hjernen, illustrerer hematom størrelse på 24 timer etter intrastriatal injeksjon av bakteriell collagenase (0,075 U). LH = venstre hjernehalvdel, RH = høyre hjernehalvdelen.

< img alt = "Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/4289/4289fig3.jpg" />
Figur 3. Neurofunctional vurderinger etter eksperimentell ICH hos mus. Intrastriatal injeksjon av autologt blod (30 pl) eller bakteriell collagenase (0,075 U) forårsaket reproduserbare neurofunctional underskudd. (A) Mus etter eksperimentell ICH viste signifikant mer høyresvinger enn humbug opererte dyr på 24 og 72 timer etter operasjonen. (B) å plassere forpotens kapasiteten av venstre lem ble svekket etter ICH ved 24 og 72 timer etter operasjonen. Verdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM og analysert med Kruskal-Wallis One Way variansanalyse på Rangeringer, etterfulgt av Student-Newman-Keuls Method. AP verdi på <0,05 ble ansett som statistisk signifikant, n = 6-12 per gruppe, * P <0,05 sammenlignet med humbug. Klikk her for å se større figur .

igur 4 "src =" / files/ftp_upload/4289/4289fig4.jpg "/>
Figur 4. Evaluering av hjernen vanninnhold følgende eksperimentelle ICH hos mus. Intracerebral injeksjon av autologt blod (30 ul) eller bakteriell kollagenase (0,075 U) førte til signifikant økning av hjernen vanninnhold i ipsilaterale cortex og basalgangliene ved 24 (A) og 72 timer (B) etter ICH-induksjon. Verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM og analysert med enveis variansanalyse, etterfulgt av Tukey post hoc test. AP verdi på <0,05 ble ansett som statistisk signifikant, n = 6-10 per gruppe, * P <0,05 sammenlignet med humbug. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Dyremodeller av intracerebral blødning (ICH) bidra sterkt til en avansert forståelse av sykdommens patofysiologi, og blir ofte brukt til å utvikle og evaluere nye terapeutiske strategier i en preklinisk innstilling. Intraparenchymal injeksjoner av autologt blod eller bakteriell collagenase er veletablerte metoder for å generere ICH hos gnagere. Begge metoder ble opprinnelig utviklet i rotte, men på grunn av den raskt økende tilgjengelighet av transgene og knockout stammer, mus ble uunnværlig å ytterligere belyse mekanismer hemorragisk hjerneskade ^8.

Hos mennesker, utgjør basalgangliene blødning for ca 50% av alle hemoragisk slag, og pasienter som overlever første arrangementet ofte utvikle skadelige neurofunctional underskudd ^1. Følgelig, fremkaller eksperimentell ICH hos gnagere, involverer basalgangliene, motoriske underskudd i dyrets kontralaterale ekstremiteter. TilHittil har flere atferd vurderinger blitt utviklet for å karakterisere disse svekkelser i mus og rotter ^9,10.

I foreliggende studie, beskrev vi og evaluert en modifisert dobbelt injeksjon modell av autologt helblod ⁶ samt en ICH injeksjon modell av bakteriell kollagenase ^7, både målretting basalgangliene (corpus striatum) i mus. Vi evaluerte atferdsmessige underskudd via hjørnet turn og forbena plassere test ^9,11 og observert økt sensorimotor svekkelser i begge modeller på 24 og 72 timer etter operasjonen (figur 3). På disse tidspunktene ingen signifikante forskjeller ble funnet mellom ICH gruppene, men tidligere studier antydet en langvarig skade progresjon etter collagenase injeksjon, noe som gjør det til en mer egnet modell for langsiktige studier av ^fem. Hjerneødem (hjerne vanninnhold) ble målt ved hjelp wet-weight/dry-weight metoden som tidligere rapportert ^12,13.Våre resultater viste en signifikant økning i perihematomal hjerneødem ved 24 og 72 timer etter at ICH induksjon (figur 4). Alle mus utsatt for eksperimentell ICH eller simulert kirurgi overlevde til dag offer (dødelighet = 0%).

De to beskrives ICH Modellene bruker en stereotactically-assistert kirurgi for å sikre nøyaktige og reproduserbare injeksjoner av blod eller collagenase inn målrettede hjernen. En liten kraniotomi (1 mm burr hull) er nødvendig for dette formålet. Det er vesentlig for å unngå perforering av dura ved borkronen, siden denne unøyaktighet ville forverre skaden og resulterer i tilbakestrøm av blod eller kollagenase under injeksjonen.

Opprinnelig ble blodet injeksjon modellen utviklet som en enkelt intracerebral injeksjon ^14, men det ofte produsert inkonsistente utfall grunnet tilbakestrøm av blod langs nålen tarmkanalen ^15. For å minimere denne komplikasjon ble en dobbel injeksjon metode utviklet, Der en liten mengde av blod er injisert rett ovenfor målrettede hjernen området, etterfulgt av en andre injeksjon av blod inn basalgangliene ^6. Koagulert blod av den første injeksjonen, hindrer tilbakestrømning langs nålen tarmkanalen. Denne modellen imiterer en rask utvikling hematom, men ikke forårsaker selve bruddet av cerebrale blodkar. En stor fordel med den autologt blod injeksjon modellen er at ingen andre faktorer, for eksempel eksogene proteiner, blir brukt til å indusere ICH. Alternativt etterligner bakteriell collagenase modellen en spontan intracerebral blødning som utvikler seg over flere timer, som utstilt hos omtrent 30% av alle ICH pasienter ^5. Bakteriell collagenase er en protease som lyserer den ekstracellulære matrix rundt cerebral kapillærene og svekker dem, forårsaker fartøy brudd og påfølgende blod ekstravasasjon ^16. Denne modellen er generelt brukt for å undersøke mekanismer for hematom utvidelse samt å utvikle prospektive behandlinger som påvirker homeostase. Men bakteriell collagenase, kan forsterke den inflammatoriske responsen og presentere nevrotoksiske effekter ved høye doser ^tre. Videre kan omfattende blødninger etter den intracerebral collagenase injeksjon produsere - i motsetning til humant ICH patologi-en iskemisk cerebral skade.

Interessant, viste hunnmus utsatt for eksperimentell ICH en betydelig raskere gjenoppretting av neurofunctional underskudd enn hanndyr ^8. Lignende funn er gjort i iskemiske hjerneslag modeller, og dermed mannlige gnagere er mer vanlig implementert for studier av hjerneslag patologi og behandling evaluering ^17.

I disse eksperimentene vi utnyttet intraperitoneal co-injeksjoner av anestetika ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg), for så vel ICH modellene, men har tidligere studier rapportert forekomsten av akutt hyperglykemi hos bedøvede gnagere, starter innen 20 minutter etter ketamine og xylazin injeksjon ^18. Videre kan ketamin, en N-metyl d-aspartat (NMDA), muligens redusere NMDA reseptor-avhengige eksitotoksisitet, og derfor forbedre utfall i hjerneskade modeller. Flyktige anestetika, som for eksempel isofluran, blir alternativt brukt i preklinisk ICH forskning og hold unike fordeler framfor injiserbare midler, inkludert rask endring av anestesi dybde og korte utvinning ganger ^19. Den viktigste ulempen med gassanestesi er behovet av forseggjort utstyr (fordamper, flyt-meter, maske pustekrets) samt muligheten for menneskelig gasseksponering. Videre har isofluran er rapportert å redusere apoptotisk celledød etter hemoragisk slag hos mus ^20. Den optimale anestesi må tilpasses avhengig av lengden av kirurgi, dyrearter eller belastning, og på resultatet målinger av interesse.

Vi beskrev og viste to ICH modeller som har unique styrker og svakheter, mens representerer spesifikke ICH egenskaper. Hver modellenes representative egenskaper må tas i betraktning, når det brukes i prekliniske ICH undersøkelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Head Frame	Stoelting Co.	51600
Nanomite Syringe Pump	Harvard Apparatus	PY2 70-2217
Hamilton Syringe	Hamilton Company	1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl)	26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes.
Microdrill	Fine Science Tools	18000-17
Microdrill burr	Fine Science Tools	19007-09	0.9 mm diameter
Collagenase Type VII-S	Sigma-Aldrich	C2399
Microhematocrit Capillary Tubes	Fisher Scientific	22-362-574	unheparinized
Bone Wax	Ethicon	W31
Suture	Ethicon	1676G
Ketamine	JHP Pharmaceuticals	42023-115-10	Ketalar
Xylazine	LLOYD Laboratories	139-236	AnaSed