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Ein. Vorbereitung der Phase-Shift-Nanoemulsion (PSNE)
- Lösen Sie 11 mg DPPC und 1,68 mg DSPE-PEG2000 in Chloroform
- Verdunstet das organische Lösungsmittel, um eine trockene Lipidfilm in einem Glas-Rundkolben bilden
- Auszutrocknen den Lipidfilm Nacht
- Rehydrieren des Lipidfilms mit 5,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
- Wärme-Lösung in einem 45 ° C Wasserbad, bis Lipidfilm auflöst, Vortexen periodisch
- Übertragen Lipid-Lösung in 7 ml Flasche
- Beschallen Lipidlösung während 2 min bei 20% Stauchung
- Dividieren Lösung in zwei Fläschchen 2,5 ml (verwerfen verbleibenden 0,5 ml)
- 2,5 ml PBS in jede Phiole
- Platzieren Sie jede Flasche in einer 0 ° C Eis-Wasser-Bad
- Fügen Sie 50 ul DDFP in jedes Fläschchen
- Beschallen jedes Fläschchen im Eis-Wasser-Bad mit den folgenden Einstellungen: 25% Amplitude, gepulsten Modus (10 sec ein, 50 s aus), 60 sec insgesamt auf Zeit
- Transfer PSNE Lösungen für 20 ml Szintillationsgefäße
- 5 ml PBS in jedes Fläschchen, was in 10 ml Endvolumen
- Montieren Extruder folgenden Richtungen vom Hersteller bereitgestellten
- Spülen Sie jedes Teil mit VE-Wasser
- Das Edelstahlblech Stützscheibe in der Mitte des Filters Trägerbasis
- Legen Sie das Edelstahlgewebe auf der Edelstahl-Stützscheibe
- Mit einer Pinzette, legen einen Extruder Abfluss Disc Membran (glänzende Seite nach oben) auf dem Edelstahlgewebe
- Mit einer Pinzette, platzieren Sie den Extruder Filter (glänzende Seite nach oben) auf den Drain-Disc-Membran
- Legen Sie das kleine O-Ring auf dem Filter und platzieren Sie den thermobarrel und Extruder oben über der Trägerbasis
- Teilweise ziehen jedes Flügelmutter, dann ganz fest die Flügelmuttern von Hand abwechselnd
- Verbinden Sie den Extrudereine Stickstoff-Gasleitung
- Um den Extruder, Pipette 10 ml deionisiertem Wasser in den oberen Probeöffnung grundieren, verschließen Sie die Öffnung, und ziehen Sie das Entlüftungsventil
- Langsam das Stickstoffgas Zeile, um den Druck zu erhöhen, wodurch der Probe durch die Membranen, und sammeln der Probe aus dem Auslassschlauch
- Nach dem Gebrauch, in umgekehrter Reihenfolge zu zerlegen, spülen Sie die Extruder Teile mit VE-Wasser, und entsorgen Sie die Membran und Membran-Drain Disc
- Für 100 nm Tröpfchen nur Voraussetzung PSNE durch Extrudieren 10 mal durch 200-nm-Filter
- Extrude PSNE 16 mal durch 100 nm oder 200 nm Filter engen Größenverteilung zu erhalten
2. Vorbereitung der Polyacrylamid Hydrogel PSNE
- Bereiten Sie 24% BSA-Lösung durch Verdünnen 1,2 g BSA-Pulver in 5 ml deionisiertem Wasser
- Bereiten Sie 10% APS-Lösung mit verdünnter 0,1 g APS Pulver in 1 ml deionisiertem water
- In der folgenden Reihenfolge, mischen 2,1 ml Acrylamid-Lösung, 1,2 ml Tris-Puffer, 0,1 ml 10% APS, 4,5 ml 24% BSA-Lösung und 3,6 ml deionisiertem Wasser in Kunststoffkammer
- Wärme auf 40 ° C und unter Vakuum für 1 Stunde
- Fügen Sie 480 ul PSNE und gründlich durch vorsichtiges Schwenken der Kunststoff-Kammer mischen.
- Fügen Sie 12 ul TEMED und legen Sie die Kammer in einem 12 ° C Wasserbad für 2 Stunden
3. Repräsentative Ergebnisse
Eine schematische Darstellung der Einrichtung zur Ultraschall-Experimenten mit Gewebe-Nachahmung Hydrogel Phantome ist in Abbildung 1 gezeigt. Dieses Protokoll ergibt lipidbeschichteten Perfluorkohlenstoff Tröpfchen mit einer engen Größenverteilung, die stabil in Lösung sind für mindestens eine Woche. Die Größenverteilung mit dynamischer Lichtstreuung (90Plus Particle Size Analyzer, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) gemessen wird in Abbildung 2 PSNE extrudiert mit 100 und 200 gezeigtnm Filtern. Der effektive Durchmesser PSNE über die Zeit, gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung, ist in Tabelle 1 aufgeführt, die zeigen, dass PSNE stabil sind für mindestens eine Woche. B-Modus-Bilder vor und nach PSNE Verdampfung in einem Polyacrylamid-Hydrogel, sind in Abbildung 3 dargestellt. Auch kann eine Läsion von 15 sec. der HIFU-vermittelte Erhitzen in einem Polyacrylamid-Hydrogel enthaltend Albumin und PSNE ist in Abbildung 4 dargestellt ist. Die asymmetrische Form der Läsion ist ein Ergebnis der prefocal Heizung, die aufgrund des Vorhandenseins der Blase Wolke im Ultraschallstrecke auftritt. Es ist wichtig, dass die Heiz-und prefocal Läsionsbildung aufgrund Streuung von Blasen beachten kann durch Reduktion der übertragenen akustischen Energie minimiert werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für die Ultraschall-Experimenten mit Gewebe-mimIcking Hydrogele.
Abbildung 2. Größe Verteilung der PSNE extrudiert durch 100 nm oder 200 nm Filter, gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung. Die Einheiten der Ordinate Achsen auf der Intensität des gestreuten Lichts von Teilchen einer bestimmten Größe in Bezug auf das Gesamtgewicht Streulichtintensität aus der Probe.
Abbildung 3. B-Modus-Bilder (a) vor und (b) nach PSNE Verdampfung in einem Polyacrylamid-Hydrogel. Der Pfeil zeigt die Fokalbereich wo eine Blase Wolke von PSNE Verdampfung gebildet wurde.
Abbildung 4. Bilder polyacrylamid Hydrogel enthaltend Albumin und PSNE (a) vor und (b) nach Verdampfung und Beschallung mit HIFU, demonstriert Läsionsbildung als Folge von Ultraschall-induzierten Erwärmung. Die Ultraschall-Mittenfrequenz bei 3,3 MHz. Das Ultraschallsignal bestand aus einem ersten 30-Zyklus, 6,4 W Impuls PSNE verdampfen sofort 15 sec von kontinuierlichem Ultraschall bei 0,77, gefolgt W.
| Tage nach der Extrusion | Extrudierte mit 200-nm-Filter | Extrudierte mit 100 nm-Filter |
| Mittlere Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | Mittlere Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | 177,7 | 2,5 | 124,8 | 3,1 |
Tabelle 1. Mittlerer Durchmesser und die Standardabweichung der PSNE an einem und sieben Tage nach der Extrusion mit 100 nm und 200 nm Filter.