Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Zusammenfassung

Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Zusammenfassung

Bestehenden Protokollen zur Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind oft langwierig, da sie mehrstufige Verfahren, die die Isolierung und Expansion von neuralen Vorläuferzellen, vor terminalen Differenzierung. Im Vergleich zu diesen zeitraubenden Ansätze haben wir kürzlich festgestellt, dass kombinierte Hemmung von drei Signalwege, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 und FGF / ERK, rasche Induktion Neuroektoderms fördert aus hPSCs, durch sofortige Differenzierung in funktionelle Neuronen gefolgt. Hier haben wir unser Verfahren eine neuartige multititre Plattenformat angepasst, den weiteren Ausbau ihrer Reproduzierbarkeit und kompatibel zu machen mit mittel-Throughput-Anwendungen. Es umfasst vier Tagen Neuroektoderms Formation in schwimmenden Kugeln (Embryoid Bodies), um weitere vier Tagen Differenzierung zu Neuronen unter adhärenten Bedingungen. Die meisten Zellen mit diesem Protokoll erhalten scheinen bipolaren sensorischen Neuronen sein. Außerdemdas Verfahren ist sehr leistungsfähig, erfordert keine besondere fachlichen Fähigkeiten, und basiert auf einer einfachen chemisch definierten Medium mit kosteneffizienten niedermolekularen Wirkstoffen. Aufgrund dieser Eigenschaften kann das Verfahren als eine nützliche Plattform für die weitere funktionelle Untersuchungen sowie für zellbasierte Screening-Ansätze erfordern menschlichen sensorischen Neuronen oder Nervenzellen jeglicher Art dienen.

Einleitung

hPSCs, bestehend aus Embryonen gewonnenen humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) sind pluripotent Bedeutung, dass sie sich zu verschiedenen Zelllinien in vitro ^1-2 geben. Zahlreiche differenzierte Zelltypen wurden aus hES-Zellen bisher abgeleitet, unterstützen die Vorstellung, dass diese Zellen wertvolle Werkzeuge für die wissenschaftliche Forschung und zellbasierte Screening-Ansätze zu präsentieren und versprechen für zellbasierte Therapeutika.

Protokolle für neuronale Differenzierung hESCs sind üblicherweise kompliziert und zeitaufwendig, da sie oft beim ersten induzi....

Protokoll

Ein. Vorbereitung der Matrigel-beschichteten Platten und Medien

1. Herstellung von Matrigel-beschichteten Platten Matrigel wurde gefunden, ein bevorzugtes Substrat für die Befestigung von differenzierenden EBs sein und fördert auch die effiziente Auswachsen von Neuronen aus diesen ^10.
   1. Thaw 10 ml Matrigel über Nacht auf Eis.
   2. Am nächsten Tag, verdünnen das geleeartige Matrigel mit zwei Volumina eiskaltem DMEM/F-12 und bereiten Aliquots von 1 ml in vorgekühlte 15 ml konischen Röhrchen, die bei -20 ° C werden
   3. Entscheiden Sie auf einem Teller-Format für die neuronale Differenzierung. Zum Beispiel, als Ausgangspunkt, empfehle....

Ergebnisse

In unserem letzten Bericht im Einklang mit vielen anderen, konnte EBs aus hPSCs einfach durch Replattierung Aggregate auf Routine Aufspaltung hPSCs in Low-attachment Gerichte ¹⁰ erzeugt werden. Dies führt in der Regel eine breite Verteilung der resultierenden EB Größen (1C, oben). Ein weiteres Problem, das sich daraus ist, dass EBs in Suspension gehalten, um Aggregation neigen miteinander, was zu einem noch höheren Heterogenität EB Größen. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir daher versuch.......

Diskussion

Die meisten Differenzierungsprotokolle mit EB-Bildung aus hPSCs, einschließlich unserer bereits veröffentlichten Verfahren ^10, auf manuelle oder Enzym-gestützte Ernte hESCs als Aggregate, was unweigerlich zu Heterogenität in EB Größen basieren. Diese Tatsache führt zu Schwankungen in der Differenzierung Effizienz mit einigen Zelllinien, wodurch systematische Untersuchungen schwierig, insbesondere bei einem mittleren Durchsatz Maßstab. Darüber hinaus ist die manuelle Dissektion arbeitsintensive die selbst komp.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Siehe Text für Details über den Umgang mit
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poly (vinylalkohol)	Sigma	363170	Man löst in 0,4% in DMEM/F-12 Verwendung einer Ultraschall Wasserbad / Überhitzung / können bei 4 ° C aufbewahrt werden für mehrere Wochen
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048	100X, wie gefrorenen Aliquots speichern
B27 Supplement	Life Technologies	12587-010	50X, speichern als gefrorene Aliquots
Rinderserumalbumin	Sigma	A1595	10% = 500X, speichern als gefrorene Aliquots
L-Glutamin mit Penicillin / Streptomycin	PAA	P11-013	Oder gleichwertig
FGF2	Peprotech	100-18B	Lösen sich bei 10 ug / ml in 0,1% BSA / PBS = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
ROCK-Inhibitor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Lösen sich bei 10 mM in DMSO = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
PBS	PAA	H15-002	Oder gleichwertig
Accutase	PAA	L11-007
96-well V-Bodenplatten	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	Lösen bei 0,5 mM in DMSO = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	lösen sich bei 15 mM in DMSO = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200.689	lösen sich bei 0,5 mM in DMSO = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
96-well U-Boden ultra-low Befestigungsplatten	Corning	7007
beta-III Tubulin Antikörper (Maus)	Sigma	T8660	Einsatz bei 1:1000
beta-III Tubulin Antikörper (Kaninchen)	Covance	PRB-435P	Einsatz bei 1:2000
BRN3A (POU4F1) Antikörper	Santa Cruz	sc-8429	Einsatz bei 1:500
			Tabelle 1. </ Strong> Spezifische Reagenzien und Geräte.