Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Zusammenfassung

Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

Zusammenfassung

Bestehenden Protokollen zur Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind oft langwierig, da sie mehrstufige Verfahren, die die Isolierung und Expansion von neuralen Vorläuferzellen, vor terminalen Differenzierung. Im Vergleich zu diesen zeitraubenden Ansätze haben wir kürzlich festgestellt, dass kombinierte Hemmung von drei Signalwege, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 und FGF / ERK, rasche Induktion Neuroektoderms fördert aus hPSCs, durch sofortige Differenzierung in funktionelle Neuronen gefolgt. Hier haben wir unser Verfahren eine neuartige multititre Plattenformat angepasst, den weiteren Ausbau ihrer Reproduzierbarkeit und kompatibel zu machen mit mittel-Throughput-Anwendungen. Es umfasst vier Tagen Neuroektoderms Formation in schwimmenden Kugeln (Embryoid Bodies), um weitere vier Tagen Differenzierung zu Neuronen unter adhärenten Bedingungen. Die meisten Zellen mit diesem Protokoll erhalten scheinen bipolaren sensorischen Neuronen sein. Außerdemdas Verfahren ist sehr leistungsfähig, erfordert keine besondere fachlichen Fähigkeiten, und basiert auf einer einfachen chemisch definierten Medium mit kosteneffizienten niedermolekularen Wirkstoffen. Aufgrund dieser Eigenschaften kann das Verfahren als eine nützliche Plattform für die weitere funktionelle Untersuchungen sowie für zellbasierte Screening-Ansätze erfordern menschlichen sensorischen Neuronen oder Nervenzellen jeglicher Art dienen.

Einleitung

hPSCs, bestehend aus Embryonen gewonnenen humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) sind pluripotent Bedeutung, dass sie sich zu verschiedenen Zelllinien in vitro ^1-2 geben. Zahlreiche differenzierte Zelltypen wurden aus hES-Zellen bisher abgeleitet, unterstützen die Vorstellung, dass diese Zellen wertvolle Werkzeuge für die wissenschaftliche Forschung und zellbasierte Screening-Ansätze zu präsentieren und versprechen für zellbasierte Therapeutika.

Protokolle für neuronale Differenzierung hESCs sind üblicherweise kompliziert und zeitaufwendig, da sie oft beim ersten induzierenden gesamten Neuronalen Schicksal, durch manuelle Trennung von neuralen Vorläuferzellen und anschließender terminaler Differenzierung zu einem gegebenen Neuron interessierenden Art ^3-6 gefolgt basieren. In mancher Hinsicht ist diese Komplexität nicht überraschend und unvermeidlich, daß solche state-of-the-art gerichteten Differenzierung Protokolle schrittweise neigen zu imitieren frühen menschlichen Entwicklung, seit M.h ist in sich außerordentlich komplex. Auf der anderen Seite, kann es zum Teil auch Ausdruck unserer mangelnden Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Prozesse, die sich in der Differenzierung Protokolle, die noch weit davon entfernt, vollständig optimiert.

Im Hinblick auf die Umwandlung von undifferenzierten hPSCs in Neuroektoderms, Pera et al. festgestellt, dass Unterdrückung von BMP / SMAD1/5/8 Signalisierung neuralen Induktion von hESCs ⁷ erhöht. Darüber hinaus hat die Inaktivierung von SMAD2 / 3 Signalisierung gezeigt, Neuroektoderms Formation ⁸ fördern. Dementsprechend neigt kombiniert Inaktivierung dieser beiden Signalwege zu einer effizienteren neuronalen Induktion hPSCs ^4,9 führen. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass ein Drittel Signalweg, FGF / ERK als starker Repressor der frühesten Schritte neuroektodermalen Engagement in hESCs dient. Umgekehrt führen gleichzeitiger Unterdrückung von all diesen drei Wegen in der Nähe homogene Umwandlung von hES-Zellen in Neuroektoderms mitin nur vier Tagen ^10. Anschließend wurde hocheffiziente terminalen Differenzierung in funktionale Nervenzellen innerhalb von acht Tagen beobachtet. Die Neuronen erhalten wurden wahrscheinlich sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems, die zum Teil erklären könnte ihre rasche Ableitung ¹⁰ sein. Defekte in sensorischen Neuronen Wartung eine Ursache bestimmter menschlicher Erkrankungen wie familiäre dysautonomia ¹¹ betrachtet. Zur Modellierung solcher Krankheiten auf hiPSC Technologie ¹² basiert, für weitere funktionelle Charakterisierung sowie zur aufgebracht Zwecke nicht erforderlich ist, eine bestimmte Art von Neuronen, kann diese Differenzierung Verfahren stellen eine brauchbare Basis.

Allerdings führte die Differenzierungsstrategie ursprünglich beteiligt Bildung von embryonalen Körper (EBs) von Klumpen von HES Kolonien ¹⁰ eingesetzt, und diese in einem ganz Grad der Heterogenität bezüglich EB Größen und schien auch Neuron Bildung Effizienz in irgendeiner ce kompromittierenll Linien. Darüber hinaus aufgrund der Heterogenität in EB Größen erschien die Fähigkeit, systematisch zu testen Auswirkungen von zusätzlichen Wachstumsfaktoren oder kleine Moleküle während und nach Bildung Neuron etwas verwechselt werden.

In diesem Bericht haben wir unsere bisherigen Verfahren zu einem mittleren Durchsatz-kompatibel, gezwungen, Aggregation-basierte Technik, um EBs in einem sehr size-kontrollierte Weise erzeugen, wie auch in anderen Zusammenhängen ¹³ dargestellt. Anschließend wird die EBs in V-förmige Vertiefungen von 96-Well-Platten wurden mit U-förmigen ultra-low attachment 96-Well-Platten transferiert erzeugt, um Neuroektoderms Formation in Suspension einzuleiten. Vier Tage später konnte die EBs aus was zu ausdifferenzierten Neuronen bei hohem Wirkungsgrad und Homogenität beschichtet werden. Alternativ wurden Tag-4 EBs in einzelne Zellen dissoziiert und als solche, die Folge niedriger Dichte Monoschichten der menschlichen Neuronen überzogen. Coherent Ergebnisse wurden bisher mit zwei unabhängig de erhaltenrived hES-Zelllinien, HuES6 und NCl3.

Als Voraussetzung war erfolgreich EB Bildung strikt abhängig von der Verwendung eines synthetischen Polymer, Polyvinylalkohol (PVA), zusammen mit ROCK Inhibitor Y-27632 bekannten HES Überleben ^13-14 fördern. Als ein Ergebnis gebildet Homogenität der EBs in 96-V-Platten wurde im wesentlichen gegenüber Bildung von EBs als Masse Kulturen auf zufällige Spaltung Techniken verbessert. Dieses System stellt somit eine deutlich verbesserte Plattform für Neuroektoderms Formation in Suspensionskultur, die von hoch kontrollierten Neuron Formation unter adhärenten Bedingungen.

Protokoll

Ein. Vorbereitung der Matrigel-beschichteten Platten und Medien

1. Herstellung von Matrigel-beschichteten Platten Matrigel wurde gefunden, ein bevorzugtes Substrat für die Befestigung von differenzierenden EBs sein und fördert auch die effiziente Auswachsen von Neuronen aus diesen ^10.
   1. Thaw 10 ml Matrigel über Nacht auf Eis.
   2. Am nächsten Tag, verdünnen das geleeartige Matrigel mit zwei Volumina eiskaltem DMEM/F-12 und bereiten Aliquots von 1 ml in vorgekühlte 15 ml konischen Röhrchen, die bei -20 ° C werden
   3. Entscheiden Sie auf einem Teller-Format für die neuronale Differenzierung. Zum Beispiel, als Ausgangspunkt, empfehlen wir eine erste Runde der Differenzierung in einer 12-Well-Format durchzuführen. Pre-cool vier 12-Well-Platten bei 4 ° C. Lösen Sie ein Aliquot der gefrorenen Matrigel durch Zugabe von 9 ml vorgekühlte DMEM/F-12 durch Auf-und Abpipettieren, bis alle vorverdünnte Matrigel wurde aufgetaut und gelöst, gefolgt.
   4. Dann, Übertragen Sie den Inhalt in ein neues 50-ml-Tube mit 15 ml DMEM/F-12 auf Eis (final Matrigel Verdünnung: 1:75). Dann fügen Sie 0,5 ml verdünntem Matrigel in jede Vertiefung der vorgekühlten 12-Well-Platten. Wickeln Platten mit Parafilm und stehen lassen über Nacht bei RT.
   5. Am nächsten Tag übertragen Platten auf 4 ° C. Beschichteten Platten können für mehrere Wochen vor der Verwendung gelagert werden.
2. Medien

EB Bildung Medium (~ 15 ml benötigt, um die Differenzierung in einem 96-Well-Platte durchzuführen - siehe Tabelle 1 und Schema in Abbildung 2):
DMEM/F-12 mit 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln

Differenzierungsmedium (~ 30 ml benötigt, um die Differenzierung in einer 96-Well-Platte durchzuführen, gefolgt von Neuron-Bildung in einem Matrigel-beschichteten 12-Well-Platte, siehe Tabelle 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% BSA
0,5 uM PD0325901
15 uM SB431542
0,5 uM Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. Erzwungene EB Formation

1. Wachsen hPSCs unter Ihrem bevorzugten Feeder-freien Bedingungen. Wir verwenden MEF-konditioniertes Medium auf Matrigel-beschichteten 6-Loch-Platten ^15. Allerdings sollten andere Kultur Systemen wie selbstgemacht oder kommerziell definierten Medien auch funktionieren. Zum Zeitpunkt des Startens eines Differenzierung Experiment sollte hPSCs sein subkonfluente und aktiv wachsen.
2. Mechanisch entfernen spontan differenziert Kolonien mit einer sterilen Kunststoff-Pipettenspitze unter einem Stereomikroskop.
3. Waschen verbleibenden undifferenzierte Kolonien mit PBS, und verdauen, um einzelne Zellen mit Accutase mit 1X Y-27632. Pellet einzelnen Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 2 Minuten, in einem kleinen Volumen von EB Bildung Medium und bestimmen Zelltiter unter Verwendung eines Hämozytometers resuspendieren.
4. Fügen Sie ein Aliquot von Zellendie restlichen EB Bildung Medium in einem Titer zwischen 40.000 und 80.000 Zellen pro ml führen.
5. Mit einer Mehrkanalpipette, dann 100 ul pro Well einer 96V-Bodenplatte, was 4.000 bis 8.000 Zellen pro Vertiefung. Spin 96-Well-Platte in einem Swing-out Platte Zentrifuge bei 400 xg für 1 min zu sammeln Zellen am Boden der Wells und Transfer zum Zellkulturbrutschrank. EBs über Nacht bilden, wie in Abbildung 1 dargestellt.

3. Neuroektoderms Induction

1. Am nächsten Tag (Tag 0), sammeln EBs aus 96V Platte unter einem Stereomikroskop und Transfer in einem kleinen Volumen in einen 3,5 cm bakterielle Schale mit 2 ml Differenzierungsmedium. Vorsichtig geschwenkt, das Gericht für einige Sekunden, um die EBs waschen.
2. Fügen Sie 100 ul der Differenzierung Medium pro Vertiefung einer ultra-low-Anlage U-96-Well-Platte. Unter einem Stereomikroskop, Transfer EBs in kleinen Mengen aus dem Abspülen in die 96U-Brunnen (ein EB pro wirll). Ort 96U Platte in Zellkulturbrutschrank für 4 Tage Neuroektoderms Bildung zu ermöglichen.

4. Neuron Formation

1. Am Tag 4, bereiten ein Abspülen wie in Schritt 3,1 und zusätzlich ersetzen DMEM/F-12 in einer vorgewärmten Matrigel-beschichteten 12-Well-Platte durch Differenzierung Medium (1 ml pro Vertiefung).
2. Plating von EBs
   1. Collect EBs aus 96U Platte, wäscht diesen wie oben, und sorgfältig Saatgut sie nacheinander in die Vertiefungen der Matrigel-beschichteten 12-Well-Platte (ungefähr 8 EBs pro Well): EBs gleichermaßen sollte innerhalb der Vertiefungen zu verteilen, damit ungestörte Auswuchs ermöglichen Neuronen in den nächsten Tagen (siehe "Tag 5" in Abbildung 2).
   2. Vor der Übertragung der 12-Well-Platte wieder in den Inkubator, ermöglichen EBs lose ca. 10 min bei RT befestigen. Dann transferieren Sie 12-Well-Platte auf Zellkulturbrutschrank. Neuronen wachsen aus dem plattierten EBs in radialer Weise innerhalb der nächsten 4 Tage, wie shown in Abbildung 2 ("Tag 8" Bild rechts).

5. Neuron Formation als Monoschichten

1. Als Alternative zu den Schritten des Punktes 4), am Tag 4 der Prozedur, sammeln EBs in eine 3,5 cm bakteriellen Schale, enthaltend 2 ml Differenzierungsmedium, dann übertragen EBs in einem kleinen Volumen zu einem PBS-enthaltenden Schale und dann in andere Schale mit Accutase.
2. Lassen verdauen, um einzelne Zellen, Zentrifuge bei 200 × g für 2 Minuten, in einem kleinen Volumen von Differenzierungsmedium resuspendiert und bestimmen Zelltiter unter Verwendung eines Hämozytometers. Passen Titer zu 1-2x10 ⁶ Zellen pro ml unter Verwendung Differenzierungsmedium (ohne Y-27632).
3. Platte Zellen in vorgewärmten Matrigel-beschichteten 12-Well-Platte (1 ml pro Vertiefung), und Transfer zum Zellkulturbrutschrank. Neuron Formation als Monolayer wurde zwischen Tag 7 bis 8 (3C) beobachtet. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass diese Variante der Monoschichtdas Verfahren wird nicht vollständig mit Bezug auf das Überleben von Zellen und am meisten geeigneten Substrat optimiert.

Ergebnisse

In unserem letzten Bericht im Einklang mit vielen anderen, konnte EBs aus hPSCs einfach durch Replattierung Aggregate auf Routine Aufspaltung hPSCs in Low-attachment Gerichte ¹⁰ erzeugt werden. Dies führt in der Regel eine breite Verteilung der resultierenden EB Größen (1C, oben). Ein weiteres Problem, das sich daraus ist, dass EBs in Suspension gehalten, um Aggregation neigen miteinander, was zu einem noch höheren Heterogenität EB Größen. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir daher versuch...

Diskussion

Die meisten Differenzierungsprotokolle mit EB-Bildung aus hPSCs, einschließlich unserer bereits veröffentlichten Verfahren ^10, auf manuelle oder Enzym-gestützte Ernte hESCs als Aggregate, was unweigerlich zu Heterogenität in EB Größen basieren. Diese Tatsache führt zu Schwankungen in der Differenzierung Effizienz mit einigen Zelllinien, wodurch systematische Untersuchungen schwierig, insbesondere bei einem mittleren Durchsatz Maßstab. Darüber hinaus ist die manuelle Dissektion arbeitsintensive die selbst komp...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Siehe Text für Details über den Umgang mit
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poly (vinylalkohol)	Sigma	363170	Man löst in 0,4% in DMEM/F-12 Verwendung einer Ultraschall Wasserbad / Überhitzung / können bei 4 ° C aufbewahrt werden für mehrere Wochen
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048	100X, wie gefrorenen Aliquots speichern
B27 Supplement	Life Technologies	12587-010	50X, speichern als gefrorene Aliquots
Rinderserumalbumin	Sigma	A1595	10% = 500X, speichern als gefrorene Aliquots
L-Glutamin mit Penicillin / Streptomycin	PAA	P11-013	Oder gleichwertig
FGF2	Peprotech	100-18B	Lösen sich bei 10 ug / ml in 0,1% BSA / PBS = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
ROCK-Inhibitor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Lösen sich bei 10 mM in DMSO = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
PBS	PAA	H15-002	Oder gleichwertig
Accutase	PAA	L11-007
96-well V-Bodenplatten	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	Lösen bei 0,5 mM in DMSO = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	lösen sich bei 15 mM in DMSO = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200.689	lösen sich bei 0,5 mM in DMSO = 1000X, speichern als gefrorene Aliquots
96-well U-Boden ultra-low Befestigungsplatten	Corning	7007
beta-III Tubulin Antikörper (Maus)	Sigma	T8660	Einsatz bei 1:1000
beta-III Tubulin Antikörper (Kaninchen)	Covance	PRB-435P	Einsatz bei 1:2000
BRN3A (POU4F1) Antikörper	Santa Cruz	sc-8429	Einsatz bei 1:500
			Tabelle 1. </ Strong> Spezifische Reagenzien und Geräte.