Hier stellen wir eine Methode zur lichtaktivierten Umschaltung von photoveränderbaren fluoreszierenden Proteinen (PCFPs) im lebenden Zebrafischembryo sowie die anschließende Verfolgung des photoveränderten Proteins zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung vor. Diese Methodik ermöglicht die Beobachtung zellbiologischer Vorgänge, die verschiedenen Entwicklungsprozessen in einem lebenden Wirbeltierorganismus zugrunde liegen.
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Methodenartikel
Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine während der Zebrafisch-Entwicklung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Embryogenese ist ein dynamischer Prozess, der am besten mit Techniken untersucht wird, die die Dokumentation von Entwicklungsveränderungen in vivo ermöglichen. Der Einsatz genetisch kodierter fluoreszierender Proteine hat sich als wertvolle Strategie zur Aufklärung dynamischer morphogenetischer Prozesse erwiesen, während sie im intakten Organismus ablaufen. In den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung photoaktivierbarer und photoumwandelbarer fluoreszierender Proteine die Möglichkeit eröffnet, das Schicksal diskreter Teilpopulationen markierter Proteine zu verfolgen1. Im Gegensatz zu photoaktivierbaren Proteinen können photoumwandelbare fluoreszierende Proteine (PCFPs) vor der Photoumwandlung leicht in ihrem nativen Emissionszustand verfolgt und abgebildet werden, was die Identifizierung und Auswahl von Bereichen durch optische Inspektion erleichtert. PCFPs wie Kaede2, KikGR3, Dendra4 und EosFP5 können durch Bestrahlung mit UV- oder blauem Licht von grün nach rot verschoben werden, bedingt durch eine His-Tyr-Gly-Tripeptidsequenz, die ein grünes Chromophor bildet, das durch eine lichtkatalysierte β-Eliminierung und anschließende Erweiterung eines π-konjugierten Systems photochemisch in ein rotes Chromophor umgewandelt werden kann3. PCFPs und ihre monomeren Varianten sind nützliche Werkzeuge zum Verfolgen von Zellen6–10 bzw. zur Untersuchung der Proteindynamik11–14. In den letzten Jahren wurden PCFPs in verschiedenen Tiermodellen wie Zebrafisch6, Huhn7,8 und Maus9,10 zur Verfolgung des Zellschicksals exprimiert. Hier berichten wir über ein Protokoll zur zellspezifischen Photoumwandlung von PCFPs im lebenden Zebrafischembryo und die anschließende Verfolgung der photoumgewandelten Proteine in späteren Entwicklungsstadien. Diese Methodik ermöglicht die Untersuchung zellbiologischer Vorgänge, die der Morphogenese im Zebrafisch-Modellorganismus zugrunde liegen, auf gewebespezifische Weise.
Protokoll
1. Gewinnung von Embryonen für den Photoumwandlungs-Assay
Nach der Inzucht von transgenen Zebrafischen, die ein PCFP exprimieren, werden die hellsten, homozygoten Embryonen ausgewählt und bei 28,5 °C bis zum gewünschten embryonalen Entwicklungsstadium weitergezüchtet15.
Hinweis 1: Diese Vorauswahl ermöglicht das Scannen von Embryonen mit geringer Laserleistung, wodurch Phototoxizität und Photobleichen verhindert werden.
Hinweis 2: Wir empfehlen, bei der Sichtbarmachung von Embryonen Licht mit geringer Intensität zu verwenden und sie aufgrund der hohen Lichtempfindlichkeit von PCFPs wie Kaede und KikGR, einschließlich Tageslicht, im Dunkeln zu halten.
2. Einbetten
- Entchorionieren Sie die Embryonen in einem Glasbehälter mit Ei-Wasser unter dem Stereomikroskop mithilfe einer Pinzette.
- Betäuben Sie die Embryonen, indem Sie einen entchorionierten Embryo in eine 0,16 mg/ml Tricain-Lösung (3-Amino-Benzoesäureethylester, Sigma-Aldrich) geben (40 μl einer 4 mg/ml Stammlösung in 1 ml E3-Medium 1X).
Hinweis 1: Überführen Sie die Embryonen mit einer Glaspipette oder einer abgeschnittenen Pipettenspitze (P1000), um das Risiko einer Beschädigung der Embryonen zu minimieren.
Hinweis 2: Junge dechorionierte Embryonen sollten nicht der Luft ausgesetzt oder an die Wasser/Luft-Grenzfläche angehoben werden, da die Eier leicht reißen, wenn mechanischem Stress ausgesetzt.
- Überführen Sie das anästhetisierte Embryo auf den Deckel einer Kulturschale und halten Sie das Embryo in einem möglichst geringen Mediumvolumen.
- Überführen Sie das Embryo in Agarose, indem Sie das Embryo mit 1 % niedrigschmelzendem Agarose (LMA, Lonza) bei 30 °C, das 0,16 mg/ml Tricaine enthält, aufsaugen und auf das Deckglas einer deckglasbodigen Kulturschale (MatTek Corp. Ashland MA USA) geben. Richten Sie anschließend das Embryo mit Hilfe einer glatten Kunststoffspitze (z. B. einer abgeschnittenen Microloader-Pipettenspitze, Eppendorf) aus und überdecken Sie nach der Polymerisation des LMA die Agarose mit einer 0,16 mg/ml Tricaine-Lösung.
Hinweis 1: Schmelzen Sie 1 % LMA bei 60 °C und halten Sie das geschmolzene Agarose bei 30 °C.
3. Photoumwandlung
- An einem invertierten konfokalen Mikroskop, das mit einem 405 nm, 488 nm und 561 nm Laser ausgestattet ist, beispielsweise dem Zeiss LSM 710, die Probe mittels einer z-Stack-Aufnahme visualisieren, die die gesamte Struktur des zu photokonvertierenden und später mithilfe des 488-nm-Lasers zu verfolgenden Präparats erfasstdas heißt, 30-mW-Ar-Laser mit 5–7 % Intensität, Detektor eingestellt auf 493–540 nm) und den 561-nm-Laser (das heißt, 10-mW-DPSS-561-Laser bei 7–9 % Intensität, Detektor eingestellt auf 587–651) zum Scannen des Gewebes/organs nach der grünen und roten Fluoreszenz der photokonvertierbaren Proteine.
Hinweis 1: Für die Aufnahme vor der Photoumwandlung verwendeten wir ein Plan-Apochromat-Objektiv mit 20x/NA 0,8.
Hinweis 2: Scannen Sie vor dem Experiment immer nach der roten Fluoreszenz, um auszuschließen, dass zufällig erzeugtes rot umgewandeltes PCFP vorhanden ist.
- Wählen Sie das Time series-Werkzeug aus und stellen Sie 2 Zyklen ohne Intervall ein (einer für vor und einer für nach der Photokonvertierung).
- Wählen Sie das Regions-Werkzeug aus und definieren Sie eine oder mehrere Regionen von Interesse (ROI) für die Photokonvertierung.
Hinweis 1: Wir empfehlen, zunächst die Genauigkeit zu bestimmen, mit der der Bereich, der tatsächlich durch den Scanning-Laser im interessierenden Bereich (ROI) photokonvertiert wurde, mit dem im Softwareprogramm ausgewählten ROI übereinstimmt, indem die Fläche des photokonvertierten Gewebes bzw. der Zellen in allen drei Dimensionen (xy- und z-Richtung) an einem fixierten Präparat gemessen wird, bei dem keine Zell- oder Proteinbewegung zu erwarten ist. Bei den in dieser Anwendung beschriebenen Einstellungen stimmte der ROI mit dem photokonvertierten Bereich mit hoher Präzision überein, doch hängt dies vom verwendeten Objektiv und der für die Photokonversion eingesetzten Laserintensität ab. Die Größe des ROI kann je nach numerischer Apertur des Objektivs, dem Zoomfaktor und der für die Photokonversion verwendeten Laserlichtmenge auf die Größe einer einzelnen Zelle verkleinert werden.
- Wählen Sie das Bleaching-Werkzeug aus und stellen Sie ein, dass das Bleaching nach Scan 1 von 2 beginnen soll. Wir verwendeten einen 30-mW-405-nm-Diodenlaser für die Photoumwandlung und optimierten sorgfältig die minimale Menge an Laserlicht, die für eine vollständige Photoumwandlung erforderlich ist, hauptsächlich durch Variation der Laserintensität, der Scan-Wiederholungen des ROI und der Pixelzeit (d. h. Scan-Geschwindigkeit).
Hinweis 1: Für die Photoumwandlung verwendeten wir ein Plan-Apochromat-Objektiv mit 20x/NA 0,8.
Hinweis 2: Die Laserleistung und die Anzahl der Wiederholungen müssen für jedes experimentelle Setup empirisch bestimmt werden und sollten eine vollständige Photoumwandlung des grünen in rotes PCFP innerhalb des interessierenden Bereichs (ROI) bei minimal notwendiger Laserlichtdosis gewährleisten, um die Phototoxizität zu reduzieren. Wir empfehlen, Tests mit niedriger Laserleistung (z. B. 3 %, entsprechend 0,03 mW in der Objektivebene) in Kombination mit einer geringen Anzahl von Wiederholungen (z. B. 20) zu beginnen und die Laserleistung schrittweise zu erhöhen, bis die vollständige Photoumwandlung erreicht ist, was in unseren Experimenten bei 10 % Laserleistung (entsprechend 0,1 mW in der Objektivebene) der Fall war. Unter diesen Bedingungen überlebten alle getesteten Embryonen die Behandlung. Dennoch beobachteten wir, dass die Dottmembran empfindlich gegenüber Laserimpulsen ist und leicht beschädigt werden kann, was zum Absterben des Embryos führt. Aus diesem Grund kann eine Embryonalletalität nach der Photoumwandlung auftreten, wenn sich das Zielgewebe nahe am Dottkörper befindet.
- Scannen Sie die Probe mittels eines z-Stapels mit Lasern für 488 nm und 561 nm, um verbleibende grüne Fluoreszenz und die photokonvertierte rote Fluoreszenz des PCFP zu visualisieren.
Hinweis 1: Für die Aufnahme nach der Photokonversion verwendeten wir ein Plan-Apochromat-Objektiv 20x/NA 0,8.
4. Entfernen Sie das Embryo aus dem Agarosegel
- Entfernen Sie die Lösung und nehmen Sie das Embryo vorsichtig mit Hilfe einer Nadel oder einer glatten Plastikspitze aus dem 1% LMA.
- Halten Sie das Embryo im Dunkeln in Ei-Wasser bei 28,5 °C, bis der gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist.
Hinweis 1: Es ist wichtig, dass die Embryonen ihre Entwicklung in Ei-Wasser fortsetzen, insbesondere während der ersten Entwicklungsstage, in denen sich der embryonale Körper ausdehnt. Tatsächlich verändern einige embryonale Gewebe/Organe während der Entwicklung ihre Position und erfordern daher spezifische Orientierungen beim Einbetten, die von dem jeweiligen Gewebe/Organ und dem gewünschten Entwicklungsstadium der Analyse abhängen.
5. Wiedereinbetten
- Fahren Sie wie unter Punkt 2.) dieses Protokolls beschrieben fort.
6. Verfolgung photokonvertierten Gewebes in späteren embryonalen Entwicklungsstadien
- Abtastung der interessierenden Region (z-Stack) unter Verwendung von Lasern für 488 nm bzw. 561 nm für grüne und rote Fluoreszenzsignale.
Hinweis 1: Für die Aufnahme x Stunden nach der Photoumwandlung verwendeten wir ein Plan-Apochromat-Objektiv mit 20x/NA 0,8.
Hinweis 2: Da dieses Protokoll die normale Entwicklung des Embryos nicht beeinträchtigt, ist es möglich, den photokonvertierten Embryo in späteren Entwicklungsstadien zu beobachten (dazu wie unter den Punkten 4 - 6 beschrieben vorgehen).
7. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für einen Photoconversion-Assay ist in Abbildung 1 dargestellt. Wir verfolgten Endothelzellen während der Zebrafisch-Entwicklung (für eine Übersicht über die vaskuläre Anatomie des sich entwickelnden Zebrafischs siehe16). Dementsprechend verwendeten wir eine Zebrafisch-Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7-Reporterlinie, die KikGR in Endothelkernen exprimiert17. Homozygote und stark exprimierende Embryonen wurden bei 28,5 °C bis 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) aufgezogen. Nach der Dechorionierung wurden die Embryonen anästhesiert und in LMA eingebettet, wobei die anterodorsale Seite des Embryos zur Deckglasoberfläche ausgerichtet wurde, um die Kopfgefäße besser visualisieren zu können. Wir verwendeten ein invertiertes konfokales Mikroskop (Zeiss LSM 710 Meta), ausgestattet mit Lasern mit Wellenlängen von 405 nm, 488 nm und 561 nm sowie einem Plan-Apochromat-Objektiv mit 20facher Vergrößerung und numerischer Apertur von 0,8, für den Photoconversion-Assay und die anschließende Verfolgung des photoconvertierten Proteins. Wie in Abbildung 1A gezeigt, wurde KikGR vor der Photoconversion im Endothelgewebe exprimiert und war nur als grüne Fluoreszenz mittels eines 488-nm-Argonlasers nachweisbar. Kontrollaufnahmen mit einem 561-nm-DPSS-561-10-Laser zur Detektion roter Fluoreszenz zeigten vor der Photoconversion keine photoconvertierten KikGR-Signale (Abbildung 1A). Anschließend wurde der interessierende Bereich (ROI) vollständig mit einem 405-nm-Diodenlaser (bei 10 % Intensität, 20 Iterationen) photoconvertiert, und die Kopfgefäße wurden erneut mit den 488-nm- und 561-nm-Lasern abgebildet (Abbildung 1B). Wie in Abbildung 1B dargestellt, hatte das grüne KikGR innerhalb des ROI vollständig in rote Fluoreszenz umgeschaltet. Nach dem Photoconversion-Assay wurde der Embryo aus dem Agarose-Gel entfernt und bei 28,5 °C in Ei-Wasser weiterentwickelt. Schließlich wurde der Embryo 24 Stunden nach der Photoconversion, etwa bei 72 hpf, erneut untersucht, um die photoconvertierten Endothelzellen in späteren Entwicklungsstadien zu verfolgen (Abbildung 1C). Dazu wurde der Embryo erneut in LMA eingebettet, und die Probe wurde mit den 488-nm- und 561-nm-Lasern erneut abgebildet. Wie in Abbildung 1C gezeigt, waren innerhalb des aus dem photoconvertierten ROI hervorgegangenen Endothelgewebes sowohl nicht-photoconvertierte als auch photoconvertierte KikGR-Proteine nachweisbar, bedingt durch die Stabilität des rot fluoreszierenden, photoconvertierten KikGR und die Neusynthese von grün fluoreszierendem, nicht-photoconvertiertem KikGR.
Abbildung 1. Photoconversion von KikGR während der Zebrafischembryonalentwicklung. (A,B) Ein spezifischer Bereich der endothelialen Kopfgefäße wurde bei 48 hpf in transgenen Embryonen des Stammes Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 photoconvertiert und (C) 24 Stunden nach der Photoconversion (ca. 72 hpf) erneut beobachtet. Die Fluoreszenz von KikGR (grün), photoconvertiertem KikGR (rot) sowie die Überlagerung beider Kanäle sind dargestellt. Gestrichelte Kreise zeigen den interessierenden Bereich (ROI) vor, unmittelbar nach und 24 Stunden nach der Photoconversion. Die Bilder zeigen dorsale Ansichten des Zebrafischembryos mit anteriorer Orientierung nach unten. Maßstabsbalken: 50 μm.
| Protein (Abkürzung) | Ex (nm) | Em (nm) | EC | QY | Quartärstruktur | Helligkeit | Anwendung | Ref |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | tetramer | 259 | Zellverfolgung | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | tetramer | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | tetramer | 112 | Zellverfolgung | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | tetramer | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | monomer | 101 | Dynamische Verfolgung Superauflösende Bilder | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | monomer | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | tetramer | 150 | Zellverfolgung | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | tetramer | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | tandem dimer | 165 | Superauflösende Bilder | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | tandem dimer | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | monomer | 140 | Dynamische Verfolgung Superauflösende Bilder | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | monomer | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | monomer | 67 | Dynamische Verfolgung Superauflösende Bilder | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | monomer | 57 |
Tabelle I. Eigenschaften von photoconvertierbaren fluoreszierenden Proteinen. Neben dem gebräuchlichen Namen und/oder dem Akronym für jedes PCFP sind die Wellenlängen der maximalen Anregung (Ex) und Emission (Em), die molaren Extinktionskoeffizienten (EC, 10-3 M-1 cm-1), die Quantenausbeute (QY), die physiologisch relevante quartäre Struktur, die relative Helligkeit (in % von EGFP), die Anwendung und Referenzen in der Tabelle aufgeführt. Tabelle angepasst nach Day und Davidson, 20101.
| PCFP | Transgene Zebrafisch-Linien | Quelle |
| Kaede | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | Okamoto Lab |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | ZIRC | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | Higashijima Lab | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
Tabelle II. Transgene Zebrabärbling-Linien, die PCFPs exprimieren. Daten aus der Zebrafisch-Modellorganismus-Datenbank (ZFIN, http://zfin.org/). Die Verfügbarkeit der Linien im Zebrafish International Resource Center (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/) ist angegeben.
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Diskussion
In den letzten Jahren wurden transgene Tiermodelle zur Expression von photokonvertierbaren Proteinen wie Kaede oder KikGR erzeugt. Diese Tiere entwickeln sich normal, was darauf hindeutet, dass diese Proteine keine toxischen Effekte auf die embryonale Entwicklung haben. Der erste Bericht über einen Photokonversions-Assay zur Verfolgung von Zellen in Tierembryonen wurde von Hatta und Kollegen vorgelegt, die mRNA oder DNA, die Kaede kodiert, in Ein-Zell-Zebrafischembryonen injizierten, um eine ubiquitäre Expression zu erre...
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Offenlegungen
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Dr. Ian C. Scott für die großzügige Bereitstellung der transgenen Zebrafischlinie Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 am Hospital for Sick Children in Toronto, Kanada. Wir danken der Confocal- und 2-Photonen-Mikroskopie-Kernfacility (Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin) und Dr. Zoltan Cseresnyes für hervorragende technische Unterstützung und umfassende Bildgebungsunterstützung. S.A.-S. wird durch ein Heisenberg-Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert. Diese Arbeit wurde durch den DFG-Grant SE2016/7-1 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materialien: | |||
| Notwendige Ausrüstung zur Fischzucht und Eiersammlung (Einzelheiten siehe Zebrafish Book22). | |||
| Stereomikroskop | Leica | Leica MZ6 Stereomikroskop | ausgestattet mit Laser, der bei 488 nm arbeitet |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | ausgestattet mit Lasern, die bei 488 nm, 561 nm und 405 nm arbeiten |
| Heizblock | |||
| Paar Dumont #5-Pinzetten | |||
| Kulturschale mit Deckglaskörper | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| Mikrolader-Pipettenspitzen | Eppendorf | ||
| Vortex | |||
| Nadeln | |||
| Reagenzien: | |||
| Ei-Wasser-Medium | |||
| 60 μg/ml Instant Ocean Meersalz in ddH2O | |||
| E3-Medium | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0,17 mM KCl | |||
| 0,33 mM CaCl2 | |||
| 0,33 mM MgSO4 | |||
| 0,00001 % (w/v) Methylenblau | |||
| 4 mg/ml Tricain-Stammlösung | |||
| 400 mg Tricain (3-Amino-Benzoesäureethylester) | Sigma-Aldrich | ||
| 97,9 ml ddH2O | |||
| 2,1 ml 1 M Tris (pH 9) | |||
| pH auf 7 einstellen, portionieren und bei -20 °C lagern | |||
| 1 % LMA (Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, Lonza) | |||
| 1 g LMA/100 ml E3-Medium 1× | |||
| Portionieren und bei 4 °C lagern |
Referenzen
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
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Nachdrucke und Genehmigungen
