Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode zum photoaktivierten Schalten von photokonvertierbaren fluoreszierenden Proteinen (PCFPs) im lebenden Zebrafischembryo und zur weiteren Verfolgung von photokonvertierten Proteinen zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung vor. Diese Methodik ermöglicht die Überwachung zellbiologischer Ereignisse, die verschiedenen Entwicklungsprozessen in einem lebenden Wirbeltierorganismus zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Embryogenese ist ein dynamischer Prozess, der am besten mit Techniken untersucht wird, die die Dokumentation von Entwicklungsveränderungen in vivo ermöglichen. Die Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine hat sich als wertvolle Strategie erwiesen, um dynamische morphogenetische Prozesse, wie sie im intakten Organismus ablaufen, aufzuklären. In den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung photoaktivierbarer und photokonvertierbarer fluoreszierender Proteine die Möglichkeit eröffnet, das Schicksal diskreter Subpopulationen von markierten Proteinen^{zu untersuchen 1}. Im Gegensatz zu photoaktivierbaren Proteinen lassen sich photokonvertierbare fluoreszierende Proteine (PCFPs) vor der Photokonversion leicht verfolgen und in ihrem nativen Emissionszustand abbilden, was die Identifizierung und Auswahl von Regionen durch optische Inspektion erleichtert. PCFPs, wie Kaede², KikGR³, Dendra⁴ und EosFP⁵, können von grün nach rot verschoben werden, wenn sie UV- oder blauem Licht ausgesetzt werden, und zwar aufgrund einer His-Tyr-Gly-Tripeptidsequenz, die ein grünes Chromophor bildet, das durch eine lichtkatalysierte β-Eliminierung und anschließende Verlängerung eines π-konjugierten Systems³ photokonvertiert werden kann. PCFPs und ihre monomeren Varianten sind nützliche Werkzeuge für die Verfolgung der Zellen^6-10 bzw. der Proteindynamik^11-14. In den letzten Jahren wurden PCFPs in verschiedenen Tiermodellen exprimiert, wie z.B. Zebrafisch⁶, Huhn^7,8 und Maus^9,10 zur Verfolgung des Zellschicksals. Hier berichten wir über ein Protokoll für die zellspezifische Photokonversion von PCFPs im lebenden Zebrafischembryo und die weitere Verfolgung von photokonvertierten Proteinen in späteren Entwicklungsstadien. Diese Methodik ermöglicht es, zellbiologische Ereignisse, die der Morphogenese im Zebrafisch-Tiermodell zugrunde liegen, gewebespezifisch zu untersuchen.

Protokoll

1. Gewinnung von Embryonen für den Photokonversionstest

Bei der Kreuzung von transgenen Zebrafischen, die ein PCFP exprimieren, werden die hellsten, homozygoten Embryonen ausgewählt und bei 28,5 °C bis zum gewünschten Embryonalstadium¹⁵ gezüchtet.

Anmerkung 1: Diese Vorauswahl ermöglicht das Scannen von Embryonen mit geringer Laserleistung, wodurch Phototoxizität und Photobleiche verhindert werden.

Anmerkung 2: Wir empfehlen, bei der Visualisierung von Embryonen Licht mit geringer Intensität zu verwenden und sie aufgrund der hohen Empfindlichkeit von PCFPs, wie Kaede und KikGR, gegenüber Lichteinwirkung einschließlich Tageslicht in der Dunkelheit zu halten.

2. Einbetten

1. In einem Glasbehälter mit Eiwasser werden die Embryonen unter dem Stereomikroskop mit einer Pinzette dechorioniert.
2. Anästhesieren Sie Embryonen, indem Sie einen dechorionierten Embryo in 0,16 mg/ml Tricainlösung (3-Aminobenzoesäureethylester, Sigma-Aldrich) (40 μl 4 mg/ml Stammlösung in 1 ml E3-Medium 1X) übertragen.

Anmerkung 1: Embryonen mit einer Glaspipette oder einer Schneidespitze (P1000) übertragen, um das Risiko einer Beschädigung der Embryonen zu minimieren.

Anmerkung 2: Junge dechorionierte Embryonen sollten nicht an der Luft ausgesetzt oder an die Wasser/Luft-Grenzfläche gehoben werden, da die Eizellen leicht platzen, wenn sie mechanischer Belastung ausgesetzt werden.

3. Übertragen Sie den anästhesierten Embryo auf den Deckel einer Kulturschale und halten Sie den Embryo in einem möglichst kleinen Mediumvolumen.
4. Übertragen Sie den Embryo in Agarose, indem Sie den Embryo mit 1 % Agarose bei niedriger Schmelztemperatur (LMA, Lonza) bei 30 °C mit 0,16 mg/ml Tricain pipettieren und auf das Deckglas einer Kulturschale mit Deckglasboden (MatTek Corp., Ashland, MA, USA) legen. Anschließend wird der Embryo mit Hilfe einer glatten Kunststoffspitze (z. B. einer geschnittenen Microloader-Pipettenspitze, Eppendorf) ausgerichtet und nach Polymerisation des LMA Agarose mit 0,16 mg/ml Tricainlösung bedeckt.

Anmerkung 1: 1% LMA bei 60 °C schmelzen und geschmolzene Agarose bei 30 °C halten.

3. Fotokonvertierung

1. An einem inversen Konfokalmikroskop, das mit einer 405-nm-, 488-nm- und 561-nm-Laserquelle ausgestattet ist, wie z. B. dem Zeiss LSM 710, können Sie die Probe durch einen z-Stack-Scan visualisieren, der die gesamte Struktur der Probe abdeckt, um sie photoumzuwandeln und später mit dem 488-nm-Laser (d. h. 30 mW Ar-Laser mit einer Intensität von 5-7 %, Detektor mit 493-540 nm) und dem 561-nm-Laser (d. h., 10 mW DPSS 561 Laser, bei 7-9 % Intensität, Detektor eingestellt auf 587-651) zum Scannen des Gewebes/Organs nach der grünen bzw. roten Fluoreszenz der photokonvertierbaren Proteine.

Anmerkung 1: Für den Scan vor der Fotokonvertierung haben wir ein Plan Apochromat 20x/NA 0.8 Objektiv verwendet.

Anmerkung 2: Vor dem Experiment immer nach roter Fluoreszenz suchen, um auszuschließen, dass versehentlich erzeugtes rotkonvertiertes PCFP vorhanden ist.

2. Wählen Sie das Zeitreihenwerkzeug und stellen Sie es auf 2 Zyklen ohne Intervall ein (einen für die Vor- und einen für die Nachfotokonvertierung).
3. Wählen Sie das Werkzeug "Regionen" aus und definieren Sie einen oder mehrere interessante Bereiche (ROI) für die Fotokonvertierung.

Anmerkung 1: Wir empfehlen, zunächst die Genauigkeit zu bestimmen, mit der der tatsächlich vom Scanlaser photokonvertierte Bereich in der ROI mit dem in der Software ausgewählten ROI übereinstimmt, indem wir die Fläche des photokonvertierten Gewebes/der photokonvertierten Zellen in allen drei (xy- und z-Richtung) in einer festen Probe messen, in der keine Zell- oder Proteinbewegung zu erwarten ist. Für die in dieser Anwendung beschriebenen Einstellungen passte der ROI mit großer Präzision an den fotokonvertierten Bereich an, dies hängt jedoch vom verwendeten Objektiv und der Menge des für die Fotokonvertierung verwendeten Lasers ab. Die Größe des ROI kann in Abhängigkeit von der numerischen Apertur des Objektivs, dem Zoomfaktor und der Menge des für die Photokonvertierung verwendeten Laserlichts auf die Größe einer einzelnen Zelle reduziert werden.

4. Wählen Sie das Bleichwerkzeug und stellen Sie ein, dass das Bleichen nach dem Scan 1 von 2 gestartet wird. Wir haben einen 30 mW 405 nm Diodenlaser für die Photokonversion verwendet und sorgfältig für die minimale Menge an Laserlicht optimiert, die für eine vollständige Photokonversion erforderlich ist, die hauptsächlich durch Variation der Intensität des Laserlichts, der Scan-Iterationen des ROI und der Pixelzeit (d. h. der Scangeschwindigkeit) erreicht wird.

Anmerkung 1: Für die Fotokonvertierung haben wir ein Plan Apochromat 20x/NA 0.8 Objektiv verwendet.

Anmerkung 2: Die Leistung des Lasers und die Anzahl der Iterationen müssen für jede experimentelle Einstellung empirisch bestimmt werden und sollten die vollständige Photokonversion von grünem zu rotem PCFP innerhalb des ROI mit der minimalen notwendigen Menge an Laserlicht sicherstellen, um die Phototoxizität zu reduzieren. Wir empfehlen, Tests mit geringer Laserleistung (z.B. 3 %, entsprechend 0,03 mW im Zielplan) in Kombination mit geringen Iterationszahlen (z. B. 20) zu starten und anschließend die Laserleistung zu erhöhen, bis eine vollständige Photokonversion erreicht ist, die in unseren Händen bei 10 % Laserleistung lag (entspricht 0,1 mW im Zielplan). Unter diesen Bedingungen überlebten alle getesteten Embryonen den Behandlungsplan. Nichtsdestotrotz haben wir beobachtet, dass die Dottermembran empfindlich auf Laserpulse reagiert und leicht beschädigt werden kann, was zum Tod des Embryos führt. Aus diesem Grund kann die Letalität des Embryos nach der Photokonversion verursacht werden, wenn sich die Position des Zielgewebes in der Nähe des Dotterkörpers befindet.

5. Scannen Sie die Probe mit einem z-Stack mit Lasern für 488 nm und 561 nm, um das verbleibende Grün und die photokonvertierte rote Fluoreszenz des PCFP zu visualisieren.

Anmerkung 1: Für den Scan nach der Fotokonvertierung haben wir einen Plan Apochromat 20x/NA 0.8 verwendet.

4. Embryo aus Agarose entfernen

1. Entsorgen Sie die Lösung und entfernen Sie den Embryo vorsichtig mit Hilfe einer Nadel oder einer glatten Kunststoffspitze aus dem 1%igen LMA.
2. Halten Sie den Embryo in Eiwasser im Dunkeln bei 28,5 °C bis zum gewünschten Entwicklungsstadium.

Anmerkung 1: Es ist wichtig, dass Embryonen ihre Entwicklung im Eiwasser fortsetzen, insbesondere während der ersten Entwicklungstage während der Ausdehnung des embryonalen Körpers. In der Tat ändern einige embryonale Gewebe/Organe während der Entwicklung ihre Position und erfordern daher spezifische Orientierungen während der Einbettung, die von dem jeweiligen Gewebe/Organ von Interesse und dem gewünschten Entwicklungsstadium der Analyse abhängen.

5. Erneutes Einbetten

1. Gehen Sie wie unter Punkt 2.) dieses Protokolls vor.

6. Verfolgung von photokonvertiertem Gewebe in späteren Embryonalstadien

1. Scan der Region of Interest (z-Stack) mit Lasern für 488 nm bzw. 561 nm für grüne bzw. rote Fluoreszenzsignale.

Anmerkung 1: Für den Scan x Stunden nach der Photokonvertierung haben wir einen Plan Apochromat 20x/NA 0.8 verwendet.

Anmerkung 2: Da dieses Protokoll die normale Entwicklung des Embryos nicht beeinflusst, ist es möglich, den photokonvertierten Embryo in späteren Entwicklungsstadien zu beobachten (gehen Sie dazu wie unter den Punkten 4 - 6 beschrieben vor).

7. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für einen Photokonversionsassay ist in Abbildung 1 dargestellt. Wir verfolgten Endothelzellen während der Entwicklung des Zebrafisches (für einen Überblick über die Gefäßanatomie des sich entwickelnden Zebrafisches siehe¹⁶). Dementsprechend verwendeten wir eine Zebrafisch-Reporterlinie Tg(kdrl:nlsKikGR)^hsc7, die KikGR in den Endothelkernen^{exprimiert 17}. Homozygote und hell exprimierende Embryonen wurden bei 28,5 °C bis 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) aufgezogen. Nach der Dechorionation wurden die Embryonen anästhesiert und in LMA eingebettet, wobei die anterior-dorsale Seite des Embryos zur besseren Visualisierung der Kopfgefäße in Richtung des Deckglases positioniert wurde. Wir verwenden ein inverses konfokales Mikroskop (Zeiss LSM 710 Meta), das mit Lasern ausgestattet ist, die bei 405 nm, 488 nm und 561 nm arbeiten, und ein Plan Apochromat 20x/NA 0,8-Objektiv für den Photokonversionsassay und die weitere Verfolgung des photokonvertierten Proteins. Wie in Abbildung 1A gezeigt, wurde KikGR vor der Photokonversion im Endothelgewebe exprimiert und war nur als grüne Fluoreszenz mit einem 488-nm-Argonlaser nachweisbar. Kontrollscans mit einem 561 nm DPSS 561-10 Laser für rote Fluoreszenz zeigten vor der Photokonversion kein photokonvertiertes KikGR (Abbildung 1A). Anschließend wurde der ROI mit einem 405 nm Diodenlaser (bei 10% Intensität, 20 Iterationen) vollständig photokonvertiert und die Kopfgefäße wurden erneut mit den 488 nm und 561 nm Lasern gescannt (Abbildung 1B). Wie in Abbildung 1B gezeigt, hatte grünes KikGR innerhalb des ROI vollständig auf rot umgestellt. Nach dem Photokonversionstest wurde der Embryo aus der Agarose entnommen und bei 28,5 °C in Eiwasser aufgezogen. Schließlich wurde der Embryo 24 Stunden nach der Photokonversion, etwa 72 hpf, erneut beobachtet, um die photokonvertierten Endothelzellen in späteren Stadien zu verfolgen (Abbildung 1C). So wurde der Embryo in LMA eingebettet und die Probe mit den 488-nm- und 561-nm-Lasern erneut gescannt. Wie in Abbildung 1C gezeigt, wurden innerhalb des Endothelgewebes, das aus dem photokonvertierten ROI hervorging, sowohl nicht- als auch photokonvertierte KikGR-Proteine beobachtet, was auf die Stabilität des rot fluoreszierenden photokonvertierten KikGR und die Resynthese des neuen grünen nicht-photokonvertierten KikGR zurückzuführen ist.

Abbildung 1. Photokonversion von KikGR während der Entwicklung des Zebrafisches. (A,B) Eine bestimmte Region des endothelialen Kopfgefäßsystems wurde bei 48 hpf in Tg(kdrl:nlsKikGR)^{hsc7-transgenen} Embryonen photokonvertiert und (C) 24 Stunden nach der Photokonversion erneut beobachtet (etwa 72 hpf). Dargestellt sind die Fluoreszenz von KikGR (grün), photokonvertiertem KikGR (rot) und verschmolzenen Kanälen. Gestrichelte Kreise zeigen den ROI vor, nach und 24 Stunden nach der Fotokonvertierung. Die Bilder sind dorsale Ansichten des Zebrafischembryos, anterior zum Boden. Maßstabsleisten: 50 μm.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Protein (Akronym)	Ex (nm)	Em (nm)	EG	QY	Quartäre Struktur	Helligkeit	Anwendung	Schiri
Kaede_G	Nr. 508	518	99	0,9	Tetramer	259	Zellverfolgung	2,6
Kaede_R	572	580	60	0,3	Tetramer	59
KikGR_G	Nr. 507	Nr. 517	Nr. 54	0,7	Tetramer	Nr. 112	Zellverfolgung	3,6,8-10
KikGR_R	583	593	35	0,6	Tetramer	68
mKikGR_G	505	515	Nr. 49	0,7	Monomer	Nr. 101	Dynamisches Tracking Superaufgelöste Bilder	13
mKikGR_R	580	591	28	0,6	Monomer	53
EosFP_G	Nr. 506	Nr. 516	72	0,7	Tetramer	150	Zellverfolgung	5,20
EosFP_R	Nr. 571	Nr. 581	Nr. 41	0,5	Tetramer	67
tdEos_G	Nr. 506	Nr. 516	34	0,7	Tandem-Dimer	165	Bilder in Superauflösung	12,14,21
tdEos_R	569	Nr. 581	33	0,6	Tandem-Dimer	59
mEos2_G	Nr. 506	Nr. 519	56	0,7	Monomer	140	Dynamisches Tracking Superaufgelöste Bilder	11,18
mEos2_R	573	Nr. 584	Nr. 46	0,7	Monomer	90
Dendra2_G	490	Nr. 507	45	0,5	Monomer	67	Dynamisches Tracking Superaufgelöste Bilder	4,11
Dendra2_R	Nr. 553	573	35	0,55	Monomer	Nr. 57

Tabelle I. Eigenschaften von photokonvertierbaren fluoreszierenden Proteinen. Neben dem gebräuchlichen Namen und/oder Akronym für jeden PCFPs sind in der Tabelle die Wellenlängen der Spitzenanregung (Ex) und der Emission (Em), die molaren Extinktionskoeffizienten (EC, 10-3 M-1 cm-1), die Quantenausbeute (QY), die physiologisch relevante quartäre Struktur, die relative Helligkeit (in % von EGFP), die Anwendung und die Referenzen aufgeführt. Tabelle adaptiert von Day und Davidson, 2010¹.

PCFP	Transgene Zebrafischlinien	Quelle
Kaede	Tg(elavl3:Kaede)rw0130a	Okamoto Labor
	Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb:Kaede)
	Tg(ins:Kaede)
	Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)
	Tg(lhx5:Kaede)b1204/+	ZIRC
	Tg(myl7:kaede)
	Tg(olig2:Kaede)
	Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t	ZIRC
	Tg(UAS:Kaede)rk8	ZIRC
	Tg(vsx2:Kaede)nns2	Higashijima-Labor
KikGR	Tg(kdrl:nlsKikGR)
	Tg(krt4:NTR-KikGR)
	Tg(myl7:nlsKikGR)
	Tg(sox10:KikGR)
	Tg(UAS:KikGR)
EosFP	Tg(sox10:EosFP)
	Tg(sox10:nlsEosFP)
Dendra	Tg(-8mpx:Dendra2)
	Tg(UAS:Dendra-kras)

Tabelle II. Transgene Zebrafischlinien, die PCFP s exprimieren. Daten, die in der Zebrafish Model Organism Database (ZFIN, http://zfin.org/) erhalten wurden. Die Verfügbarkeit von Leinen im Zebrafish International Resource Center (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/) wird angezeigt.

Diskussion

In den letzten Jahren wurden transgene Tiermodelle für die Expression von photokonvertierbaren Proteinen wie Kaede oder KikGR erstellt. Diese Tiere entwickeln sich normal, was darauf hindeutet, dass diese Proteine keine toxischen Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung haben. Der erste Bericht über einen Photokonversionsassay zur Verfolgung von Zellen in Tierembryonen wurde von Hatta und Mitarbeitern durch Injektion von mRNA oder DNA, die für Kaede kodiert, in einzellige Zebrafischembryonen zur ubiquitären Expression o...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Materialien:
Notwendige Ausrüstung für die Aufzucht von Fischen und das Sammeln von Eiern (siehe Zebrafish Book22 für Details).
Stereomikroskop	Leica	Lecia MZ6 Stereomikroskop	Ausgestattet mit einem Laser, der bei 488 nm arbeitet
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO	Ausgestattet mit Lasern, die bei 488 nm, 561 nm und 405 nm arbeiten
Heizblock
Dumont #5 Pinzetten
Kulturschale mit Deckglasboden	MatTek Corp		Ashland MA
USA Microloader Pipettenspitzen	Eppendorf
Vortex
Nadeln
Reagenzien:
Ei Wasser Medium
60 μ g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O
E3 medium
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001% (w/v) Methylenblau
4 mg/ml Tricain-Stammlösung
>400 mg Tricain (3-Aminobenzoesäureethylester)	Sigma-Aldrich
97,9 ml ddH2O
2,1 ml 1M Tris (pH9)
Bei pH 7 einstellen, aliquotieren und -20 ° C
1% LMA (Niedrige Schmelztemperatur Agarose, Lonza)
>1g LMA/100 ml E3 medium 1X
Aliquot und lagern bei 4 ° C