Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode zum photoaktivierten Schalten von photokonvertierbaren fluoreszierenden Proteinen (PCFPs) im lebenden Zebrafischembryo und zur weiteren Verfolgung von photokonvertierten Proteinen zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung vor. Diese Methodik ermöglicht die Überwachung zellbiologischer Ereignisse, die verschiedenen Entwicklungsprozessen in einem lebenden Wirbeltierorganismus zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Embryogenese ist ein dynamischer Prozess, der am besten mit Techniken untersucht wird, die die Dokumentation von Entwicklungsveränderungen in vivo ermöglichen. Die Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine hat sich als wertvolle Strategie erwiesen, um dynamische morphogenetische Prozesse, wie sie im intakten Organismus ablaufen, aufzuklären. In den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung photoaktivierbarer und photokonvertierbarer fluoreszierender Proteine die Möglichkeit eröffnet, das Schicksal diskreter Subpopulationen von markierten Proteinen^{zu untersuchen 1}. Im Gegensatz zu photoaktivierbaren Proteinen lassen sich photokonvertierbare fluoreszierende Proteine (PCFPs) vor der Photokonversion leicht verfolgen und in ihrem nativen Emissionszustand abbilden, was die Identifizierung und Auswahl von Regionen durch optische Inspektion erleichtert. PCFPs, wie Kaede², KikGR³, Dendra⁴ und EosFP⁵, können von grün nach rot verschoben werden, wenn sie UV- oder blauem Licht ausgesetzt werden, und zwar aufgrund einer His-Tyr-Gly-Tripeptidsequenz, die ein grünes Chromophor bildet, das durch eine lichtkatalysierte β-Eliminierung und anschließende Verlängerung eines π-konjugierten Systems³ photokonvertiert werden kann. PCFPs und ihre monomeren Varianten sind nützliche Werkzeuge für die Verfolgung der Zellen^6-10 bzw. der Proteindynamik^11-14. In den letzten Jahren wurden PCFPs in verschiedenen Tiermodellen exprimiert, wie z.B. Zebrafisch⁶, Huhn^7,8 und Maus^9,10 zur Verfolgung des Zellschicksals. Hier berichten wir über ein Protokoll für die zellspezifische Photokonversion von PCFPs im lebenden Zebrafischembryo und die weitere Verfolgung von photokonvertierten Proteinen in späteren Entwicklungsstadien. Diese Methodik ermöglicht es, zellbiologische Ereignisse, die der Morphogenese im Zebrafisch-Tiermodell zugrunde liegen, gewebespezifisch zu untersuchen.

Protokoll

1. Gewinnung von Embryonen für den Photokonversionstest

Bei der Kreuzung von transgenen Zebrafischen, die ein PCFP exprimieren, werden die hellsten, homozygoten Embryonen ausgewählt und bei 28,5 °C bis zum gewünschten Embryonalstadium¹⁵ gezüchtet.

Anmerkung 1: Diese Vorauswahl ermöglicht das Scannen von Embryonen mit geringer Laserleistung, wodurch Phototoxizität und Photobleiche verhindert werden.

Anmerkung 2: Wir empfehlen, bei der Visualisierung von Embryonen Licht mit geringer Intensität zu verwenden und sie aufgrund der hohen Empfindlichkeit von PCFPs, wie Kaede und KikGR....

Diskussion

In den letzten Jahren wurden transgene Tiermodelle für die Expression von photokonvertierbaren Proteinen wie Kaede oder KikGR erstellt. Diese Tiere entwickeln sich normal, was darauf hindeutet, dass diese Proteine keine toxischen Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung haben. Der erste Bericht über einen Photokonversionsassay zur Verfolgung von Zellen in Tierembryonen wurde von Hatta und Mitarbeitern durch Injektion von mRNA oder DNA, die für Kaede kodiert, in einzellige Zebrafischembryonen zur ubiquitären Expression o.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Materialien:
Notwendige Ausrüstung für die Aufzucht von Fischen und das Sammeln von Eiern (siehe Zebrafish Book22 für Details).
Stereomikroskop	Leica	Lecia MZ6 Stereomikroskop	Ausgestattet mit einem Laser, der bei 488 nm arbeitet
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO	Ausgestattet mit Lasern, die bei 488 nm, 561 nm und 405 nm arbeiten
Heizblock
Dumont #5 Pinzetten
Kulturschale mit Deckglasboden	MatTek Corp		Ashland MA
USA Microloader Pipettenspitzen	Eppendorf
Vortex
Nadeln
Reagenzien:
Ei Wasser Medium
60 μ g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O
E3 medium
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001% (w/v) Methylenblau
4 mg/ml Tricain-Stammlösung
>400 mg Tricain (3-Aminobenzoesäureethylester)	Sigma-Aldrich
97,9 ml ddH2O
2,1 ml 1M Tris (pH9)
Bei pH 7 einstellen, aliquotieren und -20 ° C
1% LMA (Niedrige Schmelztemperatur Agarose, Lonza)
>1g LMA/100 ml E3 medium 1X
Aliquot und lagern bei 4 ° C