Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Summary

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung entweder Enzymatische Dissoziation von Zellstoff (DPSC-ED) Oder Direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate (DPSC-OG). Dann gefolgt von In vitro Vergleichende Unterscheidung der beiden Arten von hDPSCs zu Odontoblasten.

Introduction

Stammzellen sind Zellen, die klonogenen zwei bemerkenswerte Features, wie Multi-Potenz und Selbst-Erneuerung ¹⁵ bekannt zu besitzen. Unter allen Stammzellen mit verschiedenen Potenzen replikativen haben dentalen Stammzellen als die postnatale Stammzellen Aufmerksamkeit in den letzten Jahren ziehen wegen ihrer Zugänglichkeit, Plastizität und hohe proliferative Fähigkeit im Vergleich zu anderen adulten Stammzellen ^16. Charakteristischerweise ähnlich zu den mesenchymalen Stammzellen sind Zahnpulpa Stammzellen adhärenten Zellen, die mehrfache klonogenen Differenzierungskapazität in Mesenchym und / oder nicht-Mesenchym Abstammungslinien, sowohl in vitro als auch in vivo aufweisen. ^1-8,17,18 DPSCs werden identifiziert durch ihre negative Ausdruck von hämatopoetischen Antigene (zB CD45, CD34, CD14) und positive Expression CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 und STRO-1. ^19,20

Leicht erhalten Potenzial mit minimalen Schmerzen und Morbidität zu menschlichen DPSCs als wertvolleLage Quelle von MSCs zu den gewöhnlichen Quellen, wie Knochenmark mesenchymale Stammzellen ²¹ verglichen. Im Allgemeinen haben sich entweder durch Auswachsen DPSCs Verfahren, dh Migration von Stammzellen aus Zellstoff Gewebeexplantate (DPSC-OG) ^22-24, und / oder durch enzymatischen Verdau (DPSC-ED) ^4,6,25 isoliert worden. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Isolierungsmethode und Kulturbedingungen können verschiedene Populationen oder Linien unter in vitro Durchlässe ^26,27 induzieren. Im Fall der zweiten Zähne (pDPSCs), Huang et al offenbart, dass die enzymatische verdaut pDPSCs höheren Proliferationspotential haben im Vergleich zu den herausgewachsen DPSCs. ²⁶ zudem im Falle von Milchzähnen (dDPSCs), es wurde nachgewiesen, dass STRO-1 & CD34 Marker Ausdruck mehr in dDPSC-ED im Vergleich mit dDPSC-OG. Darüber hinaus erscheint dDPSC-ED höheren Mineralisierungsgeschwindigkeit in definierten osteo / odonto Medium. ²⁷ Daher ist aufgrund der hervorragenden Potenzial DPSCs in regenerative Medizin, werden weitere Studien zum besseren Verständnis der möglichen verschiedenen Populationen, die aus verschiedenen Isolierungsverfahren abgeleitet sind erforderlich.

Hier war es Versuch einfache Art Pulpenextraktion einzuführen, indem in einem Schritt dentalen Diamantscheibe um den Prozess der Pulpenextraktion erleichtern. Darüber hinaus wurde nach der Isolierung von menschlichen Zellstoff-Stammzellen durch Anlegen ED oder OG Methoden wurden allgemeinen Eigenschaften & Differenzierungskapazität zwischen zwei Gruppen ebenfalls untersucht.

Protocol

Ein. Bereiten Sie die Enzymlösung und Proliferation Medium (PM)

1. Make Collagenase Typ I Lösung: Einwaage Collagenase Typ I (12 mg / ml) und lösen sich in 1 ml PBS und Filter unter Verwendung einer Spritze 0,2 um Filter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei -20 ° C bis benötigt.
2. Machen Dispase Lösung: abwiegen Dispase (16 mg / ml) auflösen und in 1 ml PBS und Filter mit einer 0,2 um Spritzenfilter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei 4 ° C bis benötigt.
3. Make Enzymlösung: 1 ml Kollagenase Typ I-Lösungen (12 mg / ml) und 1 ml Dispase Lösungen (16 mg / ml) in das 2 ml sterilem PBS, die 100 mg / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin. Volle Konzentration von Dispase und Collagenase I in Endvolumen sollte 4 mg / ml und 3 mg / ml, rezeptiv sein. Dann Aliquot dieses Volumen um vier 15-ml-Tube, die jeweils 1 ml Enzymlösung. Jedes Rohr könnte ein Zellstoffkochung verwendet werden.
4. Machen Waschlösung: In 100 mg / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin in PBS.
5. Machen basischen Medien: Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS und 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin ergänzt.
6. Machen Sie das Proliferation Media (PM): Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS, 100 uM L-Ascorbinsäure-2-Phosphat, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml ergänzt Streptomycin, 0,25 mg / ml Amphotericin B.
7. Machen Odontogene Medien: Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS, 100 uM L-Ascorbinsäure-2-Phosphat, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 0,01 uM ergänzt Dexamethason, 5 mM β-Glycerin-Phosphat, 1,8 mM Monokaliumphosphat.

2. Bereiten Menschliche Dental Pulp Tissue for Dental Pulp Stem Cell Isolation

1. Normale menschliche dritte Molaren wurden von Erwachsenen (21-29 Jahre) an der Zahnklinik des Imam Ali im Rahmen genehmigter Institutional Review Board (IRB) gesammelt.
2. Zähne wurden in das basische Medium (α-MEM mit 10% FBS ergänzt) platziert und wurden in Labor bei 4 ° C transferiert
3. Unter dem sterilen Bedingungen, die innerhalb einer biohazard Laminarströmungshaube, Set-up wurde ein 100 mm Petrischalen für jeden Zahn verarbeitet werden getan. Zahnoberflächen wurden durch 70% Ethanol gereinigt.
4. Während der Arbeit in einer der Petrischalen wurde Zahn durch Zahnzange gehalten und mit einer Skalpellklinge wurde verwendet, um sauber aus Debris und Parodontalspalt an den Wurzeln.
5. Schmelzzementgrenze wurde langsam durch sterilisiert zahnärztliche Disc, um die Pulpakammer sichtbar zu machen. Es sollte berücksichtigt werden, dass Schneidvorgang langsam durchgeführt werden muß, um eine Überhitzung des reduzieren Zahngewebe werden.
6. Pulpagewebe wurde vorsichtig von der Krone und Wurzel getrennt.
7. Pulpagewebe wurde in kleine Stücke mit Hilfe einer Skalpellklinge geschnitten.

3. Menschliche Dental Pulp Isolation

1. Pulp Geweben unterzog entweder enzymatische Spaltung von Pulpagewebe oder direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate für die Isolierung von hDPSCs.
2. Enzymatische Dissoziation von Pulpagewebe:
   1. Kleine Stücke von Zellstoff Gewebe wurden in Enzym-Lösung für 1 Std. bei 37 ° C überführt Vortex alle 30 min zu helfen Aufbrechen Gewebe.
   2. Danach wurden große Zellaggregate entfernt und Einzel-Zellsuspensionen wurden erhalten, indem man Zellen durch eine 70-uM Zellsieb.
   3. Einzelzell-Suspensionen wurden bei 1200 UpM für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
   4. Überstände wurden vorsichtig abpipettiert und Pellet wurde in 1 ml Proliferationsmedium (PM) resuspendiert. (Hinweis: FBS in Proliferationsmedium beenden enzymatische dissenschaften.)
   5. Einzelzell-Suspensionen von Zahnpulpa wurde in 25 cm ² Kulturkolben mit PM ausgesät und anschließend bei 37 ° C in 5% CO _2.
   6. Das Kulturmedium wurde alle drei Tage gewechselt, bis die Zelle Konfluenz erreicht war.
3. Direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate:
   1. Pulp Gewebe wurde in 1-2-mm-Fragmente zerkleinert, und jedes Stück wurde in 25-cm ² Kulturflaschen mit PM platziert und dann bei 37 ° C in 5% CO _2. Es sollte berücksichtigt werden, dass Gesamtvolumen des PM nach Auswuchs der Zelle muss die Befestigung der Pulpe Stücke für weitere Zelle Auswuchs (2-3 ml pro Flasche) unterstützt werden.
   2. Medium wurde nach Auswuchs beobachtet.
   3. Die entwachsen Zellen bei Konfluenz wurden subkultiviert in einem Verhältnis von 1:4 (Durchgang 1).

4. Immunphänotypisierung

1. 250.000 Zellen /Rohr von beiden Arten von Zellen in Passage 3 wurden durch PE oder FITC-konjugiertem Anti-Human-Antikörpern mit deren Isotypen für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln inkubiert. (Anmerkung:. Die Konzentration von Antikörpern, wurde gemäß der Herstellung Protokoll angewendet wird)
2. Nach der Inkubationszeit wurden 100 ul PBS oder FACS Verdünnungslösung zu jedem Röhrchen zugegeben und zentrifugiert bei 1.200 rpm für 5 min in dunklen Ort.
3. Überstände wurden entfernt und Pellets wurden in 100 ul PBS oder FACS-Verdünnung in dunklen Ort resuspendiert.
4. Gezielte Oberflächenmarker (CD-Marker) wurden von BD FACSCalibur ausgewertet.

5. Induktion der Differenzierung von DPSCs in mineralisierten Cells & Quantifizierte Alizarin Red S Assay

1. DPSCs, die entweder durch enzymatische Spaltung von Pulpagewebe (bekannt als DPSC-ED) oder direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate (DPSC-OG) erhalten wurden, waren subkultiviert für 3 Gänge.
2. At Passage 3 wurden die Zellen in einer 6-Well-Platte bei 5.000 Zellen / well Samen.
3. Bei Konfluenz von 60% wurden odontogenen Medium durch herkömmliche PM ersetzt. Drei Vertiefungen wurden als negative Kontrolle durch Zugabe Wachstumsmedium blieb.
4. Medium alle 3 Tage bis Tag 21.
5. Am Tag 21 wurden die Zellen mit PBS gewaschen und wurden durch 1 ml / Vertiefung 10% Paraformaldehyd für 15 Min. bei Raumtemperatur fixiert.
6. Dann Paraformaldehyd wurde, sorgfältig und pipettiert Zellen wurden 3 mal (5-10 min für jedes Mal) mit destilliertem H ₂ O gewaschen (Hinweis: Vermeiden Sie stören die Monoschicht.)
7. Nach dem Waschen wurden 1 ml / Vertiefung Alizarinrot S für 20 min bei Raumtemperatur zugegeben.
8. Zellen wurden durch deionisiertes H ₂ O viermal (5 min für jede Zeit auf dem Schüttler) gewaschen, um alles zusätzliche Alizarinrot entfernen.
9. 1 ml / Vertiefung H ₂ O zugegeben, um die Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern.
10. Die Platten wurden auf visuelle ins angenommenpection und / oder Bildaufnahme.
11. Für Alizarin Red S Quantifizierung Assay wurden H ₂ O durch 1 ml 10% ige Essigsäure zu jedem Well der 6-Well-Platte und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln ersetzt.
12. Dann wurden Zellmonoschicht / Vertiefung schaben & sowohl Essigsäure und Zellen wurden in die getrennten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt. (Hinweis:. Jede Vertiefung sollte Transfer sein in ein separates Röhrchen dh drei Probebohrungen & drei Kontrollvertiefungen für jede ED & OG Gruppen)
13. Die Röhrchen wurden 30 Sekunden lang kräftig verwirbelt.
14. Erhitzen auf 85 ° C für 10 min. (Hinweis: die Verdunstung zu vermeiden, wurden Röhrchen mit Parafilm versiegelt.)
15. Nach dem Erhitzen wurden Rohre in Eis für 5 min übertragen. (Hinweis: Rohre sollten nicht geöffnet werden, wenn sich gekühlt werden.)
16. Die Aufschlämmungen wurden bei 20.000 × g für 15 min zentrifugiert. Während Zentrifugieren wurden Alizarin Red Normenbis.

Alizarin Red S-Standard wurden zuerst durch Verdünnen der Verdünnungspuffer & verwendet für die Herstellung 2-fach serielle Verdünnungen auf der Basis der Tabelle vorbereitet.

High Range Konzentration des Farbstoffs

Low Range Konzentration des Farbstoffs

2 mM

1 mM

500 uM

250 uM

125 uM

62,5 uM

31,3 uM

15,6 uM

7,8 uM

3,9 uM

1,9 uM

0,9 uM

0,4 uM

Leer

16. Nach der Zentrifugation wurden 1 ml Überstand / Rohr in neuen, separaten 1,5 ml Mikro-Zentrifugenröhrchen überführt.
17. Der pH wurde mit ~ 375 ul 10 neutralisierten% Ammoniumhydroxid pro Röhrchen. (Anmerkung: der pH Wut sollte 4,1-4,5 sein.)
18. 150 ul von Standard & Proben (umfasst separate Tests & Kontrollen) wurden in einem undurchsichtigen Wänden, transparenter Boden 96-well-Platte gegeben.
19. Die Absorption wurde bei 405 nm abgelesen und OD-Werte aus den Proben wurden mit Standard-Plot für die weitere Analyse verglichen.

Results

1. DPSCs, die durch enzymatische Spaltung (DPSC-ED) erhalten wurden, werden hier am Tag 10, 15,18 (Figur 1) dargestellt. Die Kolonien eingeleitet, auf fast 3 bis 5 Tagen nach der Isolierung zu bilden.
2. Entwachsen DPSCs (DPSC-OG) sind in Abbildung 2 an Tag 5, 10, 13 und 18 dargestellt. Fibroblast-ähnliche Zellen aus Pulpagewebe in den Kolben wandern begann parallel Bestellung um fast 5 Tage nach der Aussaat.
3. DPSCs bei Passage 3 mit beiden Methoden sind in Abbildung 3 dargestellt....

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung und Charakterisierung von hDPSCs von Zahnpulpa mit zwei Methoden, enzymatische Dissoziation und direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate. Zusätzlich wird in vitro Differenzierung dieser Zellen in Odontoblasten, wurde durch quantitative Alizarinrot S & Assay QPCR beurteilt.

Bestehenden Protokollen zur Isolierung Pulpagewebe aus menschlichen Zahns worden verschiedenen Instrumente wie Zangen (Knochenzange) 9, Ex...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog oder Lot. Anzahl	Kommentare (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase Typ I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin / Streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine Serum definierten (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-Ascorbinsäure-2-Phosphat	Sigma	A8960-5G
L-Glutamin	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol Dinatriumsalz-Hydrat, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Monobasischem Kaliumphosphat	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE Isotypenkontrolle	BD Pharmingen	50808088029
FITC Maus IgG2b Isotyp-Kontrolle	BD Pharmingen	559532
FITC-Maus IgG1 κ Isotyp	BD Pharmingen	11471471
FITC / PE Maus-Anti-Human-CD34/CD45	BD Pharmingen	341071
PE-Anti-Human CD146	BD Pharmingen	550315
Monoklonalen Maus-Anti-Human-CD90/FITC	Daka	00034418
PE Maus anti-human CD73	BD Pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD Pharmingen	FAB10971P
PE-Maus Anti-Human CD11b/Mac1	BD Pharmingen	5553888
CD44 PE Maus anti human	BD Pharmingen	555479
Phosphatpufferlösung (PBS)	GIBCO	003000
70-um Zellsieb	Falke	352360
0,2 um Spritzenfilter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm 2 Kulturflasche	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
Multiskan Mikrotiterplatten-Spektrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Fleurcense Mikroskop	Olymp
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