Methodenartikel

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

DOI:

10.3791/4372

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24. November 2012

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1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung entweder Enzymatische Dissoziation von Zellstoff (DPSC-ED) Oder Direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate (DPSC-OG). Dann gefolgt von In vitro Vergleichende Unterscheidung der beiden Arten von hDPSCs zu Odontoblasten.

Einleitung

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Stammzellen sind Zellen, die klonogenen zwei bemerkenswerte Features, wie Multi-Potenz und Selbst-Erneuerung 15 bekannt zu besitzen. Unter allen Stammzellen mit verschiedenen Potenzen replikativen haben dentalen Stammzellen als die postnatale Stammzellen Aufmerksamkeit in den letzten Jahren ziehen wegen ihrer Zugänglichkeit, Plastizität und hohe proliferative Fähigkeit im Vergleich zu anderen adulten Stammzellen 16. Charakteristischerweise ähnlich zu den mesenchymalen Stammzellen sind Zahnpulpa Stammzellen adhärenten Zellen, die mehrfache klonogenen Differenzierungskapazität in Mesenchym und / oder nicht-Mesenchym Abstammungslinien, sowohl i....

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Protokoll

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Ein. Bereiten Sie die Enzymlösung und Proliferation Medium (PM)

  1. Make Collagenase Typ I Lösung: Einwaage Collagenase Typ I (12 mg / ml) und lösen sich in 1 ml PBS und Filter unter Verwendung einer Spritze 0,2 um Filter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei -20 ° C bis benötigt.
  2. Machen Dispase Lösung: abwiegen Dispase (16 mg / ml) auflösen und in 1 ml PBS und Filter mit einer 0,2 um Spritzenfilter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei 4 ° C bis benötigt.
  3. Make Enzymlösung: 1 ml Kollagenase Typ I-Lösungen (12 mg / ml) und 1 ml Dispase Lösungen (16 mg / ml) in d....

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Ergebnisse

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  1. DPSCs, die durch enzymatische Spaltung (DPSC-ED) erhalten wurden, werden hier am Tag 10, 15,18 (Figur 1) dargestellt. Die Kolonien eingeleitet, auf fast 3 bis 5 Tagen nach der Isolierung zu bilden.
  2. Entwachsen DPSCs (DPSC-OG) sind in Abbildung 2 an Tag 5, 10, 13 und 18 dargestellt. Fibroblast-ähnliche Zellen aus Pulpagewebe in den Kolben wandern begann parallel Bestellung um fast 5 Tage nach der Aussaat.
  3. DPSCs bei Passage 3 mit beiden Methoden sind in Abbildung 3 dargestellt........

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung und Charakterisierung von hDPSCs von Zahnpulpa mit zwei Methoden, enzymatische Dissoziation und direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate. Zusätzlich wird in vitro Differenzierung dieser Zellen in Odontoblasten, wurde durch quantitative Alizarinrot S & Assay QPCR beurteilt.

Bestehenden Protokollen zur Isolierung Pulpagewebe aus menschlichen Zahns worden verschiedenen Instrumente wie Zangen (Knochenzange) 9, Ex.......

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei für ihre kritischen Diskus und Mr. Mohammad Reza Khadem Sharif für seine technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog oder Lot. Anzahl Kommentare (optional)
α-MEM GIBCO 11900-073
Collagenase Typ I Sigma-Aldrich C0130-100MG
Dispase GIBCO 17105-041
Penicillin / Streptomycin GIBCO 15140-122
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Fetal Bovine Serum definierten (FBS) HyClone SH30070.03
L-Ascorbinsäure-2-Phosphat Sigma A8960-5G
L-Glutamin GIBCO 25030-024
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol Dinatriumsalz-Hydrat, BioUltra Sigma G9422-100G
Monobasischem Kaliumphosphat Sigma-Aldrich P5655
Osteogenesis Assay Kit Millipore PS01802031
Mouse IgG2b-PE Isotypenkontrolle BD Pharmingen 50808088029
FITC Maus IgG2b Isotyp-Kontrolle BD Pharmingen 559532
FITC-Maus IgG1 κ Isotyp BD Pharmingen 11471471
FITC / PE Maus-Anti-Human-CD34/CD45 BD Pharmingen 341071
PE-Anti-Human CD146 BD Pharmingen 550315
Monoklonalen Maus-Anti-Human-CD90/FITC Daka 00034418
PE Maus anti-human CD73 BD Pharmingen 550257
Anti-h CD105/Endoglin PE BD Pharmingen FAB10971P
PE-Maus Anti-Human CD11b/Mac1 BD Pharmingen 5553888
CD44 PE Maus anti human BD Pharmingen 555479
Phosphatpufferlösung (PBS) GIBCO 003000
70-um Zellsieb Falke 352360
0,2 um Spritzenfilter Millex-GV SLGV033RB
25 cm 2 Kulturflasche Sigma-Aldrich Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur BD 342975
Multiskan Mikrotiterplatten-Spektrophotometer Thermo Scientific 51119200
Fleurcense Mikroskop Olymp
Fließende Software Version 2.3.1

Referenzen

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  1. Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
  2. Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce n....

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Schlagwörter

Enzymatische DissoziationAuswachsmethodeDurchflusszytometrieOdontoblasten DifferenzierungAlizarin Rot F rbungqPCR Analysemesenchymale MarkerCD73 CD90 CD105Stammzellisolation

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