Summary
Pistas olfativas mediar muitos comportamentos diferentes em insetos, e muitas vezes são misturas complexas compostas de dezenas a centenas de compostos voláteis. Utilizando cromatografia em fase gasosa com multi-canais de gravação no lobo antenal inseto, descreve-se um método para a identificação de compostos bioactivos.
Abstract
Todos os organismos habitam um mundo cheio de estímulos sensoriais que determinam a sua resposta comportamental e fisiológica ao seu ambiente. O olfato é especialmente importante em insetos, que utilizam seus sistemas olfativos para responder, e discriminar entre estímulos, odor complexos. Estes odores provocam comportamentos que medeiam processos como a reprodução e seleção de habitat 1-3. Além disso, sensores químicos por comportamentos insetos media que são altamente significativa para a agricultura ea saúde humana, incluindo a polinização 4-6, herbivoria de culturas alimentares 7, e transmissão da doença de 8,9. Identificação de sinais olfativos e seu papel no comportamento dos insetos é, portanto, importante para a compreensão tanto dos processos ecológicos e os recursos alimentares humanos e bem-estar.
Até à data, a identificação de compostos voláteis que dirigem o comportamento de insectos tem sido difícil e tedioso. As técnicas atuais incluemgás de gravação eletroantenogramas cromatografia acoplada (GC-EAG), e cromatografia em fase gasosa acoplada gravações individuais sensillum (GC-SSR) 10-12. Estas técnicas provaram ser vital para a identificação de compostos bioactivos. Nós desenvolvemos um método que usa cromatografia gasosa acoplada a multi-canal registros eletrofisiológicos (denominado «GCMR ') de neurônios no lóbulo antenal (AL; principal centro do inseto olfativas) 13,14. Esta técnica estado-da-arte nos permite investigar como as informações odor é representado no cérebro do inseto. Além disso, porque as respostas neurais aos odores, a este nível de processamento olfactivo são altamente sensíveis devido ao grau de convergência de neurónios da antena do receptor em neurónios AL, AL gravações irá permitir a detecção de constituintes activos de odores naturais de forma eficiente e com elevada sensibilidade. Aqui descrevemos GCMR e dar um exemplo de seu uso.
Várias etapas gerais são envolved na detecção de compostos voláteis bioactivos e da resposta de insectos. Voláteis primeiro precisam ser coletados a partir de fontes de interesse (neste exemplo, usar flores da Mimulus gênero (Phyrmaceae)) e caracteriza-se como necessário, utilizando padrão de GC-MS técnicas 14-16. Os insectos são preparados para o estudo utilizando dissecção mínima, após o qual um eléctrodo de gravação é inserida no lobo antenal e gravação multi-canal neural começa. Pós-processamento dos dados neurais, então, revela que odores particulares causar significativas respostas neurais do sistema nervoso dos insetos.
Embora o exemplo que apresentamos aqui é específico para os estudos de polinização, GCMR pode ser expandida para uma ampla gama de organismos de estudo e de fontes voláteis. Por exemplo, este método pode ser utilizado na identificação de odores para atrair ou repelir insectos vectores e pragas de culturas. Além disso, GCMR também pode ser usado para identificar atractivos para os insectos benéficos, tais como pollinators. A técnica pode ser expandida para indivíduos não-insectos, bem.
Protocol
1. Follection volátil
- Neste exemplo, nós usamos amostras voláteis de M. lewisii flores - um alpino nativa wildflower para a Califórnia. Os voláteis são recolhidos através de métodos de adsorção de acordo com a dinâmica Riffell et al. 14. Resumidamente, este método utiliza um sistema de retenção de ciclo fechado onde as flores são colocados num saco de Teflon. Utilizando uma bomba de vácuo inerte, o ar em torno das flores é aspirado através de uma "armadilha" composta de uma pipeta de Pasteur cheia com Porapak Q matriz. O ar de retorno a partir da bomba é filtrada através de carvão activado. Depois de um período de tempo prescrito, no nosso caso, de 24 h, o Porapak Q matriz é eluída com um solvente não-polar, tipicamente hexano, para recolher o extracto concentrado. O extracto é em seguida armazenado a -80 ° C até à análise. Se necessário, as amostras podem ser concentradas antes da análise, sob uma corrente de azoto gasoso. A não ser que a amostra já está bem caracterizado, executar-se uma alíquota da mesma através de umcromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) para identificar os componentes voláteis, antes de utilizar a amostra.
2. Preparação eletrofisiológico
- Cortar cerca de 1 cm a partir da extremidade da ponta de uma pipeta de 1000 ul. Coloque uma abelha (impatiens do Bombus) na base da ponta de pipeta e empurre para a extremidade oposta da ponta até que apenas a cabeça é exposta.
- Derreter a cera dental e moldá-lo ao redor da cabeça exposta, certificando-se que a parte de cera para os olhos compostos para a segurança e para fazer a cabeça da abelha completamente imóvel. Certifique-se de não obter qualquer cera na antena da abelha.
- Uma vez que a cabeça é seguro, fazer um quadrado, janela como incisão na cápsula cabeça usando uma lâmina de barbear disjuntor ou o tamanho adequado de bisturi para cortar a cutícula. Com a lâmina de disjuntor, que começa no lado dorsal da cápsula cabeça, imediatamente atrás da antena e ao lado dos olhos compostos. Cortaruma linha reta, a partir de um olho composto para o olho composto contralateral. Depois de cortar uma linha reta para o olho composto oposto, começar a fazer uma incisão dorsal até que as curvas de cabeça cápsula e termina perto de seu tórax. Neste ponto, começam a cortar para a extremidade oposta da cápsula cabeça. Finalmente, uma vez que uma linha foi cortada para a extremidade oposta, uma linha de corte de volta para cima para a posição de partida da incisão inicial. É importante remover a cutícula, que fica ao lado da antena, pois isso irá impedir a inserção do eléctrodo.
- Uma vez que a cutícula é cortado, usar um par de fórceps para remover a cutícula de abelha, que deve, em seguida, expor o cérebro de abelha, e, mais importante ainda, os lóbulos antenais. Começar imediatamente superfusing o cérebro com salino de insectos, de modo a que o cérebro não se torna dessicated. Após o cérebro é exposto, cuidadosamente utilizar uma pinça muito finas para remover a bainha perineural imediatamente acima dos lóbulos antenais. Tenha muito cuidado para nãopunção cérebro da abelha com a pinça.
3. Cromatografia Gasosa com multi-canal de gravação
- A abelha "preparação" - fixado em um tubo com seu cérebro exposto - está agora pronto para a gravação eletrofisiológico. Coloque a abelha em uma braçadeira, fixado a uma base magnética que se encontra sobre uma mesa de ar.
- Providenciar um saco IV, o controlador de fluxo, e tubagem (cheio com solução salina de insectos), de modo que a solução salina continuamente superfuses cérebro.
- Usando um micromanipulador, eletrodo insertareference, feito de fio de tungstênio, no olho da abelha.
- Utilizando um micromanipulador separado, inserir o eléctrodo de canais múltiplos, como por exemplo um fio enrolado tetrode, ou de silício de canal multi-eléctrodo (NeuroNexus), em lobos antenal da abelha. Este eléctrodo está ligado a um pré-amplificador, tais como o sistema de TDT de S-3 série Z para o processador bioamp Z-bus do sistema TDT. A saída do Chro Gásdetector matogram via um cabo blindado BNC pode ser interligado com o sistema de aquisição de dados de amplificação e de tal forma que tanto o sinal neural e GC está sincronizado.
- Espere cerca de 30-60 minutos para as gravações neurais para estabilizar. Uma vez que a actividade espontânea e da forma de onda de unidades nos canais de gravação tornaram-se consistentes, utilizar uma seringa de odor para estimular a abelha e observar a resposta dos canais de gravação para o odor.
- Gravar picos extracelulares de neurónios por auto-thresholding os canais de gravação por 3,5-5 sigma do sinal dos canais individuais de gravação. Limiarização manual pode ser necessária para alguns canais para evitar a contaminação de ruído elétrico. Os potenciais de ação de neurônios aparecerá como picos de tensão no canal de gravação. Quando a tensão do canal exceder o limite, o sistema armazena e salva os poucos milissegundos antes e depois da passagem do limiar, assim, tomandoga instantâneo da forma de onda, ou espiga.
- Imediatamente ao lado da mesa de ar é o GC. Antes de injectar o extracto floral no GC, certifique-se de que o método para a rampa de temperatura de funcionamento do GC está correcta. No nosso exemplo, iremos utilizar um método de temperatura a partir de 50 ° C durante 4 min, seguido por um aumento da temperatura a uma taxa de 10 ° C / min. a 220 ° C, altura em que se mantenha o GC para um min 6 adicional. Usamos uma coluna DB-5 GC (J & W Scientific, Folsom, CA, EUA), com hélio como gás de transporte. A entrada é splitless, com uma temperatura programada de 200 ° C. A temperatura da chama detector de ionização é ajustado a 230 ° C.
- Injectar a amostra de extracto de headspace floral na porta de injecção aquecida do GC para liberar os voláteis adsorvidos na coluna de GC. O efluente da coluna é dividido 1:1 entre o Detector de Ionização de Chama (FID) e a antena de abelha usando um copo conector "Y" (J & W Scientific). Comece recording do eletrodo como você injetar uma amostra para o GC.
- Após o ciclo de GC ter terminado, deixar o resto preparação de 5 a 15 min. Em seguida, injectar-se outra amostra no GC ou estimular a preparação de compostos voláteis usando individuais ou misturas de compostos. Neste último método de estimular a preparação, os impulsos de ar a partir de um fluxo de ar constante são desviadas através de uma seringa de vidro contendo um pedaço de papel de filtro em que os compostos tenham sido depositados. O estímulo odor foi pulsada por meio de uma válvula de solenóide activado controlada pelo software.
- Se a atividade da unidade pára de repente ou alterações, verifique o gotejamento de solução salina e deixar o resto preparação para 15 min. Se a atividade espontânea não recuperar o seu nível anterior, então a preparação deve ser descartada e outra abelha usado se disponível.
- Após a experiência, o cérebro fixar com 5% de formalina durante 20 minutos com a sonda ainda no tecido. Em seguida, o cérebro do consumoe colocá-lo em glutaraldeído a 2%, durante 4 horas, e, subsequentemente, fazer uma série graduada de etanol e desidratação limpar o cérebro com o salicilato de metilo. Com base na fixação e compensação do tecido, os locais na AL onde os eletrodos perfurado o tecido deve ser claramente visível por microscopia confocal.
4. Análise de Dados
- Analisar os dados coletados após o experimento para separar e identificar as unidades gravadas neurais. Usar programas de software típicos (Sorter Offline, MClust, e SClust) para formas de onda em separado, ou "picos", baseada em formas de espiga, como pico ou amplitude vale, o pico de meia largura, etc, ou medidas reduzidas (componentes principais) 17 , 18 (Figura 2). Utilizar apenas os grupos de picos separados que no espaço tridimensional (PC1-PC3) e são estatisticamente diferentes um do outro (ANOVA multivariada, p <0,05) (Figura 2) para análise posterior. Por favor, consultecitação # s 17-19 para a descrição completa de tetrode gravação e ponto-ordenação metodologias.
- Carimbo de tempo picos de cada cluster e exportar esses dados para análise usando MATLAB ou Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, Carolina do Norte) para criar gráficos de varredura e respostas da taxa de queima (Figuras 2, 3A).
- Identificar os tempos de retenção de compostos voláteis usando os dados registados simultaneamente GC. Utilizar os tempos de retenção dos compostos voláteis, determinado pelo vértice do pico do cromatograma, para analisar as respostas de unidade a esses pontos de tempo.
- Para avaliar as respostas de cada unidade através da execução de GC, bin o número de espigas em intervalos de 100 ms e examinar o curso temporal das respostas da frequência de disparo, com referência ao tempo de retenção de voláteis de eluição. O binning de picos de 100 intervalos de mseg fornece detalhes suficientes, ou de sinal, sobre o curso temporal da resposta neuronal a um odorante por eluição a partir da GC.
- Para examinar as respostas da população para os voláteis eluição diferentes, integrar as respostas da frequência de disparo das unidades individuais ao longo de uma janela de amostragem de 3 seg, 1,5 seg antes, e depois de 1,5 seg, o tempo de retenção do volátil (Figura 3). Este período de tempo é típico da duração de uma eluição volátil da GC. Mostramos disparando respostas da frequência das unidades de codificação de cores a eles (vermelho é uma resposta elevada taxa de queima; azul é uma resposta baixa) e dispondo-os como uma matriz de actividade com cada linha que representa a resposta do conjunto para o efluente GC (colunas) ( Figura 3).
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Representative Results
No ensaio utilizando o GCMR M. lewisii aroma floral, injetamos 3 ul do extracto no GC. O número total de voláteis de eluição através da GC é tipicamente 60-70 voláteis. O cheiro de M. lewisii é predominantemente composto por monoterpenóides, incluindo β-mirceno (acíclico) e α-pineno, sendo o restante do aroma composto de seis carbonos, tais como compostos voláteis de 2-hexanol, e sesquiterpenos que compreendem <1% do espaço livre.
GCMR aproveita a sensibilidade dos neurónios do lobo antenal, bem como o processamento neuronal de voláteis biologicamente importantes. No entanto, multi-canal gravações desta natureza, de fato, ter uma amostra aleatória de neurônios no lóbulo antenal. Isto acontece porque pequenas mudanças na posição da posição do apalpador entre preparações diferentes pode causar a matriz de gravação para amostrar os neurónios diferentes. Além disso, as posições exatas e morphologies dos neurônios registrados são desconhecidos porque a gravação é extracelular. Para acomodar estes efeitos, é tipicamente executado experimentos GCMR com 8 a 16 preparativos, com 8 a 18 unidades neural em cada preparação. Para fins de ilustração, no entanto, usaremos dados a partir de apenas uma preparação (8 unidades).
A partir dos experimentos GCMR, verificou-se que as unidades são surpreendentemente selectivo na sua resposta ao voláteis, como representado na Figura 3A. O traço inferior (a preto) representa o cromatograma de iões, onde cada pico corresponde a uma dada volátil que está a chegar ao detector com o tempo. O traço superior (azul) mostra as respostas da frequência de disparo de uma unidade. As respostas da unidade foram calculados por binning o número de espigas produzidas num intervalo msec 100, e dividindo-se por que período de tempo para produzir a taxa. No exemplo, a unidade neural é selectiva, em resposta a D-limoneno. Note-se que, nesta unidade, firin o espontâneog taxa ainda pode ser variável e sujeito a flutuações aleatórias. No entanto, as respostas ao D-limoneno estavam bem acima do intervalo de confiança de 95%, como calculado pela variância nas respostas de taxa de queima ao longo do tempo.
Nem todas as unidades, no entanto, reagiu com os voláteis a partir da eluição de GC. De facto, em média, aproximadamente 50% das unidades registadas em cada conjunto foram unresponsive (Figura 3B). Isto é surpreendente, dada a diversidade de compostos voláteis no headspace floral que estão por eluição a partir da GC. No entanto, a proporção de não-responsivos unidades num conjunto é surpreendentemente consistente entre preparações, como encontrado em estudos anteriores 13,14.
Além das respostas das unidades individuais, o sistema GCMR também permite a análise de população de nível de respostas para os odorantes eluídos a partir da GC. No exemplo mostrado aqui, há seletividade conjunto forte para um grupo de vários odores (
Figura 1. Diagrama esquemático da câmara de expansão do sistema de sorção e GCMR. (A) No esquema, uma flor é colocado dentro de um saco de Teflon, e utilizando uma bomba de vácuo, o ar do saco é aspirado através de uma armadilha volátil (Porapak Q), para concentrar o emitida voláteis. O ar é filtrado e retornado ao flor fechado. (B) A amostra de extracto de headspace floral é injectared no GC e o efluente da coluna é dividido tal que metade de um fluxo de entrada ou o detector de ionização de chama de GC, e a outra metade do efluente é levado por uma linha de transferência aquecida e chega simultaneamente a antena da abelha. Potenciais de ação do conjunto neural AL são continuamente registrados extracelularmente durante a 20 minutos de entrega odor via GC. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Seleção de unidades gravado usando a matriz de gravação multi-canal (RM) na AL da abelha. As duas hastes são espaçados de tal modo que a matriz compreende um grande volume do AL. (A) A característica de forma de onda (por exemplo ampères litude, vale) de cada um "pico" na gravação tetrode podem ser plotados em um espaço tridimensional. No exemplo aqui apresentado, a altura de cada pico em 3 dos 4 canais de gravação é representada em 3-D. Uma vez que cada unidade terá sua própria forma espigão, os espigões de uma dada unidade que se agrupam, permitindo assim que as unidades a serem identificados e classificados de um outro. Unidades classificadas mostraram diferenças claras nas respostas de queima (B; trama raster) e da forma de onda da forma (C) Posicionamento dos quatro canais em cada haste fornecidos gravação de grandes zonas de processamento dentro de glomérulos e neuropil. Actividade neuronal foi registada em cada um dos quatro canais, traçada em três dimensões do espaço (como mostrado em A), e classificados de acordo com as características de forma de onda. para ver figura maior .
Figura 3. (A) histogramas de queima de taxa de respostas de unidade para os compostos eluídos a partir da M. lewisii headspace extrato (3 injeção ul) (traço de fundo, preto). Odores específicos (por exemplo, D-limoneno; seta vermelha) evocou respostas significativas em unidades (B) resposta de todas as unidades que foram gravadas a partir do MR a cada odorante eluída do GC.. O enredo de superfície é um código de cores de acordo com as respostas de disparo normalizados taxa das unidades individuais. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Insetos olfativo mediadas comportamentos conduzir muitos processos diferentes, incluindo a reprodução, host local, seleção e identificação de recursos alimentares adequados. O estudo destes processos requer a capacidade de identificar os voláteis emitidos a partir da fonte, bem como a capacidade de identificar esses compostos, que são mediadoras dos comportamentos. Para complicar as coisas é que os odores são compostas de dezenas a centenas de compostos individuais que, juntos, criam um aroma único que é percebido de forma diferente do que os constituintes individuais 6,7,13,19,20. Research, inicialmente conduzida no sistema de feromona sexual 12, e, mais recentemente, em alimentos e oviposição relacionada odores 13,20, mostrou que a eficácia comportamental da mistura reside em função de uns poucos, voláteis chave na mistura, e que as misturas de eliciar respostas comportamentais significativamente maior do que os componentes individuais. Identificar aqueles chaveconstituintes é, portanto, um componente importante na moderna ecologia química, bem como neurobiologia olfativo.
Uma variedade de técnicas têm surgido nos últimos cinquenta anos, para a identificação de compostos bioactivos que dirige o comportamento de insectos. A técnica básica para a detecção de compostos voláteis por a antena de insectos é de cromatografia a gás eletroantenografia (GC-EAG). EAG foi originalmente desenvolvido por Schneider 21, que gravou as flutuações de tensão pequenas geralmente assumido ser causada por despolarizações elétricas de muitos neurônios olfativos entre a ponta ea base de uma antena de insetos durante a estimulação. EAG mais tarde foi integrado com o GC para identificação precisa dos voláteis headspace, que provocam reacções antenais 12,22. Além disso, a gravação de neurónios receptores individuais a partir da antena de insectos foi mais tarde desenvolvido 11,23 e acoplado com o GC para fornecer uma única sensillum gravações ou GC-SSR. Ambora GC-SSR é mais demorada e difícil do que a GC-EAG, as gravações de fornecer informação sobre as respostas de células individuais através de potenciais de acção em resposta aos GC-efluentes, e permite a identificação dos receptores que são especializados para compostos particulares que pode ser perdida por GC-EAG 24.
O GC-GC-EAG e SSR técnicas oferecem identificação dos produtos voláteis, que provocam reacções na periferia, e estão assim envolvidos na recepção odorante. Técnicas mais recentes começaram a analisar as respostas do sistema nervoso central de mamíferos e insectos, e são, portanto, envolvido na percepção odorante. Estas técnicas caem em duas grandes categorias: os métodos de imagem 25-I denominado GC (cromatografia gasosa-imaging) e métodos eletrofisiológicos diretos (por exemplo GCMR). GC-I e GCMR oferecem várias vantagens por causa da convergência dos neurônios sensoriais para a projeção, ou saída, os neurônios doAL, bem como que estes métodos permitem a determinação de como odorantes são representados no cérebro de insectos. Além disso, métodos semelhantes estão agora a ser utilizada no cérebro de mamíferos 25.
Apesar dessas vantagens, GCMR e GC-Ofereço desvantagens também. A análise dos dados pode ser demorada e, no caso de o GCMR, projecções glomerulares das unidades gravados neurais são desconhecidos devido às gravações, sendo extracelular. Além disso, o AL insecto é inervada por vários diferentes tipos neuronais incluindo neurónios de projecção (PNs) e interneurônios locais (LNs) tornando assim a identificação das unidades gravados difíceis. No entanto, a lagarta, M. sexta, trabalho recente demonstrou que PNs e LNS pode ser identificado pelo comportamento cravação dos neurónios, permitindo assim a identificação destes tipos de neurónios, pela sua actividade espontânea 26. No entanto, GCMR e GC-I permite a identificação dos odorantes que activatneurônios receptores electrónicos especializadas que podem não provocam reacções EAG fortes, bem como para determinar a forma como a população de neurónios no cérebro processar os voláteis. Um estudo que comparou estas diferentes metodologias ainda não foi realizado, embora os nossos dados preliminares sugerem que o GCMR pode ser mais adequada do que a GC-EAG para aqueles compostos que são bioactiva, mas são em quantidades vestigiais no extracto (resultados não publicados Riffell). Os trabalhos futuros poderão analisar o trade-off na sensibilidade de detectar odores bioativas com o tempo de análise entre as diferentes metodologias.
Embora tenhamos focado aqui na detalhando os métodos de ensaio que usamos para B. impatiens abelhas eo aroma de M. lewisii, o extracto e as espécies de insectos utilizados podem ser alterados, se certas modificações são feitas. As espécies de insectos pode ser colocado em diferentes pontas de pipeta (10 a 200 uL), dependendo da sua dimensão. Espécies de maior porte, como a mariposa, Manducasexta, podem ser colocadas em frascos de 6 ml de amostra. Em tal forma, a preparação é mantida viva permitindo assim gravações estáveis várias horas de duração.
Tomados em conjunto, os métodos de análise para o isolamento de compostos com gravações eletrofisiológicas nos insectos cerebrais presentes ferramentas poderosas para a identificação de compostos bioactivos e, quando usado em conjunto com experiências de comportamento, pode apresentar um meio pelo qual os materiais voláteis para determinar importantes relacionados com a alimentação comportamentos em 13 insetos, bem como aqueles envolvidos em host local-2, e sangue-host comportamentos relacionados 27 que são importantes para pragas agrícolas e vetores de doenças.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela NSF concessão IOS 1121692, e pela Fundação Universidade de Washington Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system - OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software - SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
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