Methodenartikel

Microgavage der Zebrafischlarven

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DOI:

10.3791/4434

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20. Februar 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen eine neuartige Methode zur Mikroschlundsondierung von Zebrafischlarven unter Verwendung standardmäßiger Mikroinjektions- und Stereomikroskopieausrüstung für Embryonen vor. Wir zeigen, dass die Mikroschlundsondierung eine sichere und effiziente Technik ist, die dazu dient, kontrollierte Mengen unterschiedlichster Substanzen gezielt in das intestinale Lumen von Zebrafischlarven abzugeben.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch hat sich als ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Untersuchung der Darmentwicklung etabliert1-5, Physiologie6-11, Krankheit12-16und Wirt-Mikrobe-Interaktionen17-25. Experimentelle Ansätze zur Untersuchung der intestinalen Biologie erfordern häufig die in vivo Einführung ausgewählter Materialien in das Lumen des Darms. Im Larven-Zebrafisch-Modell wird dies typischerweise durch Einweichen der Fische in eine Lösung des ausgewählten Materials oder durch Injektion durch die Bauchwand erreicht. Bei der Einweichmethode ist es schwierig, den Weg oder den Zeitpunkt der Applikation des Materials an den Darm genau zu überwachen oder zu steuern. Aus diesem Grund kann die Exposition durch Einweichen unbeabsichtigte Toxizität und andere Effekte auf außerhalb des Darms gelegenen Geweben verursachen, was den möglichen Bereich der in den Darm applizierbaren Materialmengen begrenzt. Zudem kann die während der Einweichexposition aufgenommene Materialmenge zwischen einzelnen Larven erheblich variieren.26Obwohl diese Probleme bei einer direkten Injektion durch die Bauchdecke nicht auftreten, ist eine korrekte Injektion schwierig und verursacht Gewebeschäden, die die Versuchsergebnisse beeinflussen könnten. Wir stellen eine Methode zur Mikrogavagierung von Zebrafischlarven vor. Ziel dieser Methode ist es, eine sichere, effektive und reproduzierbare Möglichkeit bereitzustellen, um Material gezielt und mit kontrollierter zeitlicher Abfolge direkt in das Lumen des vorderen Darmabschnitts von Zebrafischlarven zu verabreichen. Die Mikrogavagierung nutzt Standardausrüstung für die Embryo-Mikroinjektion und Stereomikroskopie, wie sie in den meisten Laboren, die Zebrafischforschung betreiben, üblich ist. Sobald die Fische korrekt in Methylcellulose positioniert sind, kann die Gavagierung schnell durchgeführt werden, mit einer Rate von etwa 7–10 Fischen pro Minute, und die Überlebensrate nach der Gavagierung liegt je nach verabreichtem Material nahe bei 100 %. Wir zeigen außerdem, dass die Mikrogavagierung das Beladen des Darmlumens mit hohen Konzentrationen von Substanzen ermöglicht, die für die Fische tödlich sind, wenn sie über die Badexposition verabreicht werden. Um die Nützlichkeit dieser Methode zu demonstrieren, präsentieren wir einen fluoreszierenden Dextran-Mikrogavagierungs-Assay, der verwendet werden kann, um den Transport aus dem Darmlumen in extraintestinale Bereiche zu quantifizieren. Dieser Test kann genutzt werden, um die korrekte Durchführung der Mikrogavagierung zu überprüfen, und stellt zudem einen neuartigen Zebrafisch-Assay zur Untersuchung der Integrität der intestinalen Epithelbarriere unter verschiedenen experimentellen Bedingungen bereit.z. B. genetische Manipulation, Pharmakabehandlung oder Exposition gegenüber Umweltfaktoren). Darüber hinaus zeigen wir, wie mittels Gavage die intestinale Motilität bewertet werden kann, indem fluoreszierende Mikrosphären verabreicht und deren anschließender Transitt durch den Darm verfolgt wird. Die Mikrogavage kann zur Applikation verschiedenster Substanzen eingesetzt werden, wie lebende Mikroorganismen, sezernierte mikrobielle Faktoren/Gifte, pharmakologische Wirkstoffe und physiologische Sonden. Aufgrund dieser Möglichkeiten hat die Methode der Mikrogavage an larvalen Zebrafischen das Potenzial, ein breites Spektrum an Forschungsbereichen, die das Zebrafisch-Modellsystem nutzen, maßgeblich zu erweitern.

Protokoll

Zur Gewinnung von Larven für die Mikrogavage verwenden wir veröffentlichte Protokolle für die Standardhaltung und -pflege von Zebrafischen27. Wir nutzen hauptsächlich natürliche Fortpflanzung zur Vermehrung der Fische, die in einem 14-Stunden-Licht/10-Stunden-Dunkel-Rhythmus gehalten werden. Dieses Protokoll wurde für die Mikrogavage von Zebrafischlarven im Alter von 6–7 Tagen nach der Befruchtung (dpf) optimiert. Wir erwarten, dass diese Methoden mit geringen Anpassungen auch auf jüngere und ältere Entwicklungsstadien anwendbar sind. Sofern nicht anders angegeben, verwendeten wir den Wildtyp-Stamm TL von Zebrafischen im Alter von 6 dpf, wobei die Fische nicht gefüttert wurden. Alle Experimente wurden in Systemwasser durchgeführt, das aus unserer konventionellen Zebrafisch-Aquakulturanlage stammte; jedoch kann jedes geeignete Zebrafischmedium (z. B. Embryomedium oder gnotobiotisches Zebrafischmedium (GZM)28) verwendet werden. In diesem Protokoll bezeichnet der Begriff „Zebrafischmedium“ das jeweils vom Anwender gewählte Medium.

1. Herstellung von Methylcellulose, Gavagenform und Herstellung der Mikrogavagenkanüle

Bereiten Sie am Tag vor oder am frühen Tag des Experiments die Methylcellulose, die Agaroseform zur Stabilisierung der Larven und die Mikrogastrationsnadeln vor.

  1. Lösen Sie 3 g Methylcellulose in 100 ml steriler, deionisierter Wasser oder Zebrafisch-Medien (je nach Anwendung) auf, um eine 3%ige Lösung herzustellen. Geben Sie einen magnetischen Rührstab in die Flasche, erhitzen Sie das Wasser nahe dem Siedepunkt und stellen Sie es auf ein Rührgerät mit starker Heizung. Während des Rührens streuen Sie langsam Methylcellulose hinein, um Klumpenbildung zu vermeiden. Verringern Sie im Laufe des Tages langsam die Rührgeschwindigkeit und die Temperatur des Rührgeräts, bis Raumtemperatur erreicht ist.
  2. Rühren Sie langsam über Nacht weiter, bis die Methylcellulose vollständig gelöst ist. Die Lösung kann mehrere Monate bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Behälter aufbewahrt werden.
  3. Stellen Sie eine 3%ige Agarose-Gel-Form in einer 10 cm Petrischale mit einer Kunststoffform (Adaptive Science Tools, TU-1) gemäß den Herstelleranweisungen her. Versiegeln Sie sie mit Parafilm und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie benötigt wird, um Austrocknung zu verhindern. Erwärmen Sie vor dem Experiment auf Raumtemperatur oder 28 °C. Agarose-Formen können in der Regel mehrmals wiederverwendet werden.
  4. Ziehen Sie mehrere Gavage-Nadeln aus Borosilikat-Glaskapillaren mithilfe eines Flaming Brown-Mikropipettenziehers mit einer breitgeschlitzten Heizwendel (FT330B). Die von uns verwendeten Programme zur Nadelherstellung lauten wie folgt:
NadeltypDruckHitzeZugkraftGeschwindigkeitZeit
Embryo50031510050200
Gavage50031512575200

Da sich die Heizdauer zwischen Geräten unterscheiden kann, notieren Sie die Rampenzeit (aktive Heizzeit). Unsere Rampenzeit liegt für dieses Programm zwischen 8,57 und 8,79 ms. Dieses Programm erzeugt kürzere, gedrungenere Nadeln als herkömmliche Mikroinjektionsnadeln (Abbildung 1). Diese Einstellungen müssen möglicherweise für den Einsatz in verschiedenen Mikropipettenzuggeräten optimiert werden.

2. Schneiden, Befüllen und Kalibrieren der Mikroschläuche für die Gavage

Hinweis*: Das Abschneiden der Nadeln ist ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Außerdem variieren die Methoden zum Befüllen und Kalibrieren der Nadeln je nach verwendeter Art von Mikroinjektionsgerät. Wir haben dieses Protokoll mit Drummond-II-Mikroinjektoren optimiert, gehen jedoch davon aus, dass es mit geringen Modifikationen auch auf andere Mikroinjektionsinstrumente anwendbar sein wird. Da Injektionsvorrichtungen und Nadelziehgeräte zwischen verschiedenen Laboren variieren können, ist es wichtig, die Injektionsvolumina zu messen und zu kalibrieren (siehe Abschnitt 2.8).

  1. Die Nadeln werden unter einem Stereomikroskop abgeschnitten. Wir verwenden ein Leica S6E-Stereomikroskop mit 2,5-facher Vergrößerung. Bei dieser Einstellung entspricht die Okularskala mit 100 Teilstrichen einer Länge von 2 mm.
  2. Richten Sie die Nadelspitze mit dem Ende der Skala (Teilstrich 100) aus und schneiden Sie die Nadel mit feinen Uhrmacherpinzetten etwa 1 mm von der Spitze entfernt ab (Teilstrich 48–50) (Abbildung 1A).
  3. Die Nadel sollte einen Durchmesser von etwa 27–30 μm aufweisen und stumpf sein. Überprüfen Sie die Nadelspitzen bei 100-facher Vergrößerung. Scharfe oder gezackte Nadeln erhöhen die Wahrscheinlichkeit von Gewebeschäden während der Gavage und sollten nach Möglichkeit vermieden werden.
  4. Alternativ kann, falls verfügbar, ein Mikroschmelzofen verwendet werden, um den Abschneidepunkt der Nadel besser zu kontrollieren und die Nadelspitzen abzuschmelzen, um scharfe Kanten zu entfernen (Abbildung 1B).
  5. Bereiten Sie die Gavelösung vor. Für die meisten Anwendungen stellen wir die Lösung her, indem wir eine 1:10-Verdünnung einer 0,5 %igen Phenolrot-Lösung in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (Sigma-Aldrich) hinzufügen, um sicherzustellen, dass die Lösung unter dem Stereomikroskop sichtbar ist, um die korrekte Funktion des Mikroinjektors sowie die Platzierung der Gavelösung im vorderen Bulbus zu überwachen. Andere Farbstoffe als Phenolrot wurden nicht evaluiert, könnten jedoch verwendet werden.
  6. Befüllen Sie die Gavenadel, indem Sie mit einer 1-ml-Spritze und einer 25G 5/8-Nadel Mineralöl einfüllen. Befestigen Sie die Nadel am Nanoject-II-Mikroinjektionsgerät.
  7. Wickeln Sie eine 10 cm große Plastik-Petrischale mit Parafilm ein, um eine flache, wasserdichte Oberfläche zu erhalten, und pipettieren Sie etwa 2 μl der Gavelösung auf den Parafilm. Füllen Sie die Gavenadel manuell rückwärts, wobei Sie darauf achten sollten, keine Luftblasen im Mineralöl zu erzeugen.
  8. Um die Funktion des Mikroinjektors zu testen und das Ausstoßvolumen zu kalibrieren, füllen Sie eine 3 cm große Petrischale mit Mineralöl und injizieren Sie so lange in das Öl, bis die Tröpfchen eine gleichmäßige Größe aufweisen. Messen Sie den Durchmesser der Tröpfchen mithilfe der Okularskala oder einer Messfunktion am Stereomikroskop, falls verfügbar. Berechnen Sie das Tröpfchenvolumen (Gleichung: V=4/3πr3). Die Volumenkonstanz zwischen verschiedenen Nadeln wird dargestellt (Abbildung 1C).
  9. Spülen Sie die Nadelspitze durch mehrfaches Eintauchen in sauberes Zebrafischmedium, um restliches Mineralöl zu entfernen, bevor Sie mit der Gavage beginnen. Mineralöl ist sehr dicht und kann Gewebe schädigen, wenn es nicht von der Nadelspitze abgespült wird.

3. Anästhesie, Montage und Gavage von Zebrafischembryonen

  1. Erwärmen Sie die Agaroseform vor dem Experiment auf Raumtemperatur oder 28 °C.
  2. Bereiten Sie die Agaroseform für die Gavage vor, indem Sie 3 Rillen mit 3 % Methylcellulose bedecken. Verwenden Sie eine ausreichende Menge Methylcellulose, um die Rillen vollständig zu bedecken und die Fische zu fixieren, aber nicht so wenig, dass sie schnell austrocknet.
  3. Geben Sie in einer sauberen 6-Well-Platte Zebrafischlarven jeder Versuchsgruppe in separate Wells, wobei jedes Well 3,5–4,0 ml Zebrafischmedium enthält.
  4. Bereiten Sie eine 3x-Tricain-Lösung (0,05 % w/v) im geeigneten Zebrafischmedium vor. Betäuben Sie die Fische wellweise, indem Sie ein gleiches Volumen der 3x-Tricain-Lösung in das Well mit den Larven geben, um eine Endkonzentration von 1,5x (0,025 %) zu erreichen, und schwenken Sie vorsichtig.
  5. Sobald sich die Zebrafische nicht mehr bewegen, nehmen Sie sie mit einer Pasteurpipette mit großem Durchmesser und einer Pipettierpumpe aus dem Well und legen Sie sie einzeln auf die Methylcellulose, wobei die Köpfe im 45°-Winkel der Rinne liegen und die Schwänze in Richtung des 90°-Winkels verlaufen. Drücken Sie sie vorsichtig mit einer stumpfen Präpariernadel in die Methylcellulose, um ihre Position zu stabilisieren.
  6. Stellen Sie die Nanoject-II-Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass die Nadel in einem flachen Winkel geneigt ist, der annähernd parallel zum 45°-Winkel der Agaroseform verläuft. Stellen Sie sicher, dass der Auslenkbereich der Nadel ausreicht, um bis unterhalb des Bodens des Formbrunnens zu reichen, sodass nach dem Positionieren der Fische möglichst wenige Nachjustierungen erforderlich sind.
  7. Stellen Sie das Mikroinjektionsgerät auf eine Freigabe von 4,6 nl (maximal) bei der langsamen Injektionseinstellung (23 nl/sec) ein. Bei diesen Einstellungen sollte das applizierte Volumen gerade die vordere Darmblase füllen, ohne aus Ösophagus oder Kloake auszutreten. Kleinere Volumina können je nach Versuchsziel verwendet werden.
  8. Verwenden Sie eine Hand, um geringfügige Justierungen der Platte mit den immobilisierten Larven vorzunehmen, während Sie gleichzeitig mit der anderen Hand den Manipulator der Mikroinjektionsvorrichtung steuern.
  9. Führen Sie die Gave-Nadel vorsichtig in den Mund des betäubten Fisches, durch den Ösophagus hindurch, und drücken Sie leicht den Ösophagussphinkter, um die Spitze der Gave-Nadel gerade innerhalb der vorderen Darmblase zu platzieren (Abbildung 2, Schritt 1–2, a&b).
  10. Sobald die Nadel in der vorderen Darmblase ist, drücken Sie vorsichtig das Fußpedal oder den Injektionsknopf, um das Material zu verabreichen. Ziehen Sie die Nadel schnell und gleichmäßig zurück, wobei darauf geachtet werden sollte, dass kein nennenswertes Volumen in den Ösophagus gelangt (Abbildung 2, Schritt 3–4).
  11. Nach der Gavage verwenden Sie eine Pasteurpipette mit großem Durchmesser und einer Pipettierpumpe, um die Zebrafischlarven vorsichtig in frisches Medium zu überführen. Füllen Sie die Pipette mit Wasser bis etwa einen Zoll über der Knickstelle, erzeugen Sie mit dem Wasser eine kleine Blase in der Methylcellulose nahe dem Kopf der Larve, um sie freizugeben, heben Sie den Kopf vorsichtig in den Pipettenmund und ziehen Sie die Larve aus der Methylcellulose. Geben Sie Fisch und gesamtes Wasser sanft aus der Pipette in eine Schale mit frischem Medium.
  12. Spülen Sie die Larven durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren oder mehrmaliges Benetzen mit Medium, um die Methylcellulose zu entfernen und die Larven aus der Narkose zu erwecken. Überführen Sie die Larven in eine Petrischale oder eine 6-Well-Platte, bis sie für die anschließende Bildgebung und Analyse benötigt werden.

4. Dextran-Assay zur Überprüfung der Sicherheit der Magensonde und der Integrität der Darmbarriere

Mittels Mikro-Gavage können unterschiedliche Substanzen in den Darm eingeleitet werden. Als Beispiel stellen wir im Folgenden ein Protokoll zur Gavage eines mit Texas Red konjugierten 10-kD-Dextrans zur Untersuchung der Integrität der Darmbarriere vor. Es existieren mindestens zwei mögliche parazelluläre Permeabilitätswege, die sich in ihrer Selektivität bezüglich Ladung und Größe der gelösten Stoffe unterscheiden und als „Poren-“ oder „Leck-“-Wege bezeichnet werden29. Da dieses Dextran zu groß ist, um über den parazellulären Porenweg (Größenlimit ~4 Å, 10-kD-Dextran = ~23 Å) durch das Darmepithel resorbiert zu werden9,30–32, sollte es im Darmlumen verbleiben, sofern die Integrität der Darmbarriere nicht beeinträchtigt ist. Obwohl 10-kD-Dextran über den parazellulären Leckweg transportiert werden könnte, weist dieser Weg eine geringere Kapazität und langsamere Kinetik auf29,33 und ist daher innerhalb des Zeitrahmens dieses Assays unwahrscheinlich. Als „positiver Kontroll“-Ansatz zur Störung der Barriereintegrität dient die Zugabe von EDTA, das epitheliale Tight Junctions auflöst34,35. Dieser Dextran-Gavage-Test kann als Qualitätskontrolle verwendet werden, um zu belegen, dass die Gavage sicher durchgeführt wird und unbeabsichtigte Gewebeschäden vermieden werden. Zudem kann dieser Assay eingesetzt werden, um die Integrität der Darmbarriere in Abhängigkeit vom Genotyp oder einer Behandlung zu überprüfen.

  1. Bereiten Sie die folgenden Gavagenlösungen vor: 1 % Dextran/1x PBS/0,05 % Phenolrot und 1 % Dextran/20 mM EDTA/1x PBS/0,05 % Phenolrot (Positivkontrolle). Der 5 %igen Dextran-Grundstoff in ddH2O wird zur Verringerung der Anzahl von Einfrier- und Auftauzyklen in 50-μl-Aliquoten bei -20 °C gelagert. Bereiten Sie außerdem eine Kontroll-Gavagenlösung aus 1x PBS/0,05 % Phenolrot vor.
    + Kontrolle (EDTA)kein EDTA
 StammlösungEndkonzentrationVerdünnungsfaktor10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Dextran5%1%522
PBS10x1x1011
Phenolrot0,50%0,05%1011
   Teilsumme:54
   ddH2O:56
   Gesamt:1010
  1. Verwenden Sie das Protokoll aus Abschnitt 3, um Gruppen von 10–20 Zebrafischnachkommen für jede experimentelle Bedingung zu sondieren. Wiederholen Sie dies gegebenenfalls mit duplizierten oder tripelten Gruppen.
  2. Nach der Sonderung erholen Sie die Larven von der Anästhesie und lassen Sie sie frei in frischem Medium schwimmen.
  3. 18–20 Minuten nach der Sonderung betäuben Sie die Larven erneut wie in Schritt 3.3 beschrieben. Positionieren Sie die Larven in 3 % Methylcellulose auf einem 3 %igen Agarose-Block (dies reduziert die Hintergrundreflexion während der Bildaufnahme).
  4. Nehmen Sie Bilder der Larven mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop (z. B. Leica M205C) und einem Texas-Red-Filter bei einer Vergrößerung auf, die die Larven von der Schnauze bis unmittelbar hinter das Ende der Kloake zeigt.
  5. Nehmen Sie alle Bilder mit denselben Belichtungseinstellungen auf, damit sie später quantifiziert und verglichen werden können. Die Fluoreszenz ist im Darmlumen aller mit Dextran behandelten Larven intensiv, doch die Barrierefunktion wird anhand der Menge an Dextran beurteilt, die in extraintestinale Gewebe (d. h. Rumpf und Blutgefäße) gelangt ist (Abbildung 5). Wählen Sie die Belichtung so, dass die Fluoreszenz im Rumpfbereich sichtbar wird, auch wenn dadurch die Lumina-Fluoreszenz überbelichtet wird.
  6. Stufen Sie die Zeitpunkte der Sonderung so ab, dass jede Gruppe etwa gleich lange Zeit zur Erholung nach der Sonderung hat und etwa zum gleichen Zeitpunkt nach der Sonderung abgebildet wird. Für dieses Experiment benötigt eine Person pro Gruppe etwa 1 Stunde. Die Fische werden 18–20 Minuten nach der Sonderung anästhesiert, und die Bildaufnahme dauert etwa 1–2 Minuten pro Fisch.
  7. Verwenden Sie ein Bildanalyseprogramm wie ImageJ, um die relative mittlere Fluoreszenzintensität in einem Bereich des Rumpfes direkt oberhalb des Darms zu quantifizieren. Normalisieren Sie diese Werte, indem Sie eine Hintergrundmessung aus einem Bereich außerhalb des Fisches subtrahieren.
  8. Stellen Sie die Daten aus der Bildanalyse grafisch dar und analysieren Sie sie mit GraphPad Prism oder einer ähnlichen statistischen Software.

5. Fluoreszenzmikrosphären-Assay zur Untersuchung der Darmmotilität

Die Schlundsonde ermöglicht eine verbesserte Kontrolle über Zeitpunkt und Menge der Applikation von Substanzen im Darm und stellt somit eine ideale alternative Methode für Untersuchungen der Darmmotilität dar. Bisher veröffentlichte Techniken zur Messung der Darmmotilität bei Zebrafischlarven umfassen die direkte Beobachtung von Darmkontraktionen und -wellen mittels Mikroskopie1,21,36 oder das Füttern von Larven mit Nahrung, die mit gelb-grün fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen versetzt wurde26. In einigen Studien wurde die Quantifizierung von Darmmotilitätsmustern verbessert, indem Larven in ein Medium mit Lebensmittelfarbstoff37 oder durch eine spezielle videobasierte Analysetechnik namens Spatiotemporal-Mapping38,39 getaucht wurden. Hier präsentieren wir eine Machbarkeitsstudie, die zeigt, dass fluoreszierende Mikrokügelchen mittels Schlundsonde in den vorderen Darmabschnitt (Bulbus) appliziert werden können und dass die Verfolgung der Bewegung dieser Kügelchen zur Beurteilung der Darmmotilität genutzt werden kann (Abbildung 6). Der wesentliche Unterschied zwischen dieser Methode und der Vorgehensweise von Field und Kollegen26 besteht darin, dass die Kügelchen allein appliziert werden und aufgrund der begrenzten Nadelgröße der Schlundsonde nicht in die Nahrung eingearbeitet werden können.

  1. Zebrafrafische-Larven in 10 cm-Platten mit 35 ml Medium aufbewahren, bis das Experiment am 7. Tag nach der Befruchtung (dpf) durchgeführt wird. Ab dem 5. dpf einmal täglich morgens mit ca. 0,6 mg Pulvernahrung füttern (Larvenfutter, wie zuvor beschrieben40; verabreicht mit einer sterilen Inokulationslöffel mit 1 mm Durchmesser).
  2. Die Flasche mit den Fluoresbrite YG 2,0 μm großen Polystyrol-Mikrosphären (~2,5%ige wässrige Suspension) vorsichtig schütteln, um die Suspension zu homogenisieren. Einen Tropfen aus der Flasche auf Parafilm abpipettieren, sodass ein bestimmtes Volumen durch erneutes Pipettieren genau abgemessen werden kann.
  3. In einem Eppendorf-Röhrchen die Kügelchen bei niedriger Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge zentrifugieren, das Überstandsvolumen abnehmen und durch 1x PBS im ursprünglichen Volumen ersetzen. Diesen Waschschritt zweimal wiederholen, um die Mikrosphären zu reinigen.
  4. Eine Gavage-Suspension herstellen, die 0,25 % Mikrosphären (1:10 Verdünnung der Stammsuspension), 1x PBS und 0,05 % Phenolrot enthält. In dem pro Larve verabreichten Gavage-Volumen von 4,6 nl befinden sich ca. 2,6×103 Mikrosphären.
  5. Den in Abschnitt 3 beschriebenen Protokoll verwenden, um die gewünschte Anzahl an Larven zu gavagieren. Da die Mikrosphären leicht schwimmfähig sind, sollte die Gavage so schnell wie möglich durchgeführt werden, um die Konsistenz der Suspension bestmöglich zu erhalten.
  6. In diesem Experiment wurden 15 Larven gavagiert und anschließend nach Erholung von der Anästhesie einzeln in den Vertiefungen einer 12-Loch-Platte aufbewahrt, um den Transitt über Einzeltiere zu verfolgen. Größere Gruppen können jedoch ebenfalls gavagiert und der Transitt als Population statt einzeln analysiert werden. Für Standardverfahren siehe Field et al.26.
  7. Die intestinale Motilität bewerten, indem die am weitesten kaudal (bzw. anterior) gelegene Position der fluoreszierenden Mikrosphären in lebenden Larven zu verschiedenen Zeitpunkten unter dem fluoreszenzmikroskopischen Stereomikroskop bestimmt wird. Die Larven kurz in 1x (0,017 %) Tricain anästhesieren und anschließend die Zonen der Mikrosphärenlokalisation bewerten oder Bilder aufnehmen, um diese später auszuwerten.
  8. Den prozentualen Anteil der Larven mit Mikrosphären in einem bestimmten Darmabschnitt im Verlauf der Zeit grafisch darstellen und vergleichen.

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Ergebnisse

Wenn die Gavage korrekt durchgeführt wird, sollte das verabreichte Material vollständig im vorderen Darmabschnitt enthalten sein, wobei wenig bis kein Rückstand im Ösophagus verbleibt (Abbildung 3). Es sollte ein Applikationsvolumen gewählt werden, das im vorderen Darmabschnitt Platz findet und weder durch die Kloake noch durch den Ösophagus austritt. Falls das Volumen des Materials oder der Applikationsdruck zu hoch ist, kann die mechanische Kraft der Gavage zu einer Schädigung des Epithels oder zu eine...

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Diskussion

In dieser Arbeit beschreiben wir ein neuartiges Protokoll zur direkten Applikation von Substanzen in den Darm von Zebrafischlarven mittels Mikrosondierung. Während des gesamten Verfahrens sind mehrere kritische Schritte zu beachten. Zunächst sollten die Zebrafischlarven vor dem Sondeerversuch gesund sein, um Todesfälle, die nicht mit der Behandlung zusammenhängen, zu vermeiden. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Qualität der Sonde. Einer der schwierigsten Teile des Protokolls ist das Abschneiden der Sonde an der geeig...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern des Rawls-Labors für hilfreiche Vorschläge zum Inhalt und Dr. Alan Fanning für wertvolle Diskussionen über die Größenpermeabilität von Tight Junctions und Methoden zu deren Störung. Außerdem danken wir Dr. Michael Chua und Dr. Neal Kramarcy der Michael Hooker Microscopy Facility für die Unterstützung bei der Nutzung des konfokalen Mikroskops. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt: T32 DK007737-15 (für den Doktoranden J.L.C.), F32 DK094592 (an J.L.C.) und R01 DK081426 (an J.F.R.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Finquel (Tricaine methanesulfonate)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Anästhesie von Larven
Phenolrot-LösungSigma-AldrichP0290-100 ml0,5 % in DPBS, zellkulturgeeignet getestet
Mineralöl, leicht, weiß (hohe Reinheit)AmrescoJ217-500 mlZum Nachfüllen der Nadeln und Volumenprüfung
TxRed-Dextran, 10.000 MW, lysinfixierbarInvitrogen/ Molecular ProbesD-18631 %ige Suspension in 1x PBS/Phenolrot
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF346535 mM Stammlösung in Wasser
MethylcelluloseMP Biochemicals0215549590
Borosilikat-GlaskapillarenDrummond Scientific3-000-203-G/XAD 1,14 mm, ID 0,53 mm, 3,5 Zoll Länge
Kunststoffform zur Herstellung von GussformenAdaptive Science ToolsTU-1
Nanoject II MikroinjektionsgerätDrummond Scientific3-000-204
Flaming-Brown-Mikropipettenzieher, 3,0 mm Weitfeld-FilamentSutter Instrument Co.P-97, FT330BHerstellung von Nadeln
Student-Dumont #5-PinzetteFine Science Tools91150-200,1 x 0,06 mm, zum Abschneiden von Nadeln
Okularmikrometer, 5 mm – 100 TeilungenLeica10394771zum Abschneiden von Nadeln
MikroforgeNarishigeMF-900zum Abschneiden und Feuerglätten von Nadeln
Tuberkulin-SlipTip-SpritzenkanüleBecton Dickinson3096261 ml, 25G 5/8-Kanüle
Fluoresbrite YG Mikrosphären (2,0 μm)Polysciences, Inc.18338Analyse der Darmmotilität
PräparationsmikroskopLeicaS6EGavage-Verfahren
Fluoreszenz-StereomikroskopLeicaM205CDextran-Barrieretests
Konfokales MikroskopZeissLSM510Bildgebung von Dextran in der Zirkulation

Referenzen

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