Intranasale Verabreichung von CNS Therapeutics Awake Mäuse

Leah R. Hanson; Jared M. Fine; Aleta L. Svitak; Katherine A. Faltesek

doi:10.3791/4440

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Methodenartikel

Intranasale Verabreichung von CNS Therapeutics Awake Mäuse

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DOI:

10.3791/4440

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8. April 2013

Leah R. Hanson¹ , Jared M. Fine¹ , Aleta L. Svitak¹ , Katherine A. Faltesek¹

¹Alzheimer’s Research Center at Region’s Hospital, HealthPartners Institute for Education and Research

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Verfahren zur Verabreichung von Arzneien intranasal zu erwachen Mäusen zum Zwecke der Ausrichtung des Gehirns beschrieben. Diese Methode ermöglicht wiederholten Gabe über einen längeren Zeitraum mit intranasale Verabreichung von Medikamenten ohne Narkose und Nase-zu-Hirn-Lieferung mit minimalen systemischen Exposition.

Zusammenfassung

Intranasale Verabreichung ist ein Verfahren zur Abgabe von therapeutischen Agenzien an das zentrale Nervensystem (ZNS). Es ist nicht-invasiv und erlaubt große Moleküle, die nicht über die Blut-Hirn-Schranke den Zugang zu den ZNS. Medikamente werden direkt an das ZNS mit intranasale Abgabe gezielte Verringerung der systemischen Exposition und somit unerwünschten systemischen Nebenwirkungen ^ein. Lieferung aus der Nase an das ZNS tritt innerhalb weniger Minuten sowohl entlang der olfaktorischen und trigeminalen Nervenbahnen über eine extrazelluläre Route und erfordert keine Drogen zu jeder Rezeptor oder axonalen Transport ² binden. Intranasale Verabreichung ist ein weithin publizierten Methode und wird derzeit in klinischen Studien am Menschen ³ verwendet.

Intranasale Verabreichung von Medikamenten im Tiermodell ermöglicht Erstbewertung der pharmakokinetischen Verteilung und Wirksamkeit. Mit Mäusen, ist es möglich, Medikamente zu erwachen (nicht narkotisierten) Tieren verabreichen regelmäßig unter Verwendung eines speciasiert intranasale Griff. Awake Lieferung ist vorteilhaft, weil es für die langfristige chronische Dosierung ohne Betäubung erlaubt, es weniger Zeit in Anspruch nimmt als bei Anästhesie und kann gelernt und von vielen Menschen durchgeführt werden, so dass die Teams von Technikern dosieren kann eine große Anzahl von Mäusen in kurzen Zeiträumen. Wirksamkeit von Therapeutika intranasal in dieser Weise an Mäuse verabreicht wurde in einer Reihe von Studien einschließlich Insulin bei Diabetes-Mausmodellen ^4-6 und Deferoxamin bei Alzheimer-Maus-Modellen nachgewiesen. ^7,8

Die intranasale Grip für Mäuse kann gelernt werden, aber ist nicht einfach und erfordert Übung, Geschick und eine präzise Griff effektiv zu liefern Drogen auf das Gehirn und vermeiden Drainage in die Lunge und Magen. Mäuse werden von Hand mit einem modifizierten scruff im nicht-dominanten Hand mit dem Hals gehalten parallel zum Boden, während Arzneimittel mit einem Pipettor mit der dominanten Hand geliefert wird zurückgehalten. Es dauert in der Regel 3-4 Wochen akklimatisieren, um Handhabung vor Mäusenkann mit diesem Griff ohne Stress-Reaktion statt. Wir haben dieses JoVE Video vorbereitet, um diese intranasale Verabreichung Technik mehr zugänglich.

Protokoll

Ein. Gewöhnung an die Handhabung für intranasaler Gabe zu Awake Mäuse

Einführung

Mäuse müssen, um die Handhabung während eines Zeitraums von zwei vier Wochen vor dem Beginn der intranasaler Gabe akklimatisiert werden. Gewöhnung an die Behandlung ist wichtig, da es hilft eine korrekte Körperhaltung für maximale Wirksamkeit wach intranasale Drug Delivery. Zusätzlich können Mäuse, die nicht ordnungsgemäß zu diesem Prozess gewöhnt haben eine schwere Angstzustände Reaktion nach der Dosierung. Mäuse sollten etwa 2-3 Tage auf jedem von neun Schritten, bevor der in die nächste Stufe auszugeben, abhängig von dem Tier, um die Handhabung Komfort. Die Maus Stress als Gradmesser des Fortschritts verwendet werden. Dies bedeutet, die Überwachung der Maus die Bewegungen, die Menge / Harndrang, Stuhlgang, Zittern, und Beißen. Wenn eine Maus hat eine hohe Stress-Reaktion, auf die Stufe bleiben, bevor in die nächste, bis die Antwort wird reduziert. Ein Beispiel Akklimatisierung schedule können in Tabelle 1 gesehen werden. Akklimatisierung der Mäuse sollte durch die folgenden einmal-a-day Schritte voran. Die Durchführung dieser Schritte mehr als einmal pro Tag, in einem Versuch, die Akklimatisierung zu beschleunigen, wird nicht empfohlen.

Platzieren Sie die Maus in der Handfläche der Hand für einen Zeitraum von zwei bis drei Minuten, nicht mehr als einen Fuß vor den Käfig oben, wie die Tiere häufig während dieser einleitenden Schritt springen. Wenn die Maus versucht zu krabbeln aus der Hand und bis ein Arm, heben Sie einfach die Maus von der Basis des Schwanzes und setzen Sie ihn wieder in der Hand.
Platzieren Sie die Maus in der Handfläche der Hand für drei Minuten und streicheln das Tier sanft. Haustier der Maus gerichtet vom Kopf bis zum Schwanz, während gleichzeitig das Tier frei bewegen.
Platzieren Sie die Maus in der Handfläche der Hand für drei Minuten lang massiert hinter den Ohren (leicht kneifen zusammen die Haut auf der Rückseite des Halses mit dem Daumen und Zeigefinger).
Halten / lift die Maus durch das Genick des Halses für 30 sec, lassen die Maus ruhen auf dem oberen Käfig für 30 Sek. vor der Wiederholung des Laderaumes erneut.
Halten Sie die Maus über die intranasale Griff, die in Abschnitt 2 beschrieben, aber nicht invertieren das Tier (komplett bis zu 2,4 Schritt). Halten des Tieres, wie dies für eine Dauer von 30 Sek. und freizugeben zurück zur Oberseite des Käfigs. Wiederholen Sie ein zweites Mal nach einer Minute Ruhezeit.
Halten Sie die Maus mit der intranasalen Griff wie in Abschnitt 2 beschrieben, einschließlich Umdrehen des Tieres so seine Bauchseite nach oben in Richtung Decke. Stellen Sie sicher, dass das Tier den Hals parallel zum Boden ist. Halten Sie diese Position für 30 Sekunden. Wiederholen Sie diesen Vorgang ein zweites Mal nach einer Minute Ruhezeit. Einige Mäuse widerstehen intranasale Grip mehr als andere, vor allem, wenn zum ersten Mal mit einer Inversion bei diesem Schritt in der Akklimatisierung verwendet. Wenn die Maus befreit sich aus dem Griff, legen Sie die Maus wieder auf den Käfig oben und re-Griff. Wiederholen Sie die re-grip, wenn nötig, Sondern überwachen den Stress der Maus aus und senden es an den Käfig, wenn nötig. Ein weiterer Faktor, der eine Rolle in dem Verlust der Haftung an dieser Stelle in der Akklimatisierung Prozess spielen können, ist Unerfahrenheit der Tierpfleger mit dem intranasale Verabreichung Technik.
Halten Sie die Maus mit der intranasalen Griff, invertieren, kurz legen Sie eine Pipette mit einem leeren Spitze über jedes Nasenloch, und halten Sie die Tiere Position für 30 Sekunden. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach einer ein-minütige Pause.
Halten Sie die Maus mit der intranasalen Griff, invertieren, und intranasal administrieren 6 ul Kochsalzlösung in den linken und rechten nare, wie in Abschnitt 3 (bis Schritt 3,7) beschrieben.
Halten Sie die Maus mit der intranasalen Griff, invertieren, und intranasal administrieren 6 ul Kochsalzlösung in den linken und rechten nare zweimal indem das Tier wieder auf den Käfig oben dazwischen, wie in Kapitel 3 beschrieben.

2. Die intranasale Grip zu Awake Mäuse Unbeweglichkeitseffekt

Platzieren Sie die Maus on der Käfig oben.
Mit dem Daumen und Zeigefinger der dominanten Hand, halten Sie die Maus durch den Schwanz. Verwenden Sie Ihre Mittelfinger, Ringfinger und kleinen Finger Finger, leicht Pin den unteren Teil des Körpers, um den Käfig nach oben (Abbildung 1A). Lassen Sie die Maus auf die Stangen zu greifen, wie Sie strecken leicht die Maus aus und besser greifen die scruff.
Mit dem Daumen und Mittelfinger auf dem nicht-dominanten Hand, kneifen Sie die Maus fest im Genick (überschüssige Haut) hinter dem Nacken und Schultern. Ziehen Sie die lose Haut, um ein Zelt der Haut über den Schulterblättern (Abbildung 1B) zu machen. Nehmen Sie so viel Haut wie möglich, aber seien Sie vorsichtig, nicht zu ziehen up Muskel als dieses Unbehagen an der Maus führt. Vorsicht, um nicht zu viel Druck auf das Tier Brustkorb und Wirbelsäule. Übermäßiger Druck oder Ziehen der Haut kann zu einer Hemmung der Atmung in einigen Fällen führen.
Schnell stellen Sie den Zeigefinger der nicht-dominanten Hand auf der Maus den Kopf, alsin der Nähe der Nase, wie möglich und ziehen Sie die Haut (1C, 1D). Gleichzeitig schieben den Daumen und Mittelfinger in Richtung des Kopfes zur optimalen Position. Idealerweise sollte die Maus nicht in der Lage, den Kopf vertikal oder horizontal zu bewegen.
Unter Beibehaltung der Halt auf dem Genick, drehen Sie die Maus auf den Rücken. Die Maus Rücken sollte in der Handfläche von Ihrer Hand. Halten Sie das Mäuseschwanz (in der Nähe des Sockels) gegen Ihre Handfläche mit Ihrem letzten zwei Fingern (Ring-und kleinen Finger), um die Maus zu stabilisieren, oder Sie können Ihre Finger über die untere Körperhälfte (1E, 1F) wickeln.
An diesem Punkt stellen Sie sicher, dass die Maus den Hals und Kinn flach und parallel zum Boden sind. Das Kinn sollte nahe bei einem 180 °-Winkel mit dem Hals so weit wie möglich mit intranasale Abgabe zu unterstützen. Leichte Veränderungen in Winkel kann das Medikament bis zum Ende in der falschen Stelle. Achten Sie darauf, die Maus ist in der Lage, durch die Beobachtung der Bauch atmen. Die Maus should nicht in der Lage sich zu bewegen, aber sollte bequem sein und keine Schmerzen. Wenn Sie die Maus um den Hals und Kinn, einen "V" zu sehen, dann müssen Sie re-Griff.

3. Intranasale Verabreichung von Drogen an Awake Mäuse

Einführung

Verwendung der intranasalen Griff, wird jede Maus zweimal gehalten und zurückgehalten mit ihrem Hals parallel zu dem Boden, während ein Volumen von 20 bis 30 ul Flüssigkeit verabreicht wird. Dieses Volumen ist sicher und wirksam für kleine-große Mäuse, wir verwenden in der Regel 24 ul, und das ist in diesem Protokoll beschrieben. Die wach intranasale Methode kann bei Mäusen jeden Alters benutzt werden, zum Beispiel in neugeborene Mäuse für Entwicklungsbiologie neurowissenschaftlichen Forschung. Bei neugeborenen Mäusen, sollte ein kleineres Gesamtvolumen (8 ul) und Tröpfchengröße (1 ul) verwendet, um die kleineren Volumen der Nasenhöhle unterzubringen. Drug wird in der Regel zwei Mäuse in einer Zeit geliefert, abwechselnd Ruhezeiten, um die effizienteste Nutzung der Zeit machen und zu halten on Zeitplan. Set-up wird ein wenig anders, je nachdem ob Sie Dosierungsgruppe untergebracht Mäusen oder einzeln untergebracht Mäusen sein. Mit den einzeln untergebracht Mäuse, ist es hilfreich, alle Ihre Materialien zwischen den Käfigen, Mäuse vor der Kreuzung auf die andere Käfig oben zu verhindern platzieren. Mit der Gruppe gehaltenen Mäusen, die Dosis von diesem Käfig nur. Es ist wichtig, dass jede Maus in einer Gruppe-Käfig untergebracht dieselbe intranasale Behandlung erhält, als Potenzial für eine Kreuzkontamination von zwei unterschiedlichen Behandlungen besteht aufgrund Medikament Austreibevorrichtung in die Luft oder mit Hautkontakt. Es wird dringend empfohlen, dass eine Dosierung Blatt im Voraus gedruckt werden, um Technikern der Behandlung Aufgaben zu erinnern, keine Noten verpasst Tropfen aufzunehmen, um die allgemeine Gesundheit eines jeden Tieres, etc. beachten

Treppe

Richten Sie Käfigen, in denen sie für die Dosierung sein, und sollte ein Dosierstation (Abbildung 2).
Entfernen Sie mit der Maus aus dem Käfig und halten auf Käfig oben während der Dosierung.
Pick-up mit der Maus über die intranasale Griff in Abschnitt 2 beschrieben.
Mit Ihrer dominanten Hand, laden Sie die Pipette mit 6 ul von Drogen-oder Fahrzeug. Setzen Sie die Spitze des gefüllten Pipette in der Nähe der Maus linke Nasenloch, in der Regel in einem 45-Grad-Winkel (Abb. 1G, 1H). Wenn Sie eine viskose Lösung zu haben, müssen Sie möglicherweise Ihren Winkel bis 90 Grad zu erhöhen, weil das Medikament laufen an der Seite der Pipettenspitze anstatt einen Rückgang. Wenn sehr viskos ist, kann das Abwischen der Pipettenspitze mit einem Taschentuch vor dem Ausstoßen von Flüssigkeit zu helfen. Langsam wirft die Droge ein kleines Tröpfchen mit etwa der Hälfte des Volumens (3 ul) zu bilden.
Der Tropfen sollte so nah an der Maus das Nasenloch werden, so dass die Maus das Tröpfchen einatmen kann. Unmittelbar nachdem die Maus diesen kleinen Tropfen inhaliert, werfen den Rest der Droge in der Pipettenspitze ein weiteres kleines Tröpfchen für die Maus zu bilden durch das gleiche Nasenloch ca. 2-3 sec später inhalieren. Achten Sie darauf, den Mund zu schauen. Wenn es is jede Flüssigkeit im Mund, hat der Tropfen nicht ganz in die Nase und dies sollte vermerkt werden.
Halten Sie die Maustaste in dieser Position für 15 Sekunden. Es wird dringend empfohlen, dass ein Timer verwendet, um dieses 15 sec hold standardisieren.
Wiederholen Sie die Schritte von 3,3 bis 3,6 für das rechte Nasenloch. Wenn irgendwelche Tropfen geschnupft werden sollte, dass Drop ersetzt und beachtet werden.
Platzieren Sie die Maus wieder an der Spitze seines Käfigs für 2 min. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang ab 2 min. nach Lieferung der ersten Tropfen. Dies gibt die Maus vier Tropfen 6 ul jeder insgesamt 24 ul Lösung. Eine Probe Zeitplan zum Dosieren einer oder zwei Mäuse auf einmal in Tabelle 2 ersichtlich.
Nachdem die Maus alle Tropfen erhalten hat, zurück mit der Maus in seinen Käfig.

4. Allgemeine Tier Handhabung Techniken zur Akklimatisierung und intranasale Verabreichung von Drogen an Awake Mäuse

Nach jedem Akklimatisierung oder intranasale Verabreichung Sitzung sollte Mäusen werden gebenna behandeln, wie eine Cheerio oder geschält Sonnenblumensaat als positive Verstärkung. Leckereien als Belohnung und sie vor Kratzern ihre Nasen abzulenken, was möglicherweise zu Verletzungen selbst gegeben. Bei der Arbeit mit Gruppen gehalten werden Mäuse, sollte genug Leckereien für jede Maus abgelegt werden. Vor der Rückkehr Tiere in ihre Käfige sicher sein, Nester in ihre ursprünglichen Zustände wiederherstellen, um den Stress zu reduzieren. Bei der Dosierung von Gruppen gehalten Tieren müssen Handschuhe zwischen Dosierung von Käfigen, um nicht Duft von Käfig zu Käfig Kolonie Kolonie übertragen, wie sie sein wird gegeneinander aggressive geändert werden.