Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

Zusammenfassung

Eine einfache Methode zur Ableitung und pflegen Spermatogonien Stamm-und Vorläuferzellen Zelllinien aus erwachsenen Mäusen wird hier vorgestellt. Das Verfahren nutzt Feeder-Zellen, die aus dem somatischen Zellkompartiment der adulten Maus Hoden. Diese Technik ist für die gemeinsame Mausstämmen, auch transgenen Knock-out und Knock-in Mäusen.

Zusammenfassung

Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) der Hoden sind ein klassisches Beispiel für adulten Stammzellen und die Erhaltung der Fruchtbarkeit für fast die gesamte Lebensdauer des Tieres. Während die genauen Mechanismen, die Selbsterneuerung und Differenzierung in vivo zu regeln Studie sind anspruchsvoll, wurden verschiedene Systeme zuvor murinen SSCs in vitro unter Verwendung einer Kombination von speziellen Kulturmedien und Feeder-Zellen ^1-3 Propagation entwickelt.

Die meisten in vitro Streifzüge in die Biologie der SSCs haben Zelllinien von Neugeborenen, möglicherweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung Erwachsenen Zelllinien ⁴ abgeleitet. Jedoch weiterhin die Hoden zu reifen bis ~ 5 Wochen alt in den meisten Mausstämmen. In den frühen postnatalen Phase treten dramatischen Veränderungen in der Architektur der Hoden und in der Biologie der sowohl somatische und spermatogenen Zellen, einschließlich Änderungen in Expression von zahlreichen Stammzellen-bezogeneGene. Daher kann abgeleitet SSC neonatal-Linien nicht vollständig rekapitulieren die Biologie von erwachsenen SSCs, die nach der erwachsenen Testis einen stationären Zustand erreicht hat persistieren.

Mehrere Faktoren haben die Produktion von Erwachsenen SSC Linien behindert historisch. Erstens kann der Anteil an funktionellen Stammzellen im Erwachsenenalter verringern, entweder durch intrinsische oder extrinsische Faktoren ^5,6. Weiterhin, wie bei anderen adulten Stammzellen, ist es schwierig gewesen, um ausreichend SSCs bereichern aus Gesamt erwachsenen Hodenzellen ohne Verwendung einer Kombination von Immunselektion oder andere Sortier Strategien ^7. Üblicherweise eingesetzten Strategien zählen die Verwendung von Mäusen kryptorchiden als Quelle von Donorzellen aufgrund einer höheren Verhältnis von Stammzellen zu anderen Zelltypen ^8. Basierend auf der Hypothese, dass die Entfernung von somatischen Zellen aus der Vorkultur Interaktionen mit der Stammzell-Nische, die für SSC Überleben stört, haben wir bisher entwickelten Methoden zur Ableitung von Erwachsenen lines die keine Immunselektion und kryptorchiden Spendern einzusetzen sondern seriellen Anreicherung von SSC in Kultur, nachfolgend als ^2,3 SESC.

Das nachfolgend beschriebene Verfahren führt zu einer einfachen Prozedur zum Ableiten erwachsenen SSC Linien durch Dissoziieren erwachsenen Spenders Samenleiter, durch Plattieren von Zellen auf einer Feeder testikulären stromalen Zelllinie (JK1) ³ umfasst gefolgt. Durch serielle Passagierung, stark haftenden, nicht-verunreinigenden Keimzellen aus der Kultur bei gleichzeitiger Anreicherung von SSCs abgereichert. Kulturen auf diese Weise hergestellte enthalten eine Mischung aus Spermatogonien in verschiedenen Stadien der Differenzierung, welche enthalten SSC, über langfristige Selbsterneuerung Fähigkeit auswählt. Der Kern des SESC Methode ist, dass SSCs ermöglicht, den schwierigen Übergang von der Selbst-Erneuerung in vivo-bis langfristigen Selbsterneuerung in vitro in einer radikal anderen Mikroumgebung zu machen, produziert langfristige SSC Linien, frei von verunreinigendensomatischen Zellen und ermöglicht dadurch anschließenden experimentellen Manipulation von SSCs.

Protokoll

Ein. Vorbereitung der Feeder-Zellen

Beachten Sie, dass alle Reagenzien im Folgenden beschriebenen steril vorbereitet werden (siehe Tabellen 1 und 2). Dieses Protokoll nutzt die JK1 Zelllinie (Cell Biolabs, Inc., Katalog # CBA-315) als Zubringer, die eine transformierte Derivat des erwachsenen Maus Hoden somatischen Zellen ist und wurde an anderer Stelle ³ beschrieben. Beachten Sie auch, dass alle Tierversuche im Einklang mit den institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden.

1. JK1 Zellen in Kultur gehalten werden und erfolgreich als Zubringer aufgebraucht, um den Durchgang 39. Kultur JK1 Zellen in einer 100 mm Zellkulturschale (BD Falcon, Katalog # 353.003) mit 10 ml steril filtriert Feeder Wachstumsmedium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin und Antibiotika). Wenn die Kultur 95% Konfluenz erreicht, spaltete sich die Zellen 1.06 -1:10 Verhältnis.
2. Entfernen Medium von konfluenten JK1 Feederzellschicht monoSchicht.
3. Waschen Zellschicht einmal mit PBS ohne Calcium und Magnesium.
4. Hinzufügen vorgewärmten Trypsin / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, Katalog Nr. 25-051-CI), und Inkubieren bei 37 ° C für 5-10 min.
5. Inaktivieren Trypsin mit einem gleichen Volumen von Feeder Wachstumsmedium. Sammle Zellen und zentrifugieren bei 300 xg für 5 min. Resuspendieren Zellen in Feeder Wachstumsmedium.
6. Pre-coat Multi-Well-Zellkultur-Platten, indem genug 0,4% Gelatinelösung zur Deckung der gut und entfernen Sie nach 5 min bei Raumtemperatur.
7. Platte ~ 250 Zellen pro mm ² in Gelatine-beschichteten Zellkulturplatte (z. B. 48-Well-oder 6-Well-Format). Inkubieren bei 37 ° C für 16 bis 24 Stunden.
8. Entfernen Kulturmedium aus Brunnen. ACHTUNG: Um das Zellwachstum zu inaktivieren, fügen Sie eine frische Lösung von Mitomycin-C mit 10 ug / ml in DMEM verdünnt, um jede Vertiefung (zB 200 ul / Vertiefung für eine 48-Well-Platte). Mitomycin-C toxisch ist. Behandeln und entsorgen Sie es mit Sorgfalt. Inkubation bei37 ° C für 4 Stunden.
9. Entfernen Mitomycin-C-Lösung von Zellen. 3 x waschen mit DMEM vor dem Beschichten Stammzellen.
10. Entfernen DMEM von Feeder-Zellen Brunnen und fügen Sie genug Stammzellen Medium (100 &mgr; l / Well einer 48-Well-Platte, siehe Tabelle 3), um ein Austrocknen der Anleger während der Passage zu verhindern. Fügen SSCs am selben Tag, wie unten in den Abschnitten 3.1 bzw. 3.4 beschrieben, mit angegebenen Größen von Brunnen mit Feeder.

2. Dissoziation von Maus Hodengewebe Erhalten Donor Germ Cells

1. Ernte erwachsenen Maus Hoden in sterile Mode und vorübergehend die Hoden in einem überdachten Petrischale (ohne Flüssigkeit hinzugefügt). Das Gericht muss sofort auf Eis gestellt Austrocknung zu verhindern und zu pflegen Lebensfähigkeit der Zellen.
2. Mit einer sterilen feinen Pinzette und eine feine Schere in einer Zellkultur Kapuze, einen Querinzision in der Tunica albuginea, ohne sie komplett Durchtrennung der Hoden (dh Schnitt ~ ½ - ¾ Abstand through) und verwenden Pinzette zu verdrängen Samenkanälchen in eine Ecke der Platte; discard Tunica und die angeschlossenen Gewebe. Halten Platte auf Eis überall zu halten Gewebe gekühlt und somit die Erhaltung seiner Integrität und verhindert Verdunstung.
3. Schnell Hackfleisch Tubuli mit feiner Feder Schere mindestens 3 min pro Hoden, während Platte auf Eis.
4. Sammeln die Tubulus-Fragmente in einem 50 ml konischen Röhrchen und waschen in ~ 40 ml gekühltem PBS / 1% Rinderserumalbumin.
5. Zentrifugieren bei 60 × g für 10 min, um Fragmente aus Tubulus Spermatozoen und Schutt zu trennen. Überstand verwerfen.
6. In einem 15 ml konischen Röhrchen, das Pellet in 3 ml pro Testis vorgewärmtes Dissoziationspuffers (DMEM, 0,05% Trypsin, 0,03% Collagenase Typ I, 80 U / ml DNAse I und 0,5% Rinderserumalbumin; Siehe Tabelle 2 für mehr spezifische Details Dissoziationspuffer).
7. Platzieren Sie die konischen Rohr horizontal in einem Gestell in einem Schüttler bis 150 Upm bei 37 ° C für 15 min, um eine Maximierunggitation.
8. Spin-Down bei 60 xg für 10 min zu trennen einzelner Zellen aus undissoziierten Brocken.
9. Speichern Sie die Pellets, welche Brocken bis zum nächsten Schritt. Collect Überstand aus Schritt 2.8 und 3 ml DMEM/10% fötalem Rinderserum, um Dissoziationspuffers neutralisieren. Zeigen Röhrchen auf Eis vorübergehend.
10. Wiederholen Sie Schritt 2,6 bis 2,7 mit dem gespeicherten Pellet aus Schritt 2,9 bis wieder Digest Stücke, die nach Schritt 2,8.
11. Hinzufügen eines gleichen Volumens von DMEM/10% FBS zu Dissoziationspuffers neutralisieren.
12. Rekombinieren Suspension aus Schritt 2,11 mit gespeicherten Zellsuspension aus Schritt 2.9. Zentrifuge 5 min bei 300 x g beträgt.
13. Pellet in Stammzellen Medium in einem Volumen von 16 ml pro Paar Hoden (siehe Tabelle 3).

3. Beschichtung von Hodenkrebs Zellsuspension

1. Plate 2 ml Zellsuspension pro Well in einer 6-Well-Platte mit Feeder-Zellen mit Mitomycin-C und in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 & mitotisch-inaktiviertdeg, C in 5% CO _2.
2. Nach 48 Stunden absaugen medium, 2 ml frisches Medium und zum Inkubator.
3. Nach 48 Stunden, 0,5 ml frische Stammzellen Medium in jede Vertiefung und zum Inkubator.
4. Nach 48 Stunden, anschließend füttern Zellen dreimal pro Woche danach wie folgt bis große, diskrete Kolonien (> 50 Zellen) erscheinen (innerhalb von 7 bis 21 Tage). Für die erste und zweite Fütterung pro Woche (zB Montag und Mittwoch) zu entfernen ~ 50% der mittleren und wieder hinzufügen 50% Vol. frisches Medium. Für das dritte Fütterung (z. B. Freitag), absaugen alle mittel-und ersetzen mit 2 ml frisches Medium. Dieser Ansatz basiert auf der Überlegung, dass die Vermeidung von Vollmedium Veränderungen Schwankungen in Konzentrationen von parakrine Signale, die in das Kulturmedium sezerniert werden minimiert ⁹ basiert.

4. Colony Picking für First Passage

1. Entfernen Medium aus Vertiefungen mit Kolonien passagiert werden und frisches Stammzellen Medium.
2. Identifizieren Kolonien mit einem 10x-Ziel. Mit dem Mikroskop leicht defokussiert werden SSC Kolonien am Rand des auch homogen hellen Klumpen, vieler 11-12 Mikrometer Durchmesser Zellen, in denen es schwierig oder unmöglich, die einzelnen Zellrahmen bestehen erkennen erscheinen, da die Zellen gemeinsam auftreten (Abbildung 1A) fusioniert. Non-SSC Kolonien erscheinen dunkler, körnige oder weniger homogenen, mit erkennbaren Grenzen (1A, Einschub).
3. Mit einer 200 ul Pipettenspitze mit dem pipetteman auf 50 ul, erster nehmen Medium aus der gut und zu vertreiben, um die Spitze zu benetzen. Dann vorsichtig anzustossen die Kolonie mit der Spitze, bevor sich rasch Rückzug 50 ul Medium, um die Kolonie durch Ansaugen in der Spitze (Abbildung 1B) zu vertreiben.
4. Auszustoßen das Medium, das die Kolonie in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte, enthaltend inaktivierte feeder-Zellen mit 100 ul Medium Stammzelle (Abbildung 1C).
5. Wiederholen Sie Schritt4,3 und bis zu 8 Kolonien auf die gleiche auch ohne Überschreitung 500 ul pro Vertiefung.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4,3 bis 4,5 zusätzliche Vertiefungen der 48-Well-Platte mit Durchgang eins SSC Kolonien vorzubereiten.
7. Wells wird bereit sein, aufgeteilt in 7-14 Tagen oder nach großen Klumpen von bis zu 500 Zellen entstanden (Abbildung 1D).

5. Nachfolgende Expansion und Passagieren von SSCs durch Trituration

1. Zellen bei Passage sollte man auf frische Anleger nach bis zu 14 Tagen bei einer Split-Verhältnis von 1:2 für den ersten 3 Passagen und dann 1.04 subkultiviert, um 1:6 (alle 7 Tage) danach wie folgt. Sanft verreiben Kolonien von einer semi-konfluenten Vertiefung (zB ~ 300.000 SSC / Vertiefung von 6-Well-Platte) mit einer 1 ml Pipette durch Waschen Medium über den Zellen. Kolonien erkennbar Ablösen werden. Zu viel Kraft mit dem Strom der Flüssigkeit bewirkt unerwünschte Feederzellen kommen auch ab.
2. Sammle triturated Zellen in einem konischen Rohr und Zentrifuge bei 300 xg5 min. Hinweis: Ein Trypsinierung Schritt kann sicher hier hinzugefügt werden, wenn durch den Prüfarzt gewünscht.
3. Überstand entfernen und in frischen Stammzellen Medium resuspendieren durch gründliches und Abpipettieren Kolonien stören.
4. Platte SSCs auf frisch präparierten Feeder-Zellen mit Mitomycin-C inaktiviert, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
5. Führen Zellen dreimal pro Woche wie folgt. Für die erste und zweite Fütterung (z. B. Montag und Mittwoch) werden 50% der frischen Medium. Für das dritte Fütterung (z. B. Freitag), absaugen alle mittel-und ersetzen mit 2 ml frisches Medium. Platten werden konfluente in 7-10 Tagen. Kulturen sollte von> 98% Keimzellen (dh <1% kontaminierenden somatische Zellen) nach 5-7 Passagen auf Immunfärbung (zB unter Verwendung der murinen Keim Zellmarker GCNA) an Keimzellen aus somatischen Zellen ¹⁰ unterscheiden basierend bestehen. Hinweis: Diese Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Anforderungen, die von der Institution gesetzt entwickeltal Animal Care und Use Committee am Weill Cornell Medical College.

Ergebnisse

Das Aussehen der Passage Null Wildtyp wird Erwachsenen SSC Kolonien nach 7 Tagen in Abbildung 1 dargestellt. Dreidimensionale Kolonien werden aus einer Schicht aus flachen Zellen, die an die Speiser oder underling extrazellulären Matrix abgeschieden durch den Abzweigen mit mehreren Schichten von SSCs wachsenden oben besteht. Während gesunde SSCs hell und gleichmäßig refractile 11-12 Mikrometer Durchmesser sind, sind die Zellgrenzen schwierig zu unterscheiden, und die Größe der Kolonien kann sehr variabe...

Diskussion

Diese Methode zur Ableitung Erwachsenen SSCs mit adulten Hoden-derived Feeder-Zellen ist robust und gelungen, wenn gemeinsame genetische Herkunft (zB FVB, C57Bl6 und gemischte 129SV/C57Bl/6) und verschiedene Mutanten ^2,3,7,14 beschäftigt waren. In der Tat ist die Mikroumgebung von der Kultur-System angelegt ausreicht, um einige der genetischen Barrieren zur Aufrechterhaltung erwachsenen SSCs in vivo (zB im Falle von PLZF ^{- / -} Tieren) überwunden ^7. Während wir JK1 Zelle...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz / Material	Firma	Catalog Number	Kommentare
DMEM	Corning	10-013	Verdünnungsmittel für Dissoziationspuffer
Trypsin / EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stammzell-Basismedium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Benötigt Supplementierung nach Shinohara et al. (2003) *
Stammzell-Medium ergänzt	verschiedene	siehe Tabelle 3	Benötigt Supplementierung nach Shinohara et al. (2003) *
JK1 Zellen	Zelle Biolabs, Inc.	CBA-315	Kann mit adulten Hoden Stromazellen nach Seandel et al ersetzen. (2007)
Mitomycin-C (ACHTUNG)	Sigma-Aldrich	M4287	Giftig; Handle with care.
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890	0,4% ige Lösung in Wasser
EVOS xl digitalen inversen Mikroskop	Advanced Microscopy Gruppe	-
			Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung. * Siehe Tabelle 3
DMEM	Corning	10-013	Verdünnungsmittel für Dissoziationspuffer
Trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissoziationspuffer: Final 0,05% wt / vol
Kollagenase, Typ I, 235 U / ml	Worthington	CLS1 235	Dissoziationspuffer: Final 0,03% wt / vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissoziationspuffer: Final 80 U / ml
Rinderserumalbumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissoziationspuffers: Final 0,5% wt / vol
			Tabelle 2. Dissoziationspuffers
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nahrungsergänzung	Life Technologies	10639-011
Zusatzgebühren **
Nicht-essentielle Aminosäuren	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitaminlösung	Life Technologies	11120-052	1X
L-Glutamin	Mediatech	25-005	2 mM
Rinderserumalbumin	ICP Bio	ABRE	0,50%
Antibiotika-Antimykotika-Lösung	Mediatech	30-004-CI	1X
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg / ml
β-Östradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng / ml
Progesteron	Calbiochem	5341	60 ng / ml
fötales Rinderserum	Variable	n / a	1%
Rinder Holo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 pg / ml
Insulin	Gemini Bio-Produkte	700-112P	25 ug / ml
menschlichen GDNF	Leben Technologien	PHC7041	10 ng / ml
Human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng / ml
Maus-EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng / ml
Putrescin	Research Organics	0778P	60 uM
Natriumselenit	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
Brenztraubensäure	Alfa Aesar	A13875	30 ug / ml
DL-Milchsäure	JT Baker	0196-04	1 pg / ml
β-Mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 uM
Askorbinsäure	Sigma-Aldrich	A4544	100 uM
D-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ug / ml
			Tabelle 3. Stammzell-Medium
			* Hinweis: In Ergänzung unten, bevor Sie Mediums. Filtern sterilisieren und halten bei 4 ° C. Das Medium ist für mindestens 2 Wochen stabil.
			** Wir haben verschiedene Hersteller, Formulierungen und / oder Chargennummern dieser Reagenzien ohne offensichtliche schädliche Auswirkungen beschäftigt. Im Allgemeinen sollte die Zellkultur Reagenzien eingesetzt werden.