Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Summary

Eine Technik, die Verwendung hochauflösende intavital 2-Photonen-Mikroskopie direkt visualisieren und quantifizieren gloemrular Filtration in Oberfläche Glomeruli. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Bestimmung der Durchlässigkeit Eigenschaften von Makromolekülen in normalen und erkrankten Staaten.

Abstract

Nierenerkrankungen mit Urin Verlust großer wesentlichen Makromoleküle, wie zB Serumalbumin, sind seit langem vermutlich durch Veränderungen in der Permeabilitätsbarriere podocytes umfasst, vaskuläre Endothelzellen und einer Basalmembran zusammen arbeiten verursacht werden. Daten aus unserem Labor mittels intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie zeigte eine durchlässiger glomerulären Filtrationsrate Barriere (GFB) als bisher unter physiologischen Bedingungen haben, mit Abruf von gefilterten Albumin vorkommende in einem frühen Untergruppe von Zellen, die sogenannten proximalen Tubuluszellen (PTC) ^{1,2, 3.}

Zurück Techniken verwendet, um Nierenfiltration studieren und zur Gründung der Charakteristik der Filtration Barriere beteiligt micropuncture des Lumen dieser frühen Rohrsegmente mit der Probenahme und Analyse Fluidgehalt ^4. Diese Studien bestimmt Albumin-Konzentration in der luminalen Flüssigkeit praktisch nicht existent; entsprechend engzu dem, was in der Regel im Urin nachgewiesen. Allerdings ergab die Charakterisierung von Dextran Polymere mit definierter Größe durch diese Technik die von ähnlicher Größe wie Serumalbumin hatte höheren Ebenen in der röhrenförmigen Lumen und Urin, was darauf hindeutet, erhöhte Durchlässigkeit ^5.

Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Technik verwendet, um direkt zu visualisieren und quantifizieren glomerulären fluoreszierenden Albumindurchlässigkeit in vivo. Dieses Verfahren ermöglicht die Erkennung von gefilterten Albumin über den Filtrationsbarriere in Bowman-Raum (die erste Kammer des Urin-Filtration) und erlaubt auch die Quantifizierung von Albumin Reabsorption von proximalen Tubuli und Visualisierung der nachfolgenden Albumin Transzytose ^6. Das Fehlen von fluoreszierenden Albumin entlang später Rohrsegmente auf dem Weg zu der Blase wie die Effizienz des Abrufs Weg in den früheren proximalen Tubulus-Segmente. Darüber hinaus, um, wenn diese Technik angewendet wurde, bestimmen Permeabilitätvon Dextranen mit einer ähnlichen Größe wie Albumin praktisch identisch Permeabilitäten wurden ^{2 angegeben.} Diese Beobachtungen unterstützen direkt die Notwendigkeit, den Fokus vieler Nierenerkrankungen mit Proteinurie Krankheiten enthalten Änderungen in proximalen Tubulus Zelle Rückgewinnung erweitern.

Protocol

Ein. Konjugation von Rattenserumalbumin zu Sulfo-Rhodamin 101 Sulfonsäurechlorid (Texas Red)

1. Man löst 100 mg Rattenserumalbumin (RSA) in 6.667 ml von 100 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9,0; Endkonzentration 15 mg / ml in einem 50 ml konischen Röhrchen.
2. Platz Lösung in Eis / Wasser Becherglas und kühl, zwischen 0 bis 4 ° C.
3. In 200 ul hochwertigen wasserfreien Dimethylformamid (DMF) zu einer 10 mg-Ampulle von Texas Red Sulfonsäurechlorid (TRSC); Vortex auf Medium für 15 sek.
4. Vortex RSA Lösung auf mittlere und fügen Sie die gelösten TRSC.
5. Wrap 50 ml konischen in Folie (Parafilm kann verwendet werden, um eine gute Abdicht....

Results

Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines Bildes von einer Oberfläche eines Glomerulus München Wistar Frömter Ratte und welche Schritte unternommen wurden, um die Durchlässigkeit von fluoreszierenden Albumin bestimmen gemacht. Der GSC Wert für Albumin von 0,0111 für diese einzelnen Glomerulus fallen in den Bereich in dieser Sorte von München Wistar Ratten, wenn in der Fed Zustand ³ gesehen abgeleitet. Die Stabilität in diesen Bildern zu sehen ist auf die sorgfältige Planung und Ausführung von Befe.......

Discussion

Die Schritte hervorgehoben hier darstellen, was wir diejenigen, die eine konsistente und genaue Durchlässigkeit Werte erzeugen wird, weil sie die folgenden Fallstricke zu umgehen fühlen:

1. Streuung: Die Verwendung eines roten emittierende Fluorophore ermöglichen eine effizientere Sammlung von Leichtverpackungen seit längerer Wellenlänge Photonen weniger anfällig zu streuen sind. Mit entweder grün oder blau emittierende Fluorophore einführen größere Variation in der GSC wegen der erhöhten Variabilität der Inte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 Konfokal-/Multiphotonenmikroskop	Olympus America		Filter für Detektoren: Blau 430/100, Grün 525/50, Rot 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Abstimmbare Anregungswellenlängen: ~750-1150 nm
Galliumarsenid-Phosphid-Photodetektoren	Hamamatsu Corp		Hinweis: Front- oder Seitenmontagekonfigurationen verfügbar.
Metamorph Bildverarbeitungssoftware	Molekulardynamik		Hinweis: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corporation		2007 Version
Umgang mit Pinzetten	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	Kat# 78266-04
Mayo Präparierschere	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	Kat# 72962
CA Mikroschere Modell 1C300	Elektronenmikroskopie Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hämostatische Pinzette (gerade)	Elektronenmikroskopie Sciences	Cat# 72930
Wassermantel Decke + Heizkissen	Gaymar		T/Pumpe PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Untertankheizung	ZooMed		RH-4
Texas Rotes Sulfonylchlorid	Invitrogen / Molekulare Sonden	Cat# T-353
Rattenserumalbumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
Hochwertiges wasserfreies DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoklavenband	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-Schale Deckglas Bodenschalen (50 mm/40 mm Deckglas)	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	Cat# 70665-07