Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Zusammenfassung

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Wechselwirkungen verschiedener Proteine ​​mit DNA in Chromatin lebender Zellen. Beispiele umfassen sequenzspezifische DNA-bindende Transkriptionsfaktoren, Histone und ihre verschiedenen Modifikationen Zustände, Enzyme, wie RNA-Polymerasen und zugehörige Faktoren und DNA-Reparatur-Komponenten. Trotz seiner Allgegenwart, gibt es einen Mangel an up-to-date, detaillierte Methoden sowohl für Bank Vorbereitung des Materials und für die genaue Analyse ermöglicht quantitative Metriken der Interaktion. Durch diesen Mangel an Informationen, und auch, weil, wie jeder Immunpräzipitation Bedingungen müssen für neue Sätze von experimentellen Bedingungen neu optimiert werden kann, ist der Chip-Assay anfällig für fehlerhafte oder schlecht quantitative Ergebnisse.

Unser Protokoll wird schließlich vom bahnbrechenden Arbeiten auf Transkriptionsfaktor abgeleitet: DNA-Wechselwirkungen ^1,2, sondern beinhaltet eine Reihe von Verbesserungen an Sensibilisierungvity und Reproduzierbarkeit für schwer zu erhalten Zelltypen. Das Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, ^3,4, beide unter Verwendung von DNA-qPCR Bereicherung quantifizieren, oder mit Hilfe eines semi-quantitative Variante des unter Protokoll.

Diese quantitative Analyse der PCR-amplifizierten Materials rechnerisch durchgeführt und stellt einen begrenzenden Faktor in dem Assay. Wichtige Kontrollen und andere Überlegungen schließen die Verwendung eines Isotyp-Antikörper, sowie Auswertung einer Kontrolle Region von genomischer DNA, wie ein Zwischengenregion vorhergesagt nicht durch das Protein unter Studie (oder erwartet gebunden werden keine Änderungen unter zeigen die experimentellen Bedingungen). Darüber hinaus wird eine Standardkurve von Vormaterial für jeden Span Probe zur Ableitung absoluten Werte der Anreicherung im experimentellen Material. Verwendung von Standard-Kurven hilft zur Berücksichtigung von Unterschieden zwischen Primer-Sets nehmen, unabhängig davon, wie vorsichtig sie sind entworfen, und auch Effizienz unterscheidenschiede über den Bereich der Template-Konzentrationen für eine Primer-Set. Unser Protokoll ist anders als die anderen, die verfügbar sind ^5-8 in die wir ausgiebig decken die später Analysephase.

Protokoll

1. Isolation von Maus Milz Naive CD4 T-Zellen

1. Aufopferung der Maus auf humane Weise im Einklang mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Protokolle. Präparieren Sie die Milz und legen Sie es in Petrischale mit 10 ml DMEM mit 10% FBS.
2. Crush die Milz mit mattierten Enden von zwei Glasplatten, die Splenozyten freizugeben. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen.
3. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg (~ 1.200 UpM einer klinischen Zentrifuge mit einer typischen Rotordurchmesser) für 5 min bei 4 ° C.
4. Die Zellen in 2 ml ACK-Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen, 1 min bei Raumtem....

Ergebnisse

Das Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)-Protokoll hier vorgestellten Steuerungen für Unterschiede, wenn überhaupt, in der Höhe von DNA in der PCR durch die Verwendung eines Primer-Paar, das ein ungebundenes Region Genom verstärkt eingesetzt und dienen somit als "Ladekontrolle". In dem Beispiel in 3 gezeigt ist, haben wir die kodierende Region des Maus istB Gen als eine Region in unseren ungebundenes Protein von Interesse und des Transkriptionsfaktors NFAT Bindungsstelle auf Maus .......

Diskussion

Das Protokoll über eine robuste Methode zur Quantifizierung von DNA genau Anreicherung von primären Lymphozyten mit ChIP. Ein wichtiger Grund für Robustheit in diesem Protokoll ist die Aufnahme der biologischen Replikate. Die obige Protokoll verwendet drei Wiederholungen, die Anreicherung, für die unabhängig berechnet. Die Ausgänge werden dann gemittelt, um einen Grad der Anreicherung und Standardabweichungen berechnet, um ein Maß der Variabilität bereitzustellen. Für jede Probe repliziert drei technischen auch durchgef.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Formaldehyd	Sigma	F-8775	Bei RT lagern
Phosphatgepuffertes	Kochsalz-Hyklon	SH30256.01	Bei 4 & Grad lagern; C
Proteasehemmer Tabletten	Roche	04693116001	Bei 4 > C
Protein G magnetische Kügelchen	Active Motif	101945	Bei 4 & Grad lagern; C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Bei -20 & deg lagern; C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Lösen in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8,0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Bei -20 &de; C
SYBR Grün I	Invitrogen	S7567	Bei -20 & Grad lagern; C
1 M Glycin			Bei RT Zelllysepuffer lagern
(5 mM Pipes, pH 8,0; 85 mM KCl; 0,5 % NP-40)			Bei 4 & Grad lagern; C
Puffer für die Kernlyse (50 mM Tris, pH 8,1; 10 mM EDTA; 1 % SDS)			RT
ChIP-Verdünnungspuffer lagern (0,01 % SDS; 1,1 % Triton X-100; 1,2 mM EDTA; 16,7 mM Tris pH 8,1; 190 mM NaCl)			Bei 4 μg lagern; C
Salzarmer Waschpuffer (0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 150 mM NaCl)			Bei 4 μg lagern; C
Waschpuffer mit hohem Salzgehalt (0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 600 mM NaCl)			Bei 4 μg lagern; C
LiCl Waschpuffer (0,25 M LiCl; 1 % NP-40; 1 % Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8,0)			Bei 4 μg lagern; C
TE Puffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA)			Lagerung bei 4 &Grad; C
Elutionspuffer (1% SDS; 0,1 M NaHCO3)			Frisch zubereiten
5 M NaCl			RT
lagern 0,5 M EDTA			RT
lagern 1 M Tris-HCl, pH 6,5			RT
Tabelle der spezifischen Reagenzien
Tonerde Adams Marke Nutator	Becton Dickinson	Modell: 421105
Magnetständer	Promega	Z5342
Qiaquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Modell: S3000
UV-Spektralphotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heizblock	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Gekühlte Tischzentrifuge	Beckman Coulter	Modell: Allegra X-12R
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5415 D
Tabelle der Ausrüstung

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