Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen, gefolgt In situ Hybridisierung entweder lose Poly (A) mRNA oder spezifischen Transkripte zu erfassen.

Abstract

In Eukaryoten meisten der messenger RNA (mRNA), die sezernierte und Membranproteinen an die Oberfläche des endoplasmatischen Reticulums (ER) lokalisiert codieren. Jedoch kann die Visualisierung dieser mRNAs Herausforderung sein. Dies gilt insbesondere, wenn nur ein Bruchteil der mRNA ist ER-assoziierte und deren Verteilung zu dieser Organelle durch nicht anvisierten (dh "frei") Transkripte behindert. Um ER-assoziierten mRNAs überwachen, haben wir ein Verfahren, bei dem Zellen mit einer kurzen Belichtungszeit eine Digitonin Extraktionslösung, die selektiv permeabilisiert die Plasmamembran behandelt werden entwickelt und entfernt somit die zytoplasmatischen Inhalt, während gleichzeitig die Integrität des ER . Wenn dieses Verfahren mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) gekoppelt ist, kann man klar zu visualisieren ER-gebundenen mRNAs durch Fluoreszenzmikroskopie. Über dieses Protokoll der Grad der ER-Verband entweder lose Poly (A)-Transkripte oder bestimmte mRNAs beurteilt werden kannund sogar quantifiziert. Bei dem Verfahren kann man mit diesem Assay, um die Natur des mRNA-ER Wechselwirkungen zu untersuchen.

Introduction

In Eukaryoten sekretiert mRNA und Membranproteine ​​können zum ER co-translational von dem Signalerkennungspartikel ^1,2 ausgerichtet sein und kann auf der ER aufrechterhalten werden über die direkte Wechselwirkungen zwischen Ribosomen und translocons während der Übersetzung ^3,4. Doch ob mRNAs können gezielte und gepflegt werden am ER unabhängig von entweder Ribosomen oder Übersetzung war bis vor kurzem unklar. Frühere Studien haben versucht, anzusprechen, ob es translation-unabhängige mRNA zusammen mit dem ER über zelluläre Fraktionierung Techniken. Da harten chemischen Bedingungen waren erforderlich, um Ribosomen aus ER abgeleitete Vesikel, die....

Protocol

Ein. Herstellung von Materialien für die Extraktion

1. Herstellung von Zellen
   1. Saatgut Gewebekulturzellen am säurebehandelten Deckgläser für mindestens einen Tag vor dem Experiment. Wir verwenden COS-7 oder U2OS, da diese beiden Zelllinien robuste Produktion von sekretierten Proteins aufweisen und haben einen gut definierten ER. Beachten Sie, daß eine hohe Extraktionseffizienz zu erreichen, Zellen sollten nicht mehr als 80% Konfluenz auf dem Deckglas auf dem Tag des Experiments.
   2. Wenn ein bestimmter exogenen mRNA untersucht wird, werden die Zellen transfiziert einen Tag nach Impfen mit Plasmide, die das Gen von Interesse unter Verwendung von ....

Results

Um den Prozentsatz der mRNA, die den ER-assoziierten ist, COS-7-Zellen, die mit Plasmiden, die die plazentale alkalische Phosphatase (ALPP) oder Cytochrom P450-8B1 (CYP8B1) wurden entweder mit Digitonin extrahiert und dann fixiert oder direkt befestigt enthaltenen transfiziert wurden bestimmen (siehe Abbildung 1, siehe "unextrahierten Ctrl" auf "Extrahierte Ctrl"). Die nichtnuklearen Fluoreszenz wurde in beiden Proben und die Fraktion von ER-assoziierten mRNA wurde berechnet (A.......

Discussion

Die Lokalisierung von mRNAs zu verschiedenen subzellulären Seiten, durch das Zusammenspiel von Transkripte mit mRNA Lokalisation Proteinen ist ein weit verbreitetes Phänomen wichtig für die richtige Sortierung von Proteinen an ihren endgültigen Bestimmungsort und für die Feinabstimmung der Genexpression zu den lokalen Anforderungen an eine subzelluläre Region ^19,20.

Verwendung der hier beschriebenen Assays können wir die Frage, ob mRNAs, die sekretorische Proteine ​​kodieren, könn.......