C. elegans Chemotaxis-Assay

Zusammenfassung

Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion von Caenorhabditis elegans Beschrieben. A chemotaktischen Index (CI) wurde als eine Möglichkeit, genau zu ermitteln Reaktion von Würmern zu bestimmten Zielen und als Plattform des Vergleichs zwischen Stämmen und Verbindungen von Interesse verwendet.

Zusammenfassung

Viele Organismen verwenden Chemotaxis zu suchen, Nahrungsquellen, vermeiden Schadstoffe und finden mates. Caenorhabditis elegans hat eine beeindruckende Chemotaxis Verhalten.

Die Prämisse Prüfung des Ansprechens die Würmer zu einem Duftstoff ist, sie in einem Bereich zu platzieren und beobachten die Bewegung in Reaktion auf einen Geruchsstoff hervorgerufen. Auch mit den vielen verfügbaren Assays optimieren Wurm Ausgangsposition relativ zu sowohl der Steuer-und Testflächen, bei gleichzeitiger Minimierung der Interaktion von Würmern mit einander, während eine signifikante Stichprobengröße bleibt ein work in progress ^1-10. Die hier beschriebene Methode zielt darauf ab, diese Probleme durch Änderung der Assay durch Bargmann et al. ¹ entwickelt anzugehen. Eine Petrischale in vier Quadranten unterteilt ist, sind zwei gegenüberliegende Quadranten mit der Aufschrift "Test" und zwei "Control" bezeichnet. Betäubungsmittel wird in allen Test-und Kontrollgruppe Websites platziert. Die Würmer sind in der Mitte der Platte mit einem circl platzierte um den Ursprung markiert, um sicherzustellen, dass unbewegliche Würmer werden ignoriert. Mit Hilfe eines Vier-Quadranten-System anstatt einer 2 oder zwei 1 eliminiert Verzerrungen bei der Bewegung der Würmer, da sie gleich weit von Test-und Kontrollproben sind, unabhängig davon, auf welcher Seite des Ursprungs sie begann. Dies umgeht das Problem der Würmer ist gezwungen, durch ein Cluster von anderen Würmern zu reisen, um zu einem Geruchsstoff, die Würmer verzögern können oder sie zu zwingen, einen Umweg zu nehmen, was zu einer falschen Interpretation ihrer vorgesehenen Weg zu reagieren. Diese Methode zeigt auch praktische Vorteile durch einen größeren Stichprobenumfang und so der Forscher, um die Assay unbeaufsichtigt laufen und schießen die Würmer, wenn die Redezeit ist abgelaufen.

Einleitung

Ward entwickelte die erste Chemotaxisassay 1973 ^5, und seitdem hat weitreichende Anwendungen. Neurobiologie ist ein Feld, das von der Verwendung einer Vielzahl von Chemotaxisassays profitiert hat. Olfaktorischen Adaption, eine einfache Form von Lernen und Gedächtnis, hat in C nachgewiesen elegans mit Chemotaxisassays ^6. Sie sind auch verwendet worden, um zu zeigen, dass C. elegans entwickeln können Ethanol-Toleranz ein Ergebnis, das zeigt nicht nur das Verhalten Plastizität der Würmer, aber das zeigt auch, dass die Würmer kann sehr nützlich sein bei der Untersuchung der Abhängigkeit von Alkohol in Menschen ^3.

Protokoll

1. Vorbereiten / Waschen der Worms

1. Synchronisieren Würmer jungen Erwachsenen ^11.
2. Pipette 2 ml der S Basal auf eine 5 cm Chemotaxis Platte inszenierter Würmer, die nur den Rasen von OP50 E. gelöscht haben coli. Kippen Sie die Platte wie notwendig, um sicherzustellen, dass die Würmer aus der Plattenoberfläche in den Puffer gewaschen werden.
3. Je 1 ml der Wurm-S Basal Lösung in ein Reaktionsgefäß.
4. Zentrifuge für 10 sec mit einer PicoFuge bei 6.600 Umdrehungen pro Minute.
5. Saugen Sie die S Basal, so dass die Pellets von Würmern ungestört.
6. 1 ml S Basal Lösung des Mikrozentrifugenröhrche....

Ergebnisse

Vergleich Wildtyp (N2) C. elegans zur odr-10 (KY10)-Mutante.

Wir verwendeten Diacetyl, eine bekannte C. elegans Lockstoff, um Wildtyp-Würmern der einer Mutante, die den Rezeptor für Diacetyl ^1,12 fehlt vergleichen. Für Wildtyp (N2) Würmer die chemotaktische Index war 0,100 ± 0,066 zu Ethanol und 0,839 ± 0,031 bis 0,5% Diacetyl. Wie erwartet, löst Diacetyl einen signifikanten chemoattractive Antwort von Wildtyp-Würmer (P <0,003). Dagegen sind die.......

Diskussion

Chemotaxis, obwohl durch eine komplexe Reihe von neuronalen und zellulären Mechanismen gesteuert werden, können leicht und objektiv quantifiziert mit Chemotaxisassays sein. Um die besten Ergebnisse aus den Tests zu erhalten, müssen bestimmte kritische Schritte unternommen werden. Erstens, die Inszenierung der Würmer ist wichtig, was in Einklang experimentellen Ergebnisse. Worms in verschiedenen Lebensphasen unterschiedlich verhalten ^13; so gemischten Bühne Würmer können Skew experimentellen Ergebnisse. Zweite.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
S Basal (- Cholesterin) [5,8 g NaCl; 1 M K Phosphat-Puffer, pH 6,0; dH2O auf 1 Liter.] Autoklavieren
PicoFuge	Stratagene	400552
Mikroskope	Leica
Dissektion	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0,5 M Natriumazid
Chemotaxis-Agar [1,6% BBL-Agar (Benton-Dickinson) oder 2% Difco-Agar. Autoklavieren. Fügen Sie 5 mM Kaliumphosphat, pH 6,0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 hinzu]
Ethanol/Destilliertes Wasser
Testverbindungen (z.B. 0,5% Diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0,25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531