Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Zusammenfassung

Eine einfache Methode, um extrazelluläre Feldpotentiale in der larvalen Zebrafisch Vorderhirn aufnehmen beschrieben. Das Verfahren bietet eine robuste In vivo Auslesen der Beschlagnahme-artige Aktivität. Diese Technik kann mit gentechnisch veränderten Zebrafischlarven tragenden Epilepsie-verwandten Genen oder Anfälle durch Verabreichung von Medikamenten Konvulsivum evozierten verwendet werden.

Zusammenfassung

Epilepsie betrifft fast 3 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und bis zu 50 Millionen Menschen weltweit. Definiert als das Auftreten von spontanen Anfällen unprovozierten kann Epilepsie als Folge einer Beleidigung zum Gehirn oder einer genetischen Mutation erworben werden. Die Bemühungen um Modell Anfälle bei Tieren haben vor allem genutzt Beleidigungen (convulsant Drogen, Stimulation oder Hirnverletzungen) und genetische Manipulationen (Antisense-knockdown, homologe Rekombination oder Transgenese) in Nagetieren erworben. Zebrafische sind ein Wirbeltier Modellsystem ^1-3, die eine wertvolle Alternative zur Nagetier-basierte Epilepsieforschung bieten könnte. Zebrafische sind ausführlich in der Studie von Wirbeltier Genetik oder Entwicklung verwendet werden, weisen einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit genetischen Säugetieren und exprimieren Homologe für ~ 85% der bekannten menschlichen monogene Epilepsie Mutationen. Aufgrund ihrer geringen Größe (4-6 mm lang), kann Zebrafischlarven in Fluidvolumen so niedrig wie 100 ul werden während der frühen Entwicklung und arra gepflegtlungsgehilfen Multi-Well-Platten. Reagenzien können direkt zu der Lösung in dem Embryonen entwickeln, die Vereinfachung Arzneimittelverabreichung und die eine rasche in-vivo-Screening von Testverbindungen ⁴ zugesetzt werden. Synthetische Oligonukleotide (Morpholinos), Mutagenese, Zink-Finger-Nuklease und transgene Ansätze können verwendet werden, um rasch zu einer Gen-knockdown oder Mutation im Zebrafisch ^5-7 werden. Diese Eigenschaften leisten Zebrafisch Studien eine beispiellose statistische Analyse Vorteil gegenüber Nagetieren in der Studie von neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie. Da der "Goldstandard" für Epilepsie Forschung ist es, zu überwachen und zu analysieren abnorme elektrische Entladungen, die in einer zentralen Struktur des Gehirns (dh, Krampfanfälle), ein Verfahren zur effizienten Aufnahme Hirnaktivität in larvalen Zebrafisch stammen wird hier beschrieben. Diese Methode ist eine Anpassung der herkömmlichen extrazellulären Aufnahmetechniken und ermöglicht einen stabilen langfristigen Überwachung der Hirnaktivität in intakten Zebrafisch-Larven. Sreichlich Aufnahmen werden für akute Anfälle durch Bad Anwendung convulsant Drogen und spontane Anfälle in einem genetisch veränderten Fischen aufgenommen induzierte gezeigt.

Protokoll

Ein. Ei-Produktion und Sammlung

1. Zebrafisch Tierhaltung folgt Standardverfahren beschrieben ^8. Kurz gesagt, werden erwachsene Zebrafisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Kraft gesetzt. Wenn die Lichter im Zimmer am nächsten Morgen kommen, sind Trennwände aus Zuchtbecken und Fisch etwa 20 bis 60 min von ungestörten Paarungszeit dürfen entfernt.
2. Eier aus Zuchtbecken werden in einem Sieb gesammelt und gespült mit Ei Wasser. Eier werden dann in eine Petrischale mit Ei Wasser übertragen. Unbefruchteten Eiern und Schmutz werden mit einem Transferpipette.
3. Ort Petrischale mit der gesammelten Eier in einem Inkubator (28-32 ° C). Nach ....

Ergebnisse

Beispiele für elektrografische anfallsähnliche Entladung im Vorderhirn eines Agar-embedded Zebrafischlarven aufgezeichnet sind in Abbildung 1 gezeigt. Oder 1 mM Picrotoxin (in B; 8 dpf); großer Amplitude Multi-Impuls-Burst-Entladung in diesen Proben wurde durch Anwendung eines Bades Konvulsivum Wirkstoff, 40 mM Pilocarpin (6 dpf in A) hervorgerufen. In diesen Aufnahmen, immobilisiert und Agar-Zebrafisch eingebettet werden kontinuierlich für bis zu 90 min verfolgt. Fisch bleibt unter diesen Aufnahmebedin.......

Diskussion

Die extrazelluläre Aufzeichnung hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sehr sensitive und schnelle Analyse der Hirnaktivität. Diese Aufnahmen sind analog zu elektroenzephalographischen (EEG) Überwachen häufig verwendet, um das Vorhandensein von anormalen elektrischen Entladung (dh Anfall) in Nagetier-Modellen von Epilepsie ¹¹ und ¹² Patienten auszuwerten. Extrazelluläre Aufnahmen können mit pharmakologischen Manipulationen kombiniert werden, wie hier gezeigt. Diese Arten von Aufzeichnun.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt	Fisher-Scientific	BP1360-100	Man löst in Embryos Medien bei 1,2%
Speichermedien	Fisher-Scientific	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM MgCl 2, 10 mM Dextrose, 2,1 mM CaCl 2 pH-Wert auf ca. 7,3 mit 1 N NaOH
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0,02%
α-Bungarotoxin	Tocris Bioscience	2133	1 mg / ml
Kapillare Glasröhren	Warner Instruments	G120TF-3	Ziehen Sie auf einen Widerstand von 2 -7 MOhm
Patch-Clamp-Verstärkers	Warner Instruments	PC-505B	Wir verwenden ein Warner Verstärker Current-Clamp-Modus; Verstärkung bei 2 mV / pA und Bessel-Filter bei 2K eingestellt. Vergleichbare Modelle können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
Filter / Verstärker	Cygnus Technologie	FLA-01	Wir verwenden eine Cygnus Vorverstärker; Verstärkung bei 10-20 gesetzt; Cut-off Frequenz bei 1-2K eingestellt; Notch-Filter IN. Vergleichbare Modelle können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
Axon A / D Board und Axoscope Software	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2	Daten werden in Axoscope Verwendung spaltfreie Erfassungsmodus gesammelt; Abtastung bei 10 kHz. Vergleichbare Modelle und Programme können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
Egg Wasser	Instant Ocean		3 g Instant Ocean Meersalz, 2 ml 0,1% Methylenblau in 10 ml deionisiertem Wasser