Method Article

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

DOI:

10.3791/50126

⸱

February 11th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Department of Biological Sciences, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir eine histologische Verfahren zur Erfassung, Kennzeichnung, optisch Löschen und Bildgebung des intakten Hirngewebe Schnittstelle um chronisch implantierten Microdevices im Hirngewebe von Nagern. Ergebnisse von den Techniken, die diese Methode sind nützlich für das Verständnis der Auswirkungen von verschiedenen durchdringenden Gehirn-Implantate auf ihre umliegende Gewebe.

Abstract

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Die Erforschung der Gestaltung und Nutzung des Gehirns implantiert Microdevices, wie Mikroelektroden-Arrays, soll klinisch relevanten Geräte, die chronisch-Schnittstelle mit dem umgebenden Hirngewebe zu produzieren. Gewebe um diese Implantate ist vermutlich auf die Anwesenheit der Geräte im Laufe der Zeit, welche die Bildung eines isolierenden "glialen Narbe" um die Geräte umfasst reagieren. Jedoch wird histologische Analyse dieser Gewebsveränderungen typischerweise nach Explantation das Gerät durchgeführt wird, in einem Prozess, der die Morphologie des Gewebes von Interesse stören können.

Hier zeigen wir ein Protokoll, in dem kortikalen implantierten Geräten gesammelt intakt umgebenden Hirngewebe von Nagern sind. Wir beschreiben, einmal mit Fixiermittel perfundiert werden Gehirne entnommen und geschnitten in einer solchen Weise, dass Explantieren Geräten zu vermeiden. Wir skizzieren Fluoreszenz-Antikörper-Kennzeichnung und optische Clearing-Verfahren nützlich zur Herstellung eines informativen, aber dickes GewebeAbschnitt. Schließlich zeigen wir die Montage und Bildgebung dieser Gewebeschnitten, um die biologische Grenzfläche herum brain-implantierten Vorrichtungen zu untersuchen.

Introduction

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Das Gebiet der Forschung soll neuroprothetische Individuen leiden unter verschiedenen Behinderungen und Störungen durch Umgehen erkrankten oder geschädigten Strukturen im Körper durch ZNS Schnittstellenvorrichtungen 1,2 unterstützen. Brain-implantierten Microdevices, wie Mikroelektroden-Arrays (MEAs), können verwendet werden, um aufzuzeichnen oder zu stimulieren Hirnstrukturen, und ermöglichen so den Aufbau von langfristigen Schnittstellen zwischen Elektronik und ZNS-Gewebe 3-5 werden. Durchdringenden MEAs, Vorrichtungen, die in das Gehirngewebe angetrieben werden, halten besonders vielversprechend als bidirektionale Schnittstellen aufgrund der engen Nähe innerhalb der sie präsentieren Elektroden auf eine relativ kleine Gruppe von Neuronen in der Nähe 6.

Jedoch komplex Gewebereaktionen ergeben sich aus der langfristigen Implantation durchdringenden MEAs, was häufig in variablen und allmählich Vermindern elektrophysiologischen Signal-zu-Rausch-Verhältnissen über Tage bis Monate, und ein Anstieg der elektrischen ImpedanzGleichgewicht zwischen Elektrode Seiten und Boden 7,8. Die putativen Ursprünge dieser Änderungen umfassen die Aktivierung der Mikroglia, reaktive Astrozytose entlang der Mikrovorrichtungen, und einen Verlust oder Migration von Neuronen aus dem umgebenden Gewebe zu implantierenden Vorrichtungen 9-11. Eine große Herausforderung für das Verständnis dieser Gewebsveränderungen um chronische, Penetration MEAs ist die Schwierigkeit bei der Erfassung von histologischen Daten des intakten Gewebes Schnittstelle umliegenden chronisch implantierten Geräten 12. Die histologische Analyse des Gewebes mit dem Gerät / Gewebe-Grenzfläche noch vorhanden wäre auf die aktuellen Geräte-removal histologischen Protokolle verbessern. Vorrichtung mit einer ungestörten restlichen im Gewebe konnte die biologische Wirkung von relativ feinen Wechselwirkungen, wie zB die Verwendung von biokompatiblen Beschichtungen 13,14 oder dem elektrischen Löschen der Elektrodenoberfläche 15,16, abgebildet und analysiert werden in Bezug auf das Implantat.

Here zeigen wir eine Methode, um zu sammeln, zu verarbeiten und Bild der intakten Kleinstgerätes Schnittstelle für detaillierte Mikroskopie-basierte Analyse des umgebenden Hirngewebes. In diesem Verfahren werden die Vorrichtung und umgebende Hirngewebe in einem dicken (> 250 um) Gewebeschnitt mit einem Vibratom gesammelt. Etikett zur histologischen Eindringen in diesen dicken Scheiben zu verbessern, sind fluoreszierende histochemische und immunhistochemische Etiketten in hohen Konzentrationen in Lösungen enthaltend Blockierserum und Spülmittel für mehrere Tage aufgetragen. Optisches Clearinglösung eingesetzt wird, um Mikroskopie Tiefen zu verbessern, und das Gewebe wird im 2-seitigen Kammern für nachfolgende Laserscanning Konfokalmikroskopie 17 montiert. Um den vollen histologischen Schnittstelle zu erfassen, wird eine computergesteuerte translationale Stufe während der Bildgebung verwendet werden, um Z-Stapel Panoramen entlang der Länge der Implantate zu sammeln. Neben Bildgebung angewendet Gewebe Etiketten, Sammeln Laser Reflexion zurück von Implantatenund die Übertragung von Licht durch das Gewebe sowohl bei der Lokalisierung des Geräts Schnittstelle in Bezug auf das umliegende Gewebe. Tissue unter Verwendung dieses "Device-Capture Histologie" (DCHist Protocol) bietet Imaging Zugang zu den morphologisch konservierten Gewebe / Vorrichtungs-Interaktionen und damit eine Verbesserung gegenüber vorherigen Gerät-removal histologischen Protokolle 18.

Protocol

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Lösungen

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) - in g / l; 9 g NaCl, 0,144 g KH 2 PO 4, 0,795 g Na 2 HPO 4, bei pH 7,4

4% Formaldehyd - in ml / l, 202 ml dibasisches Natriumphosphat-Lösung (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml Natriumdihydrogenphosphat-Lösung (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml 8% iger Formaldehydlösung, 250 ml Milli- Q DDi Wasser, bei pH 7,4

HEPES gepufferte Hank Saline mit Natriumazid (HBHS) - in g / l; 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH 2 PO 4, 0,13 g Na 2 HPO 4, 2 g Glucose, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCl 2 6 Teile H 2 O, 0,05 g MgSO 4 7 Teilen H 2 O, 0,165 g CaCl 2, 0,09 g NaN 3 bei pH-Wert 7,4

Wash Solution (WS) - 1% Vol / Vol, Normal Ziegenserum, 0,3% Triton X-100, in HBHS mit Natriumazid (NaN 3). Kühlen die WS bei 4 ° C vor der Verwendung in nachfolgenden Schritten.

U2 Sca l e Lösung - 4 M Harnstoff, 30% Glycerin und 0,1% Triton X-100 17

VERFAHREN

Alle Experimente wurden unter der Aufsicht der Purdue Animal Care und Use Committee und dem Laboratory Animal Program an der Purdue University durchgeführt.

Ein. Chirurgie

  1. Verschiedene aseptischen chirurgischen Methoden sind kompatibel mit dem vorgestellten histologische Methode. Die Verwendung eines stereotaktischen Rahmen und automatisierte Kuvertiermaschinen werden empfohlen, um die Reproduzierbarkeit und Kontrolle der Mikroelektrodenarrays (MEA) Implantation Winkel bezüglich stereotaxischen Ebenen verbessern.

Hinweis: In dieser Demonstration unserer OP-Methode ist wie folgt: Halten Sie die Nagetierlebewesen in stereotaktischen earbars while unter Isofluran Narkose (zwischen 1-3%) von medizinischem Sauerstoff durchgeführt. Test für das Fehlen einer Vorspur Quetschung in der Ratte oder das Fehlen eines Schwanzes Pinch-Reflex in der Maus reflektieren, um zu bestätigen, dass das Tier betäubt voll ist. Bewerben Augensalbe und reinigen Sie die Operationsstelle mit drei wechselnden Wäschen Betadine und Ethanol. Hände waschen, Morgendämmerung OP-Handschuhe, Haarnetz, Mundschutz und Kittel. Inject einen Bolus von Lidocaine den OP-Bereich zu betäuben, erstellen einen Einschnitt mit einer Schere oder ein Skalpell, klare Periost mit Knochen Schaber und Watteträger, und erstellen Sie eine Kraniotomie mit einem Dentalbohrer Handstück und Bohrer. Fahren Sie einen Single-Schaft MEA in die Rinde mit einem Mikromanipulator. Haben einen chirurgischen Assistenten helfen bei der aseptischen Chirurgie Bedingungen und dokumentieren den Fortschritt der Chirurgie.

  1. Nach Implantation der MEA in das Gehirn, sammeln Bildern durch ein Operationsmikroskop, um die eventuelle Entfernung des Schädels aus aller b informierenregen. Implantierten Teile der Geräte werden in situ erhalten werden.

Anmerkung: Die eventuelle Entnahme von Gewebe mit in situ-Geräten basiert auf eng übereinstimmenden die Ebene der Geräteeinsteckzapfen mit der Ebene des Gewebes Sektionieren. Ausführliche Erläuterungen über dem Geräteeinsteckzapfen Ebene relativ zum Gehirn sind daher sehr wichtig.

  1. Nach Gerät Implantation, gelten die Silikonelastomer Kwik-Sil (WPI), um jeden ausgesetzt MEA Schäfte oder Verkabelung, und aushärten lassen. Eine sterilisierte Kunststoffteil, wie einem Schnitt Pipettenspitze, verwendet zur Eindämmung der Silikonelastomer in einem kleinen gut um den Kraniotomie während der Aushärtung werden.
  2. Tragen Sie eine Schicht von zweiteiligen Zahn Acryl ("Jet Liquid" und "Jet Powder" von Lang Dental) über den Kwik-Sil und alle exponierten Schädel.

Anmerkung: In einem späteren Schritt wird die durch Kopfbedeckungsgegenstand geschmolzen werden, um das Implantat zu trennenden ermöglichenaus dem Schädel. UV-härtende Acryl sollte über den Kwik-Sil und Kraniotomie vermieden werden, da dies sehr schwer Acryl ist später schwer zu entfernen. Optisch opake Materialien rund um das Implantat sollte auch vermieden werden, klare Kwik-Sil bietet eine Ansicht des Implantats während der nachfolgenden Schritte dieses Protokolls.

  1. Führen post-operative Betreuung Verfahren nach dem lokalen Protokoll der Tierschutzvorschriften und kehren ambulanten Probanden einzeln untergebracht Käfig-Boxen.

2. Perfusion und Tissue Sammlung

Hinweis: Siehe Gage et al. Für eine detaillierte Perfusion Komplettlösung in der Ratte Tiermodell 19.

  1. Verwenden Sie die Anästhesie und Perfusion Protokoll der Institution Tierhaltung und Verwendung gebilligt. Nach tief anästhesiert das Nagetier (bestätigt durch einen Mangel an Zehen-Pinch Reflex in Ratte oder Schwanz-Pinch Reflex in Mäusen) und Aussetzen des Herzens zu machen flachen Scherenschnitt inan den linken Ventrikel und rechten Vorhof. Legen Sie eine stumpfe Nadel in die linke Herzkammer und liefern Raumtemp PBS. Liefern insgesamt ~ 10 ml PBS bei ~ 5 ml / min bei Mäusen und ~ 200 ml PBS bei ~ 100 ml / min bei Ratten. Suchen Sie nach Blut-Clearance von der Leber während.
  2. Injizieren histologisch relevanten chemischen Markierungen transkardial, falls gewünscht, mit einer Spritze Lieferung mit darauf geachtet werden, Einführen von Bläschen.

Anmerkung: Vascular Etiketten (zB DiI) und Nukleinsäure-Gegenfärbung Farbstoffe (zB Hoechst 33342) sind Beispiele für chemische Markierungen lieferbaren während der Perfusion. Bei Verabreichung richtig, sollten diese histologischen Markern beschriften das ganze Tier 20.

  1. Liefern gepufferten, Raumtemperatur, 4% Formaldehyd transkardial um das Tier zu fixieren. Vermeiden Septumperforation über das Herz, die durch Lungen-Nase Entwässerung während der Perfusion nachgewiesen werden kann. Schauen Sie zur Fixierung Zittern in den großen Muskelnum eine vollständige Perfusion anzuzeigen. Liefern insgesamt ~ 10 ml Fixierlösung bei ~ 5 ml / min bei Mäusen und ~ 200 ml Fixierlösung bei ~ 100 ml / min bei Ratten.
  2. Nach Perfusion, enthaupten das Tier aussetzen Teil der Hirnstamm oder Kleinhirn mit rongeurs oder Schere, Ort und Kopf in 4% Formaldehyd-Lösung über Nacht bei 4 ° C.
  3. Waschen Sie den Kopf in drei Änderungen des PBS mit 3.59 Stunden-Intervallen zwischen den Waschgängen.
  4. Bewahren feste Köpfe in HBHS mit Natriumazid bei 4 ° C für Tage bis Monate.

3. Gehirn Entfernung mit in situ Devices

Hinweis: Führen Sie diesen Abschnitt in einem Abzug, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Vermeiden Gewebeaustrocknung durch Rücksendung der festen Kopf Lösung periodisch HBHS.

  1. Sorgfältig sezieren weg Haut und andere Gewebe aus der ganzen Acryl Käppchen mit einer Pinzette und kleine Schere.
  2. Während das Tragen Wärme-insensitive Handschuhe, mit einem Lötkolben zu zahnärztlichen Acryl zu entfernen und eine Fläche von zugrunde liegenden klaren Kwik-Sil (Abbildung 2a).

Anmerkung: Das Ziel dieses Schrittes ist es, eine Mikro-Schere geeigneten Winkel für den Zugang zu Positionen, wo die implantierten Vorrichtungen ins Gehirn, so daß brain-implantierten Komponenten von den Komponenten, die an dem Schädel getrennt werden können.

  1. Unter einem Operationsmikroskop, in die Silikonelastomer mit gekrümmten Mikro-Schere geschnitten und entfernt kleine Stücke von Kwik-Sil mit einer Pinzette auf der Position, wo die Vorrichtungen das Gehirn gelangen.
  2. Weiterhin Schneiden entlang der Oberfläche der gekrümmten Kraniotomie mit Mikro-Schere getrennten Vorrichtungskomponenten an Polysilizium und Schädel von Komponenten in das Gehirn implantiert. Wieder verwenden Mikroskopvergrößerung und große Sorgfalt beim Schneiden durch die freigelegten Gerätekomponenten, wobei darauf zu achten Schieben oder Ziehen der implants im festen Gewebe.
  3. Entfernen Sie Knochen um das headcap vorsichtig mit rongeurs. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn mit implantierten Geräten aus dem Schädel zu trennen. Bewahren Sie das Gehirn in HBHS Lösung erst kurz zu schneiden.
  4. Platzieren des Gehirns in einem Glas Petrischale mit HBHS gefüllt, und Verwenden einer Rasierklinge Fremdgewebe zu entfernen, wie Rückenmarksverletzungen, Cerebellum oder Riechkolben, je nachdem ob sie sind für die Position des Geräts Implantation. Verwenden eines Gehirns Block (Ted Pella) und Rasierklingen Abschnitt des Gehirns und eine flache Ebene eng übereinstimmenden den Winkel der implantierten Geräten, dies wird durch Anordnen des Gehirns in einer geeigneten Größe Gehirn blockieren bewerkstelligt, Orientieren des Gehirns so dass jegliche sichtbare Teil des Implantats parallel ist mit der Rasierklinge Führung und Anordnen einer Rasierklinge in einer Klingenführung mindestens 2 mm von dem Implantat. Drücken Sie die Rasierklinge durch das Gewebe. Montieren Sie diese Fläche zu einem Vibratom Plattform. Alternativ, montiert eine Rasierklinge auf einen Mikromanipulator kann in ähnlicher Weise gesteuert Mode als dem Gehirn blockieren, um eine Ebene eng übereinstimmenden die Richtung des Implantats zu schaffen verwendet werden.
  5. Statt Eis unter der Vibratom Plattform, und, nachdem man die Gewebeoberfläche kurz auf einem Papiertuch trocknen, haften das Gehirn mit einem Vibratom mit Super Glue. Kleben Sie das flache Gewebe Flugzeug in der vorherigen Schritt erstellt wird auf die Bühne. Gewebe mit asymmetrischen Abmessungen, Ausrichten der Probe derart, daß der breiteste Dimension unten parallel zu der Bewegungsrichtung der Klinge Vibratom vermeiden zu helfen die Klinge potentiell Klopfen des Gewebes über verklebt. Nach den Klebesätze (~ 1-2 min), fügen gekühlt (~ 4 ° C) PBS zu der Vibratom Schale um das Gewebe.
  6. Sammle dicke Gewebeschnitte zwischen 200-400 um, einschließlich der Kontrolle Gewebe, unter Verwendung der maximalen Schwinggeschwindigkeit (~ 100 Hz) und eine langsame Klinge Progression (<0,2 mm pro Sekunde), mit einem Anstellwinkel von 10 ° von horizontal. Sammle Scheiben vorsichtig mit einem Pinsel oder Schaufel Spachtel und Geschäft in HBHS in einer 24-Well-Platte bei 4 ° C.
  7. Sobald die Vorrichtung in situ sichtbar für das bloße Auge oder ein Operationsmikroskop, sammeln dünnere Abschnitte um die Vorrichtung in Slice Schritten von 100 um oder weniger annähern.

Hinweis: Typische Silicium Mikroimplantate sind mit bloßem Auge in Formaldehyd fixierten Nagetier Großhirnrinde Gewebe zwischen 300 und 500 um von der Oberfläche der Vorrichtung.

  1. Mit dem in situ Gerät jetzt auf die Oberfläche des Gewebes zu schließen, sammeln eine> 250 um Gewebeschnitt mit dem Gerät innerhalb. Abschätzung der notwendigen Dicke kann durch Bezugnahme auf zuvor gesammelten Scheiben unterstützt werden.

Hinweis: Größere Geräte Mehrzahn Vorrichtungen und Geräte erfordern abgewinkelten dickeren Gewebeschnitt (> 500 um), die Vorrichtung in einem Stück Gewebe einzufangen; reMitglied, dass sowohl das Eindringen von aufgebrachten Etiketten und der Mikroskopie Tiefe in der späteren Datenerhebung wird aus diesen sehr dicke Scheiben begrenzt werden. Wenn möglich, vermeiden schlug das Gerät mit dem Vibratom Klinge, da dies kann dazu führen, indem Sie das Gerät durch das Gewebe und morphologischen Verformung.

4. Tissue Processing und Clearing

  1. Waschen Scheiben 3x bei 5 min pro Waschgang in HBHS
  2. Inkubieren in Natriumborhydrid (5 mg NaBH 4/1 ml HBHS) 30 min insgesamt (15 min auf jeder Seite der Scheibe). Drehen Sie die Scheiben mit einem Edelstahl oder Teflon beschichtete Mikro Löffel und kleinen Pinsel (Ted Pella). Langsam und nachdenklich Bewegungen zu verbessern, den Erfolg jeder Scheibe flip. Berühren Sie keine Bereiche um das implantierte Gerät mit dem Pinsel. Wenn möglich, indem deutlich mehr Lösung als erforderlich (> 2 ml) ermöglicht ein zu manipulieren und drehen Sie die Gewebeschnitte leichter.

Hinweis: Dieser Schritt reduziert endogenen Autofluoreszenz; diesen Schritt überspringen, wenn Fluoreszenzmarkierungen während der Perfusion angewendet wurden oder xFP transgenen Marker vorhanden sind.

  1. Waschen Scheiben 3x bei 5 min pro Waschgang in Waschlösung bei Raumtemperatur.

Hinweis: Agitation während des Waschens und Inkubationsschritte ist optional. Die Autoren vermuten, dass subtile Erschütterungen des steifen Implantats in Bezug auf das umgebende Hirngewebe kann unter Rühren erfolgen. Jedoch kann eine Orbitalmischer sich mit einer sanften Rate (<60 rpm) vermeiden dies bei gleichzeitiger Erhöhung der Bewegung der Lösungen.

  1. Sperre für 2 Stunden in Waschlösung bei Raumtemperatur (Flip Scheiben nach einer Stunde).
  2. Inkubieren in primären Antikörper (verdünnt in Waschpuffer) für ungefähr 48 h (24 h auf jeder Seite der Scheibe) bei 4 ° C.
  3. Führen Sie 6 schnellen 3 min Waschen mit Waschlösung.
  4. Führen Sie 6, 1 hr Wäschen (3 washes auf jeder Seite des Gewebes Scheibe) in Waschlösung (lagern bei 4 ° C, wenn Waschen über Nacht).
  5. Inkubieren in Sekundärantikörper (verdünnt mit Wash Solution) für ca. 48 Std. (24 Std. auf jeder Seite) in 4 ° C.
  6. Führen Sie 6 schnellen 3 min Waschen mit Waschlösung.
  7. Führen Sie 6, 1 hr Wäschen (3 Wäschen auf jeder Seite) in Waschlösung; lagern bei 4 ° C, wenn Waschen über Nacht.
  8. Entfernen Waschlösung und fügen Sie die Glycerin-based "U2 - Sca l e" Clearing-Lösung. Lassen Sie ca. 1 Woche für dicke Scheiben (250-500 um) oder 2-3 Wochen klar für sehr dicke Gewebeschnitte (> 500 um) bei 4 ° C.
  9. Platte mit Folie abdecken und bei 4 ° C.
  10. Montieren Sie in Folien Aufnahme dicke Gewebeschnitte (Abbildung 2b, 2c) mit Clearing-Lösung als Eindeckmittel und Versiegeln mit klarem Nagellack. Lagerung bei 4 ° C weg vom Licht.

5. Panorama Imaging von Full Tissue und Device Interface

  1. Verwendung längerer-Arbeitsabstand Mikroskopobjektive (> 2 mm), beginnen Bildgebung mit einem Laser-Scanning konfokalen Mikroskops oder 2-Photonen-Mikroskop. Wir werden mit einem Zeiss LSM 710 von Carl Zeiss "Zen"-Software (2010), und einem Computer-gesteuerten XY übersetzen Bühne Bild ein 3D-Panorama um ein Implantat zu demonstrieren.

Anmerkung: Korrigieren der Brechungsindex des Clearing-Lösung entweder in Software, durch eine korrigierende Kragen auf dem Ziel oder in der Datenverarbeitung nach der Sammlung. In dieser Demonstration geben wir einen Brechungsindex Wert für die "U2" Clearing-Lösung von 1,4 in die Leica Zen Mikroskop-Software; diese Einstellung dezent passt z-Schritt Abständen zu berücksichtigen Brechungsindex mismatch.

  1. Im Gewebe in der Nähe der Vorrichtung, grob abschätzen die entsprechenden Z-Achsen-Fenster und Einstellungen für die Erfassung in der Z-Dimension für jeden Kanal unter Verwendung fluoreszierender niedrigen Laserleistung (~ 00,5 bis 5%) und großen z-Schrittweiten (> 25 um).

Hinweis: Fügen Sie zusätzliche Raum oberhalb und unterhalb bei der Einstellung der z-Achse bei der Einrichtung für Panorama-Datenerfassung, da das Gewebe nicht lügen kann ganz flach auf dem Objektträger (~ 20 um jede Richtung).

  1. Zum Ziel gesetzt, bei der xy Mitte des eventuellen panorama; mit dem Zen Panorama-Software, die Anzahl der Sammlung Positionen für jede Achse (x und y) für Ihre Region von Interesse abzudecken erforderlich.
  2. Überdenken und Fertigstellung des z-Achse Sammlung Fenster.
  3. Manuell die Empfindlichkeit des Detektors und Laserleistung angemessen Rampe mit erhöhter Tiefe; das Ziel ist in der Regel etwa gleich bleibt, Bildintensität unabhängig von Bildtiefe in das Gewebe Scheibe, sondern auch Vermeidung hoher Geräuschkulisse.
  4. Sammle jedes Fluoreszenzbild Datenreihen. Wenn notwendig, um Überschneidungen zu vermeiden Signale laufen Laserlinies nacheinander.

Hinweis: Falls vorhanden, legen Sie die Software automatisch Daten speichern auf der Festplatte während der Sammlung.

  1. Ändern Sie die Software-Einstellungen, um die "Reflexion" und "Durchlässigkeit" Daten zu sammeln, und verwenden Sie einen längeren, mehr Durchschlagskraft Wellenlänge Laser (zB 633 nm), um diese Kanäle zu erfassen. Bestimmen Sie die entsprechende Laserleistung und Detektorempfindlichkeit für "Reflexion" und "Durchlässigkeit" Sammlung und wiederholen Sie den gleichen Kollektion Serie rund um das implantierte Gerät.
  2. Exportieren Sie die Daten zur späteren Verarbeitung, Quantifizierung und Analyse.

Results

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Gehirn-implantierten MEAs in Gewebeschnitten durch erste Abtrennen jeglicher Schädel-mounted-Komponenten aus den Gehirn-eingebetteten Komponenten gesammelt werden. 2a zeigt die Ergebnisse des Entfernens einer Seite eines Dentalzement Kopfbedeckungsgegenstand und einen Abschnitt des Kwik-Sil umgibt MEA Kabel an einer Ratte Schädel. Lötkolben wurde verwendet, um die zahnärztliche Zement und Kwik-Sil im Abzug zu entfernen. Die Verkabelung und jegliche nicht-implantierten MEA Strukturen wurden als nächstes mit Mikro-Schere durch langsames Aushub durch den Kwik-Sil bis auf die Oberfläche des festen Gehirn geschnitten.

Nach Schneiden, Beschriften und Löschen Gewebe, sind einfache maßgeschneiderte Folien nützlich für die Montage der dicken Gewebeschnitt (Abbildung 2b). Ein bereitgestelltes Hirnschnittkultur enthaltend eine implantierte Mikrovorrichtung ist in 2c gezeigt. Imaging über beiden Seiten des Schlittens können Sie die Schnittstelle um ein Gerät zu beurteilen, wie in Abbildung 3 gezeigt, (3a) und Mikroglia entlang Elektrodenstellen und Spuren sichtbar sind auf der anderen Seite (3b).

Einmal montiert, kann Gewebe abgebildet mit einem XY-Übersetzung Bühne. Übersichten von Fluoreszenzmarkern über die gesamte Gewebeschnitte können mit der gewünschten Auflösung (Abbildung 4) erzeugt werden. Eine ausführliche Prüfung der morphologisch konservierten Gewebe-Grenzfläche rund implantiert Microdevices unter hoher Vergrößerung für die Analyse der lokalen Reaktion des Gewebes (Abbildung 5) gesammelt werden.

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Abbildung 1. Übersicht zur Vorgehensweise. (Ac) Brain Mikroimplantat Operationen sind finasiert mit einer Schicht aus Kwik-Sil Polymer unmittelbar die Vorrichtung umgibt, gefolgt von einer Acrylzement Bedeckung. (D, e) Nach Euthanasie, wird der Acrylschicht entfernt, verbrannt und Schädel-mounted-Komponenten der Vorrichtung sind aus implantierten Komponenten durch Schneiden durch das Silikonelastomer getrennt. (F, g) Das Gehirn wird dann aus dem Schädel entfernt und geschnitten wird und an dem Vibratom Bühne. (Hk) Gewebeschnitte werden gesammelt, darunter ein Gewebeschnitt mit dem Gerät. (L) Tissue kann dann bearbeitet und montiert werden in benutzerdefinierten Kammern für detaillierte Mikroskopie. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 2. (A) Löschen Kwik-Sil Silikon-Elastomer surrounding eine Elektrode-Anordnungs-Kabel (Pfeil) durch Abbrennen eines Fensters in der Dentalzement Kappe auf einem perfundierten Nagetier Kopf mit einem Lötkolben ausgesetzt. (B) Zu Bildgebung in die beiden Seiten einer dicken Gewebeschnitt unterzubringen, einfach "slide-Kammern" kann durch Schneiden einer plastischen Folie und Ankleben Abdeckglases zu beiden Seiten um das Gewebe und Montage Lösung vorgenommen werden. (C) Eine Rattenhirn Gewebeschnitts mit intakten Implantat (Pfeil) wird nach der Montage gezeigt. Jede Seite des Gewebes ist schnell zugänglich Mikroskopie mit diesem Setup. Für Maßstab ist Panel (a) 25 mm über am Boden, während Paneele (b, c) 80 mm über am Boden sind.

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Abbildung 3. Maximale intichte z-Vorsprünge von 40 um dicke Bildstapeln, um die Rückseite (a) und (b) Stirnseite eines implantierten Mikroelektrodenfeldanordnung gesammelt. Mikroglia (markiert mit anti-Iba1 und Alexa Fluor 633, weiß) und Laserlicht Reflexionsgrad (rot), von der Oberfläche der Vorrichtung gesammelt wurden nacheinander von beiden Seiten einer 400 um dicken Gewebeschnitt abgebildet. Da die Gehirnimplantaten häufig opak sind, Montage mit optischen Zugang zu beiden Seiten sichert den Durchblick von markierten Gewebestrukturen "hinter" dem Implantat bezüglich des Mikroskopobjektivs. Maßstab 50 um.

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Abbildung 4. Markiertes DCHist Slice abgebildet unter Verwendung eines Computer-gesteuerten Stufe auf einem Laser-Scanning-Konfokalmikroskop. (A) Die Zellkerne (gefärbt mit Hoechst 33342) und (b) Monozyten / Mikroglia(Beschriftet mit Anti-Iba1) wurden gleichzeitig auf getrennten Kanälen abgebildet. (C) Transmission Licht und Reflexion wurden ebenfalls gesammelt, zeigt den Standort der 4-Wochen Implantat mit Bezug auf Hoechst und Iba1 Daten. (D) Überlagerung aller Kanäle aber die Übertragung wird ebenfalls angezeigt. Das weiße Rechteck Bereich wird in den Bildern erscheinen rechts erweitert. Maßstab 1 mm.

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Abbildung 5. Verwenden einer Computer-gesteuerten Mikroskoptisch und entsprechender Software kann panoramischen Bilddaten um das Implantat gesammelt werden. Reflexionsvermögen (a) und Durchlässigkeit (b) erlauben Lokalisierung des Geräts, während fluoreszierende Antikörper oder chemische Markierungen (c, Anti-Iba1 Etikettierung von Mikroglia und macrophages) ermöglichen detaillierte Bildgebung von Gewebe Komponenten entlang der intakten Gewebe-Schnittstelle. Maßstab 200 um.

Discussion

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Der "Device-Capture Histologie" (DCHist)-Methode hier gezeigt ermöglicht die enge histologische Beurteilung der morphologisch konservierten Wechselwirkungen zwischen Hirngewebe und Gewebeimplantate. DCHist Gewebesammelbeutel erfordert eine sorgfältige Trennung der Schädel-Mounted-Device-Komponenten von den Komponenten im Gehirn implantiert. DCHist erfordert auch Sammlung von einer dicken histologischen Gewebeschnitt (> 250 um). Diese Gewebeschnitten, einmal markiert, gelöscht, montiert und abgebildet werden, können neue Einblicke in die Implantation Verletzungen oder Folge einer chronischen Reaktion auf innewohnende Geräte bieten. Mit Hilfe modernster Mikroskopie-Tools, kann die Schnittstelle zwischen Gewebe und Gerät abgebildet und analysiert werden in hohen Details, wie in den Abbildungen 3-5 dargestellt.

Die vorgestellten Techniken in ihrer derzeitigen Form beruhen auf der Fähigkeit, langsam graben sich die Kopfhaube aus zwei Teilen Zahnzement und Kwik-Sil bis zu dem Punkt des Gerätes Implantation.Verwendung Dentalzement die weg gebrannt werden kann oder auf andere Weise entfernt und eine klare Silikonelastomer durch welche kleine Schere geführt optisch stark in erfolgreich Abtrennen der implantierten Vorrichtung aus dem Schädel-mounted-Komponenten unterstützen kann. Der Versuch, das Gerät unter dem Schädel und das Gehirn über geschnitten, um es in situ zu sammeln ist nicht empfehlenswert, da der Schädel montierte Implantat heraus wird im Gehirn eine signifikante Menge abgezogen werden.

Obwohl dünner, kleiner Implantate, wie einzelne Schaft MEAs aus NeuroNexus Technologies, am ehesten zugänglich zu DCHist sind, werden die Prinzipien nicht auf einzelne Geräte Schäfte oder Mikroelektroden-Arrays beschränkt. Sammlung und Imaging-Strategien sind breit anwendbar zu Multi-Schaft Geräte und größere Implantate wie Kanülen, mit den Anforderungen ist, dass sie von jedem Schädel Halterung getrennt werden gesammelt und in einem dicken Gewebeschnitt. Obwohl die Autoren sich auf die Analyse von Gewebe konzentriertumgebenden kortikalen Implantate könnten Geräte tiefer in das Gehirn getrieben ebenfalls gesammelt und abgebildet werden. Die Tiefe der Implantation sollte nicht die Erfassung des Implantats in einer Scheibe vorgesehen das Gerät nicht wild abweichend zur bekannten Winkel Einschubrichtung.

Einschränkungen existieren, um die nützliche Anwendung der DCHist Methode. Hirngewebe Abschnitte sind image Herausforderung durch Hunderte von Mikrometern, insbesondere in den Bereichen der weißen Substanz, obwohl optische Clearing-Lösungen erheblich verbessern kann imaging Tiefen in verschiedenen Geweben 21. Zur weiteren Verbesserung Abbildungstiefe kann Zweiphotonenanregung Mikroskopie zusammen mit dem optischen Lichtung beschrieben eingesetzt werden.

Eine weitere mögliche Einschränkung des beschriebenen Verfahrens lassen sich die spezifische fluoreszierende Immunohistochemie Methoden und Antikörper durch Forscher entsprechend eingesetzt werden. Passive Diffusion in der Regel treibt die Integration dieser Marker durch feste Gewebeund auf Antigen-Bindungsstellen. Fertigen Antikörper Arbeiten Konzentrationen müssen die Forscher auf einer von Fall zu Fall zu kennzeichnen Eindringen zu maximieren bei gleichzeitiger Vermeidung hoher Hintergrund Kennzeichnung festgelegt werden. Antikörpermarkierung sollte nicht variabel zwischen Scheiben, die identisch verarbeitet werden, aber verschiedene Antikörper können beträchtlich variieren in ihrer Fähigkeit, zu durchdringen und zu markieren ihr Antigen, wobei einige Antikörper leicht Etikettieren Antigene viele hundert Mikrometer tief und andere Markierungen Antigene nur zehn Mikrometer tief. Wir beschreiben die Verbesserung dieser Diffusion durch Anlegen Antikörper markiert bei höheren Konzentrationen als typische, für mehrere Tage der Applikation, und in einer Lösung, die verdünnte Reinigungsmittel und Blockierserum. Periodisch Spiegeln die Scheiben fördert auch noch die Etikettierung. Antigenwiedergewinnung Schritte und alternative Fixierung Prozesse (zB Glutaraldehyd, Mikrowellen etc.) geeignet sein für spezifische Antigene. Sekundärantikörper-fluorochrom Konjugate können auch in ihrer Leistung Kennzeichnung dicke Schnitte variieren, obwohl dies von den Autoren nicht mit Alexa Fluor Etiketten von Invitrogen beobachtet worden. Alternativ kann transgenes Tier exprimieren Probanden fluoreszierenden Proteine ​​in den Zelltypen von Interesse verwendet werden, um Probleme mit Antikörpermarkierung Penetration zu vermeiden, da viele fluoreszierende Proteine ​​wie eGFP, behalten ihre Fluoreszenz nach Formaldehyd-Behandlung, und kann unmittelbar visualisiert Gewebeschnitten.

DCHist ist eine leistungsfähige Reihe von Techniken zur Erfassung und Analyse der Auswirkungen von implantierten Microdevices an Hirngewebe. Kopplung dieser histologischen Protokoll mit in vivo Beurteilung der Elektrophysiologie Qualität und Elektrodenimpedanz Daten 22 könnte erheblich verbessern unser Verständnis der biologischen Quellen der Physiologie Variabilität und Abbau. Der Bereich der implantierten neuronalen Prothesen kann insbesondere aus der ausführlichen DCHist ima profitierenGing der intakten Gerät / Gewebe-Grenzfläche zur Weiterentwicklung der biologisch neutral MEA-Geräte informieren.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine relevanten Angaben zu erklären, finanziell oder anderweitig.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Experimente wurden unter der Aufsicht der Purdue Animal Care und Use Committee und dem Laboratory Animal Program an der Purdue University durchgeführt.

Diese Arbeit wurde von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), unter der Schirmherrschaft von Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) als Teil des Reliable Neural Technology Program gesponsert durch das Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.

Die Autoren bedanken sich bei Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor und Kevin Eliceiri für den Austausch ihrer Mikroskopie Expertise danken.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagenzien
Hoechst 33342 Invitrogen 14533 DNA-Marker
Rabbit anti-Iba1 Wako (Japan) 019-19741 Monozyten-Antikörper
Dental Acryl Lang Dental (verschiedene Distributoren) Jet Gebiss-Reparatur Powder & Liquid Kopfhaube Bau
Kwik-Sil World Precision Instruments KWIK-SIL Abdecken ausgesetzt kranialen Implantate
Normalem Ziegenserum Jackson ImmunoResearch 005-000-121 Gewebe-Verarbeitung
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Gewebe-Verarbeitung
Harnstoff Sigma-Aldrich U4883 Clearing-Lösung
Glycerol Sigma-Aldrich G20225 Clearing-Lösung
Ausrüstung
Curved Mikro-Schere World Precision Instruments 14208 Schneiden Implantat vor dem Entfernen des Gehirns
Rasierklingen Ted Pella (Verschiedene Größen) Für den Einsatz mit Gehirn blockieren
Acryl Gehirn Matrice Ted Pella 15054 Gehirn Block zu ersten Ebene im Gewebe zu schaffen
Plastic Dias Ted Pella 260225 Montage Gewebe
Deckglas Ted Pella (Verschiedene Größen) Montage Gewebe
Elektrodenanordnungen NeuroNexus Technologies (Verschiedene Ausführungen) Beispiel MEAs
Vibratom Leica VT1000 S Spezifische System vorgestellte Methode verwendet
Vibratom Klingen (Versch. Anbieter) Sammeln Scheiben
24-Well-Platten (Versch. Anbieter) Speicherung und Verarbeitung von Gewebeschnitten
Konfokalen Mikroskop mit motorisierten XY-Scanningtisch Carl Zeiss Mikroskopie Zeiss LSM 710 und 'Zen 2010 "-Software Spezifische System vorgestellte Methode verwendet
Lötkolben (Versch. Anbieter) Excavating headcap

References

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