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Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

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DOI:

10.3791/50191

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28. März 2013

 ,  , 
1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Primäre weißen Präadipozyten aus weißem Fettgewebe von Mäusen isoliert werden in beige / brite Zellen unterschieden werden. Präsentiert hier ist ein zuverlässiger zellulären Modellsystem, um die molekulare Regulation von "Bräunung" der weiße Fett zu studieren.

Zusammenfassung

Braunen Fettzellen haben die Fähigkeit, die Atmungskette der Mitochondrien entkoppeln und dissipieren chemische Energie als Wärme. Entwicklung UCP1-positiven braunen Fettzellen in weißem Fettgewebe (sogenannte beige oder brite Zellen) hoch ist durch eine Vielzahl von Umweltreize wie chronische Kälteexposition oder durch PPAR &ggr; Agonisten induziert wird, somit hat dieses Zelltyps Potential als therapeutisches Ziel für Behandlung von Fettleibigkeit. Obwohl die meisten verewigt Adipozyten Linien nicht rekapitulieren können den Prozess der "Bräunung" der weißen Fett in Kultur, primären Adipozyten aus stromalen vaskulären Fraktion im subkutanen weißen Fettgewebe (WAT) isoliert eine zuverlässige zelluläre System, um die molekulare Kontrolle der beige / brite-Zell-Entwicklung zu studieren . Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine effektive Trennung von Primär-und Präadipozyten zur Induzierung der Differenzierung zu beige / brite Zellen in Kultur. Die Bräunung Effekt kann durch die Expression von braunem Fett-selektive Markierung beurteilt werdenten wie UCP1.

Einleitung

Adipositas ist dramatisch zunehmenden weltweit und ist heute eines der schwerwiegendsten Bedenken für die öffentliche Gesundheit 1 betrachtet. Dieser Zustand ist mit einem Ungleichgewicht in der Energieaufnahme relativ zu Ausgaben und führt überschüssige Energie als Lipid in weißem Fettgewebe (WAT) gespeichert verwandt. Vergrößerten WAT ist mit einer erhöhten Körpermasse und Gewicht zugeordnet ist, während braunes Fettgewebe hat die Fähigkeit, überschüssige Energie abzuleiten, um Wärme zu erzeugen. Daher BAT kann als Schutz gegen Kälte und Übergewicht 2,3 funktionieren. Dies wird durch Auskuppeln der Elektronentransport in Mitochondrien durch entkoppelnde Protein 1 (UCP1) erreicht. Dieses Protein wird als ein Markenzeichen für nonshivering Thermogenese in BAT 3. Mehrere Studien in den letzten Jahren gezeigt, dass erwachsene Menschen funktionale BAT 4-8 haben und somit Manipulation von BAT beim Menschen kann eine mögliche therapeutische Intervention im Kampf gegen Fettleibigkeit und die damit verbundenen Krankheiten.

jove_content "> Aktuelle Daten zeigen, dass zwei Arten von braunen Fettzellen bei Nagetieren existieren;" klassischen "oder" pre-existierenden "braunes Fett entwickelt sich während der pränatalen Phase und bildet gewidmet braunen Fettgewebe Depots in interskapularen Region und anderen peripheren Geweben Auf der anderen Seite. ein "induzierbare" Form von braunem Fett (sogenannte brite oder beige Zellen) entwickelt sich während der postnatalen Stufe und erscheint durchsetzt im weißen Fettgewebe. Die zwei Typen von braunen Fettzellen auch von verschiedenen Entwicklungsstadien Ursprünge getrennt. Während die vorbestehenden braunen Fettzellen entstehen aus myoblastsic-ähnliche Myf5 Vorstufen entstehen die induzierbare brite / beige Zellen in WAT durchsetzt von einem nicht-Abstammungslinie Myf5 9,10. Zusätzlich Regulationswege dieses Zelltyps wahrscheinlich unterschiedlich vom Myf5 abgeleiteten braun ist Adipozyten 11. Die Entwicklung der beige Zellen (dh "Bräunungs" von weißem Fett) in Reaktion auf chronische Kälteexposition und aktiviert werdenβ3-Adrenozeptor-Agonisten oder PPAR &ggr;-Agonisten bei Erwachsenen 12-14. Die beige / brite Zellen wahrscheinlich ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für Manipulation Gesamtenergiebilanz sein und kann potentiell Teil Entfettungskur geworden, daher ist es wichtig, genaue molekulare Mechanismen und Signalwege durch welche Umweltreize steuern die Entwicklung der beige verstehen Zellen.

Um die molekulare Kontrolle der Bräunung von weißem Fett zu verstehen, werden in vitro-Versuche am besten als Differenzierung von Präadipozyten erfolgt vielmehr asynchron geeignet und es ist schwierig, die Zellen in situ 15 detektieren. Obwohl Studien zur Entwicklung Adipozyten somit haben bis jetzt überwiegend auf Zelllinien wie 3T3-L1, 3T3-F442A oder HIB1 durchgeführt erscheinen diese Zelllinien, die molekulare Unterschrift beige Zellen fehlt. Auf der anderen Seite, sind primäre Adipozyten aus subkutaner WAT isoliert am ehesten die Verarbeitung rekapitulierens der Bräunung der weiße Fett in einer Zelle autonom. Hier bieten wir ein Protokoll für eine effektive Isolierung des Stroma-Kreislauf-Fraktion aus Fettgewebe und zur Induktion der Bräunung von weißem Fett in Reaktion auf PPAR &ggr;-Agonisten. Rosiglitazon ist gezeigt worden, eine besonders effektive Mediator Bräunungsgrad in diesen Zellen vorhanden sein. Wie zuvor 16 angedeutet, kann dieses zellulare System verwendet, um eine zuverlässige Zellularsystem um die Entwicklung von beige / brite Zellen zu untersuchen dienen.

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Protokoll

Ein. Bereiten Verdauung Medium

Make 5 ml pro 5 Mäuse pro Gewebe (ca. 1 ml / 1 g Fettgewebe).

  1. Wiegen in Verdauungsenzyme:
    - Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70.334.223)
    - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0.980 mg / lyo, Roche, 11.466.200)
  2. 25 ml PBS und gut mischen sich aufzulösen
  3. Hinzufügen CaCl 2 unmittelbar vor dem Aufschluss des Gewebes bei einer Endkonzentration von 10 mM

2. Dissect Fettgewebe von Mäusen

  1. Dissection sollte sorgfältig durchgeführt werden, und unmittelbar nach der Mäuse (6-8 Wochen alt) geopfert werden. Arbeiten sterile mit Ethanol auf der Maus Fell gesprüht, bevor Sie es öffnen. Legen Sie das Gewebe direkt in sauberen PBS, separate interskapularen BAT und des Unterhautzellgewebes inguinal WAT.
  2. Für interskapularen BAT: die Maus mit dem Rücken stellten sich gelegt, geschnitten entlang der Rückseite und den ganzen Weg bis zum Hals offen. Die brauneFettgewebe kann direkt unter der Haut zwischen den Schultern (interskapularen) gefunden werden. BAT als zwei Lappen, Schmetterling geformt gesehen werden. Eine dünne Schicht aus weißem Fett Abdecken der BAT sollte sorgfältig entfernt werden.
  3. Für die subkutane WAT (inguinal WAT): Haut entfernen. Leistenbruch WAT wird direkt unter der Haut auf beiden Seiten gefunden, beginnend fast auf den Rücken und geht neben, Innenseite der Oberschenkel und nach unten in Richtung des Hodens.

3. Ausschneiden und Digest Fettgewebe

  1. Schnelles Entfernen alle Verunreinigungen wie Haare, Skelettmuskulatur und Bindegewebe von den Gewebeschnitten.
  2. Trocknen Gewebe schnell auf Papier nicht verwässern Dissektion Medium mit PBS und legen Sie sie auf einer trockenen Platte.
  3. Fügen Digestionsmedium (hinzugefügt CaCl 2 vor der Verdauung) und Mince das Gewebe in kleine Stücke schneiden. Mix sehr gut durch Auf-und Abpipettieren mit einer 5 ml Pipette. Übertragen der zerkleinerten Gewebe in 50 ml Röhrchen mit dem Rest des Aufschlusses medium, mischen noch mehr durch Auf-und Abpipettieren.
  4. Digest 37 ° C mit konstantem Rühren bei 150 UpM für 40-50 min. Überprüfen Sie alle 10-15 min sicherstellen, dass die Verdauung gut und über-Verdauung zu verhindern.

Hinweis: Die korrekte Digestionsmedium und Zeit sind wichtig. Das Gewebe muss gut verdaut werden, aber überschüssige Verdauung kann die Zellen schädigen.

4. Filter Zellsuspension

  1. Stoppen Verdau durch Zugabe von 5 ml Vollmedium (DMEM/F12 mit 10% FPS und P / S). Die Zellen sollten fast völlig homogen. Gut mischen durch Pipettieren.
  2. Zentrifuge bei 700 × g für 10 min.
  3. SVF kann nun als bräunliches Pellet am Boden des Röhrchens gesehen werden. Saugen Sie die ölige reife Adipozyten Schicht auf der Oberseite und die meisten der flüssigen Schicht - halten Sie das Pellet und löst ihn in 10 ml Vollmedium. Gut mischen.
  4. Legen Sie eine Zellsieb (50-70 Mikrometer Durchmesser) über einen neuen 50 ml-Tube und Filtern der Zellsuspension.

5. Platte Cells

  1. Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen und Zentrifuge bei 700 × g für 10 min.
  2. Anzusaugen Mediums und Resuspendieren Pellet in 10 ml Vollmedium. Pipette und gut mischen.
  3. Schätzen Sie, wie viele Platten benötigt werden. Dies kann variieren und hängt von der Pelletgröße. Eine allgemeine Regel ist 2 von 10 cm Platten aus 5 Mäusen inguinal WAT und eine 10 cm Platte für BAT.
  4. Platte Zellen auf Kollagen beschichteten Platten (R & D) in Vollmedium
  5. 1-2 Stunden nach Ausplattieren der Zellen, absaugen Medium, zweimal mit PBS waschen und mit frischem Medium. Dieser Schritt ist wichtig, da dies roten Blutzellen, Immunzellen und andere Verunreinigungen entfernen kann.

6. Differenzieren Cells

  1. Die Wartung und die Induktion Medien.

Erhaltungsmedium

Komplett-Medium mit:

ent "> Insulin, Endkonzentration. 5 pg / ml (5 mg / ml Brühe, *** 100 ul Essigsäure in 10 ml H 2 O zur Vorbereitung angesäuert Wasser pH-Wert 2,5. aufzulösen Insulin in der angesäuerten Wasser. Shop bestellt -20 ° C)

3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine (T3), Endkonzentration. 1 nM (10 uM Lager auflösen *** in 1N NaOH T3 und fügen mittel-bis 10 uM Lager zu machen. Sigma cat # T-2877)

Lagerung bei 4 ° C, gut für 1 Woche

Induktionsmedium

Erhaltungsmedium enthält folgende Verbindungen:

Indomethacin, Endkonzentration. 125 uM (0,125 M Lager in Ethanol, Sigma cat # I-7378). Indomethacin muss erwärmt auf 60 ° C aufgelöst werden.

Dexamethason, Endkonzentration. 2 pg / ml (2 mg / ml Socke in Ethanol, Sigma cat # D-1756)
3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), Endkonzentration. 0,5 mm (0,25 M Stammlösung in DMSO, Sigma cat # I-5879)
Rosiglitazon, Endkonzentration. 0,5 uM(10 mM Stammlösung in DMSO, Sigma cat # R-2408)

Hinweis: Stellen Sie frische Induktionsmedium jeder Zeit.

  1. Wachsen primären Adipozyten zu 95-97% Konfluenz in Vollmedium (konfluent, aber nicht zu voll)
  2. Anderer regelmäßigen Vollmedium mit Induktionsmedium (Tag 0)
  3. Nach 48 Stunden (Tag 2), ändern Sie mittel-bis Erhaltungsmedium mit Rosiglitazon (0,5 uM)
  4. Nach weiteren 48 Stunden (Tag 4), an die frische Wartung Medium mit Rosiglitazon (1 pM) für 2-3 Tage ändern. 6-7 Tage nach dem Hinzufügen des Induktionsmedium werden Zellen vollständig differenziert zu reifen Fettzellen und sind mit Öltröpfchen gefüllt. Tröpfchen etwa 3-4 Tage nach der Induktion erscheinen.

Hinweis: Ändern Medium alle 2-3 Tage, bis die Zellen vollständig differenziert.

Zellen können jetzt geerntet und mRNA-Expression von UCP1 und other braunen Adipozyten-spezifische Gene können durch qRT-PCR gemessen werden. Western Blot verwendet, um Proteine ​​zu detektieren.

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Ergebnisse

Browning von primären Adipozyten kann durch Messung mRNA-Expression von UCP1 und andere braune Fett-spezifisch oder selektiv Gene durch qRT-PCR zugegriffen werden. Präsentiert in Abbildung 1 ist Genexpressionsdaten in inguinal WAT-abgeleiteten primären Adipozyten. Die Zellen wurden induziert in der Gegenwart von zwei verschiedenen Dosen von Rosiglitazon bei 50 nM und 500 nM unterscheiden sind. Eine Untergruppe von Zellen wurde mit Forskolin bei 10 pM für 4 Stunden vor der Ernte behandelt. Dies ...

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Diskussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine zuverlässige zelluläre System, um die Entwicklung von beige / brite Zellen in primären kultivierten Adipozyten in Mäusen untersucht werden. Wie zu mehreren verfügbaren immortalisierten Zelllinien verglichen werden, ist dieses System dürfte verbesserte Relevanz für die Bräunung der weißen Fett in vivo bieten.

Obwohl die Studie dieser primären Adipozyten bietet einige Vorteile, es existieren auch einige Einschränkungen und Bedenken, die unbedingt zu be...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda und Lauren Ruiz für Diskussionen, technische Hilfe und redaktionelle Unterstützung auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DK087853), aus dem Programm für Breakthrough Biomedical Research und von Asubio Pharm Inc. SKULA wurde von einem Anteil PhD-Stipendien an der Universität von Kopenhagen und dem EU FP7 Projekt Diabat (HEALTH-F2 abgestützt -2.011-278.373) an Lise Madsen und Karsten Kristiansen. Wir erkennen auch die DERC Zentrum Zuschuss (NIH P30 DK063720).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagens
Collaginase D Roche 11088874103
Dispase II Roche 04942078001
CaCl 2
DMEM-Medium Fischer 10017-CV Mit 2,5 g / l Glukose und L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat
Insulin
T3 (3,3 ',5-Triiod-L-Thyronin) Sigma T-2877
Indomethacin Sigma I-7378
Dexamethasone Sigma D-1756
IBMX Sigma I-5879
Rosiglitazone Sigma R-2408
Ausrüstung
Kollagen beschichteten Schalen BD 354450 10 cm Platten
70 um-Filter BD Falcon 352350 Zellsieb, 70 um Nylon 1/ea

Referenzen

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Stromale vaskul re FraktionAdipozytenisolationGewebeverdauungZellplattierungInduktion der DifferenzierungUCP1 ExpressionQ RT PCR AnalyseWestern BlotRO Glitazon Behandlung

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