Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Katharina L. Dürr; Neslihan N. Tavraz; Susan Spiller; Thomas Friedrich

doi:10.3791/50201

Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in

10.3K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/50201

⸱

19. Februar 2013

Katharina L. Dürr¹^,² , Neslihan N. Tavraz¹ , Susan Spiller¹ , Thomas Friedrich¹

¹Institute of Chemistry, Technical University of Berlin, ²The Vollum Institute, Oregon Health & Science University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aktivität von K⁺-gegentransportierenden P-Typ-ATPasen durch heterologe Expression der Enzyme in Xenopus-Eizellen und Messung der Rb⁺- oder Li⁺-Aufnahme in einzelne Zellen mittels Atomabsorptionsspektrophotometrie. Die Methode ist eine empfindliche und sichere Alternative zu Radioisotopenflussexperimenten, die komplexe kinetische Studien ermöglicht.

Zusammenfassung

Während der Kationentransport durch den elektrogenen Membrantransporter Na⁺,K⁺-ATPase elektrophysiologisch gemessen werden kann, ist die elektroneutral arbeitende Magen-H⁺,K⁺-ATPase schwieriger zu untersuchen. Viele Transportassays verwenden Radioisotope, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, jedoch legen die notwendigen Sicherheitsmaßnahmen strenge Einschränkungen hinsichtlich der Exposition des Menschen oder des Assay-Designs auf. Darüber hinaus wird der Ionentransport durch Zellmembranen entscheidend durch das Membranpotential beeinflusst, das in Zellkulturen oder in Proteoliposomenpräparaten nicht ohne weiteres kontrolliert werden kann. Dabei nutzen wir die herausragende Sensitivität der Atomabsorptionsspektrophotometrie (AAS) gegenüber Spuren chemischer Elemente, um den Rb⁺- oder Li⁺-Transport durch Na⁺,K⁺- oder gastrische H⁺,K⁺-ATPase in einzelnen Zellen zu messen. Unter Verwendung von Xenopus-Eizellen als Expressionssystem bestimmen wir die Menge an Rb⁺ (Li⁺), die in die Zellen transportiert wird, indem wir Proben von Einzel-Oozyten-Homogenaten in einem AAS-Gerät messen, das mit einem quer beheizten Graphitzerstäuberofen (THGA) ausgestattet ist, der von einem Autosampler geladen wird. Da der Hintergrund der unspezifischen Rb⁺-Aufnahme in Kontroll-Eizellen oder während der Applikation von ATPase-spezifischen Inhibitoren sehr gering ist, ist es möglich, komplexe kinetische Assay-Schemata mit einer großen Anzahl von experimentellen Bedingungen gleichzeitig zu implementieren oder die Transportkapazität und Kinetik von ortsspezifisch mutierten Transportern mit hoher Präzision zu vergleichen. Da die Kationenaufnahme an einzelnen Zellen bestimmt wird, können die Flussmittelexperimente in Kombination mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemmung (TEVC) durchgeführt werden, um eine genaue Kontrolle des Membranpotentials und des Membranstroms zu erreichen. Dies ermöglichte z.B. die quantitative Bestimmung der 3Na⁺/2K⁺ Transportstöchiometrie der Na⁺,K⁺-ATPase und ermöglichte es erstmals, die Spannungsabhängigkeit des Kationentransports durch die elektroneutral arbeitende Magen H⁺,K⁺-ATPase zu untersuchen. Prinzipiell ist der Assay nicht auf K⁺-transportierende Membranproteine beschränkt, aber er kann genauso gut funktionieren, um die Aktivität von Schwer- oder Übergangsmetalltransportern oder die Aufnahme chemischer Elemente durch endozytotische Prozesse zu adressieren.

Einleitung

Wir wollten eine sensitive, sichere und kostengünstige Alternative zu radioaktiven Tracer-Experimenten entwickeln, um die spezifische Transportaktivität von ionentranslozierenden Membranproteinen zu untersuchen und so Beschränkungen bezüglich des Zugangs zu Isotopenlaboren, Sicherheitsanforderungen oder die Verwendung teurer Radioisotope zu umgehen, die - wie im Fall von Lithium - aufgrund extrem kurzer Abklingzeiten möglicherweise sogar nicht verfügbar sind. Wir waren besonders daran interessiert, die Aktivität der elektroneutral arbeitenden Magenase H⁺,K⁺-ATPase zu bestimmen, da das Enzym keinen Strom erzeugt und seine Aktivität daher nicht mit....