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Methodenartikel

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in

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DOI:

10.3791/50201

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19. Februar 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technical University of Berlin, 2The Vollum Institute, Oregon Health & Science University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aktivität von K+-gegentransportierenden P-Typ-ATPasen durch heterologe Expression der Enzyme in Xenopus-Eizellen und Messung der Rb+- oder Li+-Aufnahme in einzelne Zellen mittels Atomabsorptionsspektrophotometrie. Die Methode ist eine empfindliche und sichere Alternative zu Radioisotopenflussexperimenten, die komplexe kinetische Studien ermöglicht.

Zusammenfassung

Während der Kationentransport durch den elektrogenen Membrantransporter Na+,K+-ATPase elektrophysiologisch gemessen werden kann, ist die elektroneutral arbeitende Magen-H+,K+-ATPase schwieriger zu untersuchen. Viele Transportassays verwenden Radioisotope, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, jedoch legen die notwendigen Sicherheitsmaßnahmen strenge Einschränkungen hinsichtlich der Exposition des Menschen oder des Assay-Designs auf. Darüber hinaus wird der Ionentransport durch Zellmembranen entscheidend durch das Membranpotential beeinflusst, das in Zellkulturen oder in Proteoliposomenpräparaten nicht ohne weiteres kontrolliert werden kann. Dabei nutzen wir die herausragende Sensitivität der Atomabsorptionsspektrophotometrie (AAS) gegenüber Spuren chemischer Elemente, um den Rb+- oder Li+-Transport durch Na+,K+- oder gastrische H+,K+-ATPase in einzelnen Zellen zu messen. Unter Verwendung von Xenopus-Eizellen als Expressionssystem bestimmen wir die Menge an Rb+ (Li+), die in die Zellen transportiert wird, indem wir Proben von Einzel-Oozyten-Homogenaten in einem AAS-Gerät messen, das mit einem quer beheizten Graphitzerstäuberofen (THGA) ausgestattet ist, der von einem Autosampler geladen wird. Da der Hintergrund der unspezifischen Rb+-Aufnahme in Kontroll-Eizellen oder während der Applikation von ATPase-spezifischen Inhibitoren sehr gering ist, ist es möglich, komplexe kinetische Assay-Schemata mit einer großen Anzahl von experimentellen Bedingungen gleichzeitig zu implementieren oder die Transportkapazität und Kinetik von ortsspezifisch mutierten Transportern mit hoher Präzision zu vergleichen. Da die Kationenaufnahme an einzelnen Zellen bestimmt wird, können die Flussmittelexperimente in Kombination mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemmung (TEVC) durchgeführt werden, um eine genaue Kontrolle des Membranpotentials und des Membranstroms zu erreichen. Dies ermöglichte z.B. die quantitative Bestimmung der 3Na+/2K+ Transportstöchiometrie der Na+,K+-ATPase und ermöglichte es erstmals, die Spannungsabhängigkeit des Kationentransports durch die elektroneutral arbeitende Magen H+,K+-ATPase zu untersuchen. Prinzipiell ist der Assay nicht auf K+-transportierende Membranproteine beschränkt, aber er kann genauso gut funktionieren, um die Aktivität von Schwer- oder Übergangsmetalltransportern oder die Aufnahme chemischer Elemente durch endozytotische Prozesse zu adressieren.

Einleitung

Wir wollten eine sensitive, sichere und kostengünstige Alternative zu radioaktiven Tracer-Experimenten entwickeln, um die spezifische Transportaktivität von ionentranslozierenden Membranproteinen zu untersuchen und so Beschränkungen bezüglich des Zugangs zu Isotopenlaboren, Sicherheitsanforderungen oder die Verwendung teurer Radioisotope zu umgehen, die - wie im Fall von Lithium - aufgrund extrem kurzer Abklingzeiten möglicherweise sogar nicht verfügbar sind. Wir waren besonders daran interessiert, die Aktivität der elektroneutral arbeitenden Magenase H+,K+-ATPase zu bestimmen, da das Enzym keinen Strom erzeugt und seine Aktivität daher nicht mit elektrophysiologischen Methoden erfasst werden kann. Da Na+,K+- und H+,K+-ATPase Rb+ genauso effizient transportieren wie K+ (und auch Li+), sollte die hohe Sensitivität der AAS-Technik für Rubidium oder Lithium die empfindliche Detektion der Transportaktivität erleichtern. Atomabsorptionsspektrophotometer sind gängige Analysegeräte, die in chemischen Laboratorien weit verbreitet sind und einer großen Anzahl interessierter Wissenschaftler zugänglich sein sollten. Darüber hinaus wollten wir die Vorteile des Xenopus-Oozytenexpressionssystems nutzen, das große Einzelzellen (ca. 1,0-1,5 mm Durchmesser) verwendet, die es ermöglichen, eine bemerkenswert geringe Variabilität von Zelle zu Zelle in Bezug auf das Proteinexpressionsniveau innerhalb einer einzigen Charge zu erreichen. Eine einfache Berechnung demonstriert die Machbarkeit des AAS-Assays: Die Nachweisgrenze (charakteristische Masse) für Rubidium mit der THGA-AAS-Technik liegt bei 10 pg bzw. 1,2,10-13 mol (Rb: 85,47 g/mol), für Lithium bei 5,5 pg bzw. 7,9,10-13 mol (Li: 6,94 g/mol). Bei heterologer Expression der Na+,K+-ATPase in Xenopus-Oozyten können Pumpströme von 100 nA erreicht werden (was etwa 6,2·1011 Elementarladungen pro Sekunde oder 1,03·10-12 mol s-1 entspricht), was zu einem Transport von 6,10-6 C Ladung innerhalb von 1 min führt. Da der Transport einer Nettoladung der Aufnahme von zwei Rb+-Ionen entspricht (aufgrund der 3Na+/2K++-Stöchiometrie), entsprechen 100 nA-Strom für 1 min einer Aufnahme von 1,2·10-10 mol Rb+. Selbst bei einer 1.000-fachen Verdünnung (Homogenisierung einer Eizelle mit etwa 1 μl Volumen in 1 ml Wasser) enthält eine typische THGA-AAS-Probe (20 μl) 2,4,4,10-12 mol Rb+ (oder 204 pg), was weit über der Nachweisschwelle liegt. Daher können auch Transporter mit mehr als 100-fach geringerer Transportaktivität oder Plasmamembranexpression mit der Technik getestet werden, indem die Flusszeit des Experiments entsprechend angepasst wird.

Da die Pumpgeschwindigkeit empfindlich von der Temperatur abhängt (typische Aktivierungsenergien für Na+,K+-ATPase liegen im Bereich von 90 kJ/mol bis 130 kJ/mol1-3, was bei einer Änderung von 20 °C auf 22 °C zu einer Erhöhung der Umsatzrate um etwa 30% führt), ist es zwingend erforderlich, die Flussmessungen unter genauer Temperaturkontrolle (Klimatisierung) mit gut ausgeglichenen Pufferlösungen durchzuführen. Darüber hinaus sollten die Eizellen sorgfältig hinsichtlich ihrer homogenen Größe für die Expression eines Ionentransporters ausgewählt werden. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen ist es möglich, routinemäßig experimentelle Standardfehler von weniger als 10 Prozent mit etwa 10 Zellen pro Versuchsbedingung zu erreichen. Mit dieser Technik konnten wir z.B. die scheinbaren Rb+-Affinitäten des Kationentransports4-6, den Einfluss von extra- und intrazellulärem pH7 und den Einfluss von Mutationen von Reststoffen, die an der Kationenkoordination während des Transports beteiligt sind, bestimmen4,8. Ein Vorteil der Technik besteht darin, dass Ionenflüsse auch in Kombination mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemmung der Eizellen bestimmt werden können, was einerseits eine genaue Kontrolle des Membranpotentials während des Transports gewährleistet und andererseits die Korrelation des Ionenflusses mit dem Membranstrom ermöglicht. So war es möglich, die 3Na+/2K+ Stöchiometrie der Na+,K+-ATPase zu verifizieren (siehe beispielhafte Ergebnisse unten) und die Spannungsabhängigkeit des Kationentransports der gastrischen H+/K+-ATPase7 zu bestimmen.

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Protokoll

1. cDNA-Konstrukte und Proteinausdruck in Xenopus-Oozyten

Die cDNA des gewünschten membranständigen Proteins sollte in einen Vektor kloniert werden, der für die Expression in Xenopus laevis-Oozyten geeignet ist, wie z. B. pTLN9 oder pcDNA3.1X10. Solche optimierten Vektoren enthalten die 5'- und 3'-unübersetzten Bereiche (UTR) des Xenopus laevis β-Globin-Gens, die die multiple Klonierungsstelle (MCS) flankieren, eine RNA-Polymerase-Promotorsequenz (pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7) vor der 5'-UTR, eine Poly-A-Strecke in 3'-Richtung der MCS zur Sicherstellung der cRNA-Stabilität in Zellen sowie weiter stromabwärts eine weitere Sequenz mit Einzelschnitt-Stellen für Restriktionsendonukleasen zur Linearisierung des Plasmids, um als Vorlage für die in vitro-cRNA-Transkription zu dienen.

Um die Aktivität der überexprimierten humanen Na+/K+-ATPase (α2-Untereinheit+β1-Untereinheit) von der endogenen Na+/K+-ATPase der Oozyten zu unterscheiden, wurden die Mutationen Q116R und N127D eingeführt, um ein Ouabain-resistentes Protein mit einer IC50 im Millimolarbereich zu erhalten11. Im Fall der H+/K+-ATPase wurden Flussmessungen unter Verwendung des H+/K+-ATPase-α-Untereinheiten-Mutanten S806C durchgeführt, da Rb+-Flüsse mit kinetischen Daten aus Spannungs-Klemm-Fluorometrie-(VCF-)Experimenten korreliert waren. Die VCF-Technik (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)12 beruht auf der ortsspezifischen Anheftung eines Fluorophors an eine strategisch eingeführte Cysteinreststelle, die Konformationsänderungen des Enzyms meldet.

2. Linearisierung und Reinigung der DNA-Vorlage

  1. Zur Linearisierung der DNA-Vorlage verdauen Sie 3 μg Plasmid-DNA in einem Reaktionsvolumen von 50 μl mit 5 μl 10x-Puffer, geeignet für die verwendete Restriktionsenzyme, und 10 U Restriktionsenzym für 1 Stunde bei 37 °C.
  2. Reinigen Sie die linearisierte DNA mit dem High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Geben Sie zunächst 350 μl Bindungspuffer (enthaltend Guanidiniumisothiocyanat) in das Verdauungsgefäß. Nach diesem Reinigungsschritt ist die linearisierte DNA-Vorlage „RNA-geeignet“, da Guanidiniumisothiocyanat ein effizientes Proteindenaturierungsmittel ist und insbesondere RNasen zerstört, die häufige Kontaminanten in molekularbiologischen Laboren darstellen.
  3. Setzen Sie die Spin-Säulen in Sammelröhrchen ein, geben Sie die DNA-Lösung aus Schritt 2 auf die Säule, zentrifugieren Sie 30 Sekunden bei 13.000 x g und verwerfen Sie den Durchlauf.
  4. Geben Sie 500 μl Waschpuffer auf die Säule. Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 13.000 x g und verwerfen Sie den Durchlauf.
  5. Geben Sie 200 μl Waschpuffer auf die Säule. Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 13.000 x g, um die Säule vollständig zu trocknen.
  6. Platzieren Sie die Spin-Säule in ein frisches 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und geben Sie 50 μl nukleasefreies Wasser (Ambion Produkt # AM9937) auf die Säule. Eluieren Sie durch Zentrifugation für 1 Minute bei maximaler Drehzahl.
  7. Konzentrieren Sie die DNA-haltige Lösung nach der Elution auf etwa 15 μl. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Lösung 0,5 μg linearisierte DNA in 3 μl enthält, was die empfohlene Konzentration für die anschließende in vitro-cRNA-Transkriptionsreaktion ist.

3. In-vitro-cRNA-Synthese

  1. Wählen Sie das geeignete mMessage mMachine Kit (Ambion Produkt #1340, #1344) entsprechend der Promotorsequenz auf dem Plasmid (SP6, T7). Geben Sie in einem Gesamtvolumen von 10 μl 3 μl linearisierte DNA aus dem vorherigen Schritt und 1 μl Transkriptionspuffer zu vorportionierten 5 μl-Proben der NTP-Cap-Mischung hinzu. Die Vorportionierung der NTP-Cap-Mischung ist notwendig, um häufige Einfrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, die zur Degradation der Nukleosidtriphosphate führen könnten. Geben Sie abschließend 1 μl der geeigneten RNA-Polymerase hinzu, mischen Sie kurz und zentrifugieren Sie die Reaktionsmischung kurz.
  2. Incubieren Sie die Reaktionsmischung 1 bis 2 Stunden bei 37 °C. Die Inkubationszeit sollte 2 Stunden nicht überschreiten, da dies zu einer geringeren cRNA-Ausbeute oder -Qualität führen könnte.
  3. Geben Sie 15 μl eiskalte 3 M LiCl-Lösung aus dem Kit und 15 μl kaltes, nukleasefreies Wasser hinzu, mischen Sie kurz (nicht vortexen), zentrifugieren Sie die Probe kurz bei 11.000 × g für 10 Sekunden und lagern Sie sie mindestens 30 Minuten bei -20 °C, um die cRNA auszufällen.
  4. Kühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C vor und zentrifugieren Sie mindestens 15 Minuten bei 13.000 × g nach der Ausfällung.
  5. Entfernen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig und vollständig von dem blassbraunen Pellet am Boden des Röhrchens und geben Sie 150 μl kalte, auf -20 °C abgekühlte 70 %ige RNA-Grad-Ethanol-Lösung hinzu. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 4 °C und 13.000 × g.
  6. Entfernen Sie den Überstand vollständig und trocknen Sie das verbleibende cRNA-Pellet kurz (1–2 Minuten) im Vakuumtrockner (z. B. Eppendorf Concentrator Modell 5301) bei Raumtemperatur.
  7. Lösen Sie das Pellet in 12 μl kaltem, nukleasefreiem Wasser auf. VORSICHT: Alle nachfolgenden Schritte müssen durchgeführt werden, während die cRNA-Probe auf Eis aufbewahrt wird.
  8. Bestimmen Sie die cRNA-Konzentration mithilfe eines Spektrophotometers (z. B. Eppendorf BioPhotometer).
  9. Überprüfen Sie die Integrität der cRNA mittels Agarosegelelektrophorese. VORSICHT: Diese Kontrolle ist notwendig, da auch teilweise degradierte RNA eine von Null verschiedene UV-Absorption ergibt. Verwenden Sie für die cRNA-Elektrophorese eine gründlich gereinigte Elektrophoresekammer, die frisch mit TAE-Puffer befüllt wurde, sowie ein frisch hergestelltes 1 %ige Agarosegel. Falls eine RNase-Kontamination in der Elektrophoresekammer oder im Puffer vermutet wird, füllen Sie die Kammer zur Reinigung eine Stunde lang mit 0,1 M HCl und bereiten Sie den TAE-Puffer mit nukleasefreiem Wasser zu.
  10. Lagern Sie die cRNA bis zur Verwendung bei -20 °C. cRNA kann mindestens ein Jahr bei -20 °C gelagert werden.

4. Gewinnung von Ovarmaterial von Xenopus laevis-Weibchen durch partielle Ovariectomie

Dieses Protokoll wurde von der zuständigen staatlichen Behörde genehmigt (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, Senat von Berlin, Deutschland).

  1. Füttern Sie den Frosch mindestens 12 Stunden vor der Operation nicht, um Erbrechen zu verhindern.
  2. Bereiten Sie eine Lösung mit 2 g des Lokalanästhetikums Tricain (MS-222) in 1 L Wasser, das mit 5 mM HEPES-Puffer auf pH 7,0 eingestellt wurde. ACHTUNG: Tragen Sie stets Nitrilhandschuhe beim Umgang mit MS-222 und bereiten Sie die Lösung in einem chemischen Sicherheitsschrank zu.
  3. Legen Sie den Frosch in die Tricain-Lösung (max. 10 min), bis das Tier keine Aufstellreflexe mehr zeigt. Um die Reaktionslosigkeit zu überprüfen, drehen Sie den Frosch in Ihren Händen auf den Rücken und beobachten Sie, ob Abwehrbewegungen erfolgen.
  4. Nehmen Sie den Frosch mit der Hand aus der Tricain-Lösung und spülen Sie ihn mit kaltem Leitungswasser ab, um das Anästhetikum zu entfernen.
  5. Legen Sie den Frosch mit dem Rücken auf eine Unterlage aus Eis, die mit einem feuchten Papiertuch bedeckt ist, um Schäden an der Froschhaut durch direkten Kontakt mit dem Eis zu vermeiden. Halten Sie die Haut des Tieres während der gesamten Operation stets feucht, um Austrocknung zu verhindern. Das Auflegen auf Eis verlängert die Dauer der Anästhesie.
  6. Führen Sie mit einer scharfen Schere einen kleinen Bauchschnitt (8–10 mm Länge) entweder links oder rechts der Mittellinie des Frosches durch. ACHTUNG: Achten Sie darauf, die Seitenlinie nicht zu verletzen. Folgeeingriffe sollten abwechselnd auf den beiden Seiten erfolgen, um eine gute Regeneration des darunterliegenden Ovarialgewebes zu ermöglichen. Üblicherweise müssen drei Gewebeschichten (äußere Haut, eine dünne Schicht aus weißem Bindegewebe – die Fascia – und eine Muskelschicht) durchtrennt werden.
  7. Nach Öffnung der Bauchhöhle greifen Sie mit stumpfen Pinzetten Teile der Ovariallappen an und ziehen diese vorsichtig nach außen. Entfernen Sie als Richtwert etwa 3–5 cm Ovarialgewebe durch einen Schnitt. Bei Verletzung kleiner Blutgefäße mit Blutung üben Sie Druck mit einem sterilen Plastikstab aus oder kühlen Sie die Verletzungsstelle mit Eis, bis die Blutung gestoppt ist.
  8. Verschließen Sie den Schnitt chirurgisch mit einer Einzelnahttechnik unter Verwendung einer 4,0 Ethicon-Vicryl-Naht (Johnson & Johnson #V633H). Verwenden Sie chirurgische Instrumente zum Nähen und knoten Sie zwei bis drei Knoten entlang des Schnitts separat. ACHTUNG: Es ist wichtig, dass jeder Knoten die drei Gewebeschichten in einem Schritt vernäht.
  9. Platzieren Sie den Frosch nach der Operation in ein leicht geneigtes Wasserbecken (30 L), das gerade genug Wasser enthält, um den Boden zu bedecken, sodass die Nasenöffnungen des Tieres über dem Wasserspiegel liegen und das Atmen ermöglicht wird. Bedecken Sie das Tier während der Aufwachphase (ca. 1–2 Stunden) mit einem feuchten Papiertuch, um die Austrocknung der empfindlichen Haut zu vermeiden.
  10. Wenn das Tier wieder aktiv ist, füllen Sie das Wasserbecken auf und halten Sie den Frosch für 3–4 Tage von den anderen Tieren getrennt, um die Genesung und die Wundheilung zu überwachen.
  11. Spätestens nach der Operation sollte der Frosch für mindestens 3 Monate vor weiteren Eingriffen geschont werden, um eine vollständige Regeneration des Tieres und seines Ovarialgewebes zu ermöglichen. Als Richtwert können maximal 6–8 Eingriffe an jedem Frosch durchgeführt werden.

5. Enzymatische Isolierung einzelner Oozyten

  1. Schneiden Sie das Ovarialgewebe mit einer Schere in kleinere Stücke und überführen Sie das Gewebe in Oocyte Ringer-Lösung ohne Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4), die Kollagenase (20 mg/ml, Typ 1A aus Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) und Trypsininhibitor (10 mg/ml, Typ III-O aus Hühnereiweiß, Sigma #T2011) enthält.
  2. Schütteln Sie die Verdauungslösung 2,5 Stunden lang vorsichtig bei 18 °C. Überprüfen Sie danach im Abstand von 15 Minuten den Fortschritt der Gewebeverdauung, bis die meisten Oozyten von dem follikulären Gewebe gelöst sind.
  3. Waschen Sie die Oozyten mehrmals in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen mit Oocyte Ringer-Lösung ohne Ca2+, bis die Lösung ausreichend von Gewebetrümmern befreit ist.
  4. Lagern Sie die Oozyten in Oocyte Ringer-Lösung mit Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4) einschließlich Gentamycin (50 μg/ml) bei 18 °C.

6. cRNA-Injektion

  1. Für die Expression von Na+,K+- oder H+,K+-ATPase injizieren Sie Oozyten mit 50 nl cRNA-Lösung, die 25 ng α-Untereinheit und 5 ng β-Untereinheit cRNA enthält, unter Verwendung einer elektrisch betriebenen Nanoject-II-Injektionspumpe (Drummond Scientific Inc.) und 3,5" Hämatokrit-Röhrchen (Drummond #3 000-203-G/X). VORSICHT: Die Menge an mRNA kann je nach Zielprotein variieren und möglicherweise durch Western Blotting angepasst werden müssen, um eine maximale Expression zu erreichen.
  2. Für jede Flussbedingung (z. B. bei einer bestimmten Rb+-Konzentration) injizieren Sie 18–22 Oozyten. Davon werden 50 % unter „+Fluss“-Bedingungen (z. B. einer bestimmten Rb+-Konzentration) und 50 % unter „−Fluss“-Bedingungen (z. B. mit der gewählten Rb+-Konzentration und einem spezifischen Enzyminhibitor in sättigender Konzentration, wie 10 mM Ouabain für die Na+,K+-ATPase oder 10 μM SCH28080 bei pH 5,5 für die H+,K+-ATPase) analysiert.
  3. Nach der Injektion überführen Sie die Oozyten einzeln in 96-Well-Platten, die zur Hälfte mit Oozyten-Ringer-Lösung mit Ca2+ und 50 μg/ml Gentamycin bei 18 °C gefüllt sind.
  4. Bedecken Sie die 96-Well-Platte mit Parafilm, um übermäßige Verdunstung zu verhindern.
  5. Inkubieren Sie die Oozyten 2–7 Tage (abhängig vom Protein von Interesse) bei 18 °C. Falls eine Lagerung der Oozyten länger als 3 Tage erforderlich ist, wird empfohlen, das Inkubationspuffermedium in den Mikrowells alle 3 Tage auszuwechseln.
  6. Für jeden Satz von Flussdaten (z. B. ein [Rb+]-Titrationsversuch) sollten etwa 10 nicht injizierte (oder mit 50 nl nukleasefreiem Wasser injizierte) Kontroll-Oozyten unter „+Fluss“- und „−Fluss“-Bedingungen analysiert werden. Inkubieren Sie daher eine ausreichende Anzahl von Kontrollzellen genauso wie die mit cRNA injizierten Oozyten vor der Flussanalyse.

Pretreatment von heterolog exprimierenden ATPase-Oozyten

Na+-Ladeverfahren

Für funktionelle Messungen der Na+/K+-ATPase ist es wichtig, die intrazelluläre Na+-Konzentration zu erhöhen13, und zwar wie folgt:

  1. Überführen Sie die Oozyten für 45 min auf Eis in den Na+-Lade-Puffer (110 mM NaCl, 2,5 mM Natriumcitrat, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4).
  2. Zur anschließenden Erholung inkubieren Sie die Oozyten für mindestens 30 min auf Eis im Post-Loading-Puffer „PLB“ (100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM BaCl2, 5 mM NiCl2 und 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4).
  3. Lagern Sie die Oozyten bis zur Verwendung auf Eis im PLB.

7. Vorblockade der endogenen Na+,K+-ATPase

ACHTUNG: Da Xenopus-Oozyten eine endogene Na+,K+-ATPase exprimieren, ist es wichtig, diese endogene Pumpe vor Rb+-Flux-Experimenten zu blockieren, und zwar wie folgt:

  1. Blockieren Sie nun die endogene Na+,K+-ATPase, indem Sie die Oozyten 15 min bei Raumtemperatur in Post-Loading-Puffer mit 100 μM Ouabain inkubieren.

8. Elektrophysiologie

  1. Stellen Sie Mikroelektroden her, indem Sie Borosilikat-Kapillaren (GB150F-8P, Science Products GmbH) mit einem zweistufigen Mikropipettenzug (Modell PC-10, Narishige) ziehen.
  2. Füllen Sie die Glaselektroden von hinten mit 3 M KCl. Für TEVC-Experimente mit der H+,K+-ATPase empfehlen wir stattdessen 3 M NaCl zu verwenden, was zu stabileren Stromaufnahmen führte. Befestigen Sie die Pipette über dem Ag/AgCl-Draht der Mikroelektrodenhalter der Zwei-Elektroden-Spannungs-Klemmanordnung.
  3. Platzieren Sie die Glasmikroelektroden und zwei Agarbrücken (diese sollten mit NaCl/Agar anstelle des üblicherweise verwendeten KCl/Agar hergestellt werden), die die Ag/AgCl-Referenzelektroden mit der Badlösung verbinden, in die Aufnahmekammer (Warner Instr., Modell RC-10), die vorab mit Messpuffer (z. B. PLB mit 10 μM Ouabain für Na+,K+-ATPase) gefüllt ist.
  4. Schalten Sie den Spannungsverstärker (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Deutschland) in den „OFF“-Modus.
  5. Überprüfen Sie den Widerstand jeder Glaselektrode einzeln (beide sollten im Bereich von 0,5–2 MΩ liegen).
  6. Überprüfen Sie die Offset-Potentiale der Spannungs- und Strom-Elektrode auf der entsprechenden Anzeige des TEVC-Verstärkers. Falls Abweichungen von Null bestehen, stellen Sie das Offset mit den entsprechenden Offset-Reglern des Verstärkers ein.
  7. Platzieren Sie ein Oozyt in die Mitte der Kammer und penetrieren Sie vorsichtig die Membran mit der Strom- und der Spannungselektrode.
  8. Überprüfen Sie die Potentialanzeige des Verstärkers. Der angezeigte Wert für das Potential der Spannungselektrode entspricht nun dem Ruhepotential der Zelle.
  9. Schalten Sie den Verstärker in den VC-Modus (Spannungsklemmung).
  10. Spannen Sie die Zelle mithilfe der pCLAMP-Software (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) auf ein vordefiniertes Membranpotential. Dies kann entweder der Wert des zuvor gemessenen Ruhepotentials (zur Aufnahme unter Bedingungen ohne Membranstrom) oder ein beliebiger gewünschter Testpotentialwert sein. Achten Sie auf Amplitude und Stabilität des Leckstroms (in Abwesenheit von K+/Rb+/Li+), der als allgemeine Richtlinie bei -30 mV nicht über -200 nA hinausgehen sollte.
  11. Spülen Sie das Oozyt für eine bestimmte Zeit (z. B. 3 min für Na+,K+-ATPase) mit einer Rb+-haltigen Lösung (zur Erzielung eines maximalen Stroms verwenden Sie sättigende Konzentrationen aus Flussmessungen unter nicht-geklemmten Bedingungen) und nehmen Sie den Pumpstrom mit der pCLAMP-Software im kontinuierlichen Aufnahmemodus auf. Stellen Sie sicher, dass die Rb+-Aufnahme anschließend vollständig gestoppt wird, indem Sie die Zelle 30 Sekunden lang mit einer Rb+-freien Lösung spülen.
    1. Beenden Sie das Zwei-Elektroden-Spannungsklemmexperiment, entfernen Sie das Oozyt aus der Aufnahmekammer und fahren Sie mit Schritt 4 des Abschnitts „Rb+-Aufnahmeexperimente“ fort, um die Rb+-Aufnahme mittels Atomabsorptionsspektrophotometrie zu analysieren.
  12. Führen Sie eine Offset-Stromsubtraktion durch und werten Sie das Zeitintegral des Pumpstroms mit dem Clampfit-Programm des pCLAMP-Pakets aus.

9. Rb+-Aufnahmemessungen

  1. Schneiden und schmelzen Sie die gelbe Pipettenspitze einer 200-μl-Pipette auf einen Durchmesser von etwa 2 mm. Die Verwendung solcher Spitzen gewährleistet eine minimale Lösungsübertragung, wenn die Oozyten zwischen Inkubations- oder Waschgefäßen bewegt werden. Erhitzen Sie die Spitze kurz mit der Flamme eines Taschenfeuerzeugs. Dieser Polierschritt verhindert Schäden an den Oozyten.
  2. Bereiten Sie für jedes zu messende Oozyt ein 1,5-ml-Eppendorf-Gefäß vor, das mit 1 ml Millipore-Wasser gefüllt ist. Stellen Sie drei Petrischalen mit Rb+-freiem Waschpuffer (z. B. PLB) und eine mit Millipore-Wasser bereit.
  3. Überführen Sie fünf vorinkubierte Oozyten gleichzeitig in eine 3,5 cm große Petrischale, die mit Rb+-Flusspuffer (Konzentrationen von 0 bis 15 mM Rb+) gefüllt ist, und inkubieren Sie 3 min (Na+,K+-ATPase) oder 15 min (H+,K+-ATPase) unter Temperaturkontrolle (z. B. 21 °C in einem klimatisierten Raum oder auf einer Heizplatte).
  4. Überführen Sie die Oozyten gleichzeitig in die erste Schale mit Rb+-freiem Waschpuffer (im Fall der Na+,K+-ATPase kann PLB verwendet werden). Es ist zwingend erforderlich, dass die Abweichungen zwischen den Inkubationszeiten kleiner als 5 Sekunden sind. Spülen Sie vorsichtig aus.
  5. Bewegen Sie die Oozyten in die zweite und dritte Schale mit Rb+-freiem Waschpuffer und spülen Sie vorsichtig aus.
  6. Überführen Sie die Oozyten in die Schale mit Millipore-Wasser und spülen Sie vorsichtig aus.
  7. Überführen Sie jedes Oozyt einzeln in eines der vorbereiteten Eppendorf-Gefäße, die mit 1 ml Millipore-Wasser gefüllt sind.
  8. Homogenisieren Sie das Oozyt, indem Sie mit einer 200-μl-Pipettenspitze mehrmals auf- und abpipettieren, bis die Lösung gleichmäßig trüb ist.

10. Vorbereitung des AAnalyst 800 unter Verwendung des THGA-Ofensystems

  1. Schalten Sie das Ventil des erforderlichen Inertgases (Argon) ein und setzen Sie eine geeignete Hohlkathodenlampe (Einzelelement-HKLs für Li+ oder Rb+; Photron, Melbourne, Australien) in eine beliebige Sockelposition ein.
  2. Starten Sie die WinLab32-Steuerungssoftware (Perkin Elmer) und schalten Sie die entsprechende Hohlkathodenlampe ein. Perkin Elmer Lumina-Hohlkathodenlampen werden automatisch erkannt und erscheinen in der Auswahlliste. Nicht kompatible Hohlkathodenlampen müssen manuell eingegeben werden.
  3. Geben Sie eine Aufwärmzeit von etwa 10–15 Minuten für die Stabilisierung der Lampen vor.
  4. Stellen Sie durch visuelle Inspektion sicher, dass sich die THGA-Röhre (querbeheizte Graphit-Atomisator-Röhre, Perkin Elmer, #B3000641) in gutem Zustand befindet. THGA-Öfen sollten nach etwa 300 Schüssen ausgetauscht werden (angegebene durchschnittliche Lebensdauer des Herstellers), können aber oft eine größere Anzahl von Proben verarbeiten.
  5. Wählen Sie die Methode „THGA-Ofen“ in WinLab32 aus.
  6. Bereiten Sie mindestens fünf Kalibrierproben mit Rb+/Li+-Konzentrationen zwischen 10 und 50 μg/L (z. B. durch geeignete Verdünnung aus einer 1 M RbCl- oder LiCl-Lösung) sowie eine Blindprobe ausschließlich mit Millipore-Wasser vor. Hinweis: Die Salze sollten von höchster verfügbarer Reinheit sein („puriss.“ oder aus kommerziell erhältlichen Kalibrierstandards für AAS-Zwecke).
  7. Wählen Sie die geeignete Initialisierungsdatei (sogenannte „Methode“-Datei, die einen Verweis auf Kalibriermparameter enthält und die Geräteeinstellungen lädt, z. B. die AAS-Detektionswellenlänge; die Wellenlängen für Rb+ und Li+ betragen jeweils 780 nm und 670,8 nm) aus und geben Sie die Positionen und Konzentrationen der Kalibrierproben ein. Wählen Sie hierfür den geeigneten Probengeber (Probenhalter mit 88 oder 148 Probennestern für das AAnalyst 800-Gerät).
  8. Messen Sie die Kalibrierkurve.
  9. Überführen Sie nun jeden Oozyten-Homogenat in einzelne 1,2-ml-Polypropylen-Probenbecher (Perkin Elmer, #B0510397) und stellen Sie diese Probenröhrchen in die Probengeber-Schale.
  10. Erstellen Sie eine Probendatei zur Identifizierung der Proben in den Positionen des Probengebers, stellen Sie das Probenvolumen auf 20 μl ein und starten Sie das Gerät.
  11. Nach Abschluss des Durchlaufs (oder während der visuellen Kontrolle stündlich bei langen Probenreihen) überprüfen Sie, ob bei einzelnen Proben die gemessene Menge an Rb+ das Maximum der Kalibrierkurve überschreitet. Falls ja, verdünnen Sie die entsprechenden Proben angemessen und messen Sie sie erneut.

11. Hinweise zur Messung großer Probenmengen (über 50)

  • Für einen Übernachtbetrieb des Instruments wird empfohlen, das Reservoir des Autosamplers mit Millipore-Wasser zu füllen, um die Verdunstung der Homogenate in den Reagenzgläsern zu verhindern.
  • Es wird empfohlen, zwischen jeweils 20 Proben ein Reagenzglas mit 2 % HNO3 zu platzieren, um ein Verstopfen der Injektionskapillare des Autosamplers zu verhindern.

Empfohlenes THGA-AAS-Temperaturprotokoll für Rubidium

SchrittTemperatur (°C)Aufheizdauer (Sek)Haltezeit (Sek)Argon-Gasfluss (ml/min)
Trocknen 1110120250
Trocknen 2130530250
Pyrolyse300-6001020250
Atomisierung1700-1800050
Reinigung240012250

Empfohlenes THGA-AAS-Temperaturprotokoll für Lithium

SchrittTemperatur (°C)Aufheizzeit (Sek)Haltezeit (Sek)Argon-Gasfluss (ml/min)
Trocknung 1110130250
Trocknung 21301530250
Pyrolyse9001020250
Atomisierung2200050
Reinigung245013250

Datenanalyse

  1. Berechnen Sie für jede Messbedingung die mittlere Rb+-Aufnahme. Das AAS-Spektrophotometer liefert Werte in μg/L, die in pmol/Oozyte/Min umgerechnet werden müssen.
  2. Subtrahieren Sie für kinetische Analysen (scheinbare KM-Werte) die Hintergrund-Rb+-Aufnahme, die von nichtinjizierten Kontroll-Oozyten derselben Charge bei gegebener RbCl-Konzentration bestimmt wurde, von den Messwerten.
  3. Erstellen Sie eine Darstellung mit der Origin-Software und passen Sie eine Hill-Funktion Hill-Gleichung Formel; biochemische Kinetik-Diagramm; Bindungsaffinitätsanalyse; Enzym-Substrat oder eine Michaelis-Menten-Funktion Enzymkinetik-Gleichung; Formel A = Amax[S]/(K0,5 + [S]); biochemisches Konzept an die Daten an. In diesen Gleichungen steht [S] für die Substratkonzentration, nH für den Hill-Koeffizienten und K0.5 für die Substratkonzentration, die für eine halbmaximale Aktivierung erforderlich ist.

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Ergebnisse

Die Quantifizierung der Rb+-Aufnahme durch K+- (oder Rb+)-gegenverkehrende P-Typ-ATPasen mittels AAS im Xenopus-Oozyten-Expressionssystem ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung der enzymkinetischen Parameter.

Bestimmung der Transportstöchiometrie der Na+/K+-ATPase

Für die elektrogenische Na+/K+-ATPase können Rb+-Flüsse in Zwei-Elektroden-Spannungs-Klammer-Experimenten best...

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Diskussion

Die beschriebene Methode zur Messung der Menge an Rb+ (oder Li+), die in einzelne Xenopus-Eizellen aufgenommen wird, die Na+,K+- oder H+,K+-ATPase exprimieren, hat sich als vielseitige, flexible und genaue Technik zur Bestimmung der kinetischen oder thermodynamischen Transportparameter für kationenausgleichende P-Typ-ATPasen1,4,5,7,8 erwiesen. Es ist eine sichere und zuverlässige Alternative zu radioaktiven Tracer-Fluss-Assays und ermög...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Ernst Bamberg (Max-Planck-Institut für Biophysik, Frankfurt, Deutschland) für die großzügige Unterstützung in der Anfangsphase der Methodenentwicklung, Kazuhiro Abe (Kyoto University, Japan) für zahlreiche fruchtbare Diskussionen und Dr. Michael Kohl (Analytik-Service, Woltersdorf, Deutschland) für die technische Unterstützung. Die Autoren danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Förderung durch den Exzellenzcluster "Unifying Concepts in Catalysis"), der auch die Perkin Elmer AAnalyst 800-Apparatur (SFB 498) finanziert hat.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4.0 Ethicon Vicryl NahtmaterialJohnson JohnsonV633H
Kollagenase Typ 1A aus Clostridium hystolyticumSigma AldrichC9891
High-Pure PCR Product Purification KitApplied Science11732676001
Nukleasefreies WasserAmbionAM9937
mMessage mMachine Kit SP6/ T7Ambion1340, 1344
Ouabain OctahydratSigma AldrichO3125
Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz)Sigma AldrichA5040
Trypsin-Inhibitor Typ III-O aus HühnereiweißSigma AldrichT2011
SCH28080Sigma AldrichS4443
AAnalyst 800Perkin Elmer0993-5256
WinLab32TMPerkin Elmer
BioPhotometerEppendorf6131 000.012
Borosilikat-KapillarenWissenschaft ProdukteGB150F-8P
Hämatokrit-Röhren 3,5"Drummond Scientific3 000-203-G/X
Hohlkathodenlampe LithiumPhotronP929LL
Hohlkathodenlampe RubidiumPhotronP945
Mikropipettenabzieher NarishigeModell PC-10
Eizellaufnahmekammer RC-10Warner Instr.W4 64-0306
Nanoject II InjektionspumpeDrummond Scientific3-000-204
pCLAMP softwareMolecular Devices
Polypropylen Probenbecher (1,2 ml)Perkin ElmerB0510397
Speedvac - Konzentrator Modell 5301Eppendorf5301 000.210
THGA TubePerkin ElmerB3000641
Turbo TEC-10CX VerstärkerNPI ElektronikTEC-10CX
Roche

Referenzen

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