Angiogenese im ischämischen Rat Lung

Zusammenfassung

Die Lunge wird sowohl durch die systemische bronchiale Arterie und Lungenarterien perfundiert. In den meisten Lunge Pathologien, ist es umso kleiner systemische Gefäßsystem, die robust Neovaskularisierung zeigt. Einstellung der pulmonalen Blutfluss fördert regen bronchiale Angiogenese. Wir bieten chirurgische Details zu induzieren linken Lungenarterie Ischämie, die bronchiale Neovaskularisation fördert.

Zusammenfassung

Das adulte Lunge wird sowohl durch die systemischen Arterie bronchiale und der gesamten venösen Rückstrom Durchströmen der Lungenarterien perfundiert. In den meisten Lunge Pathologien, ist es umso kleiner systemische Gefäßsystem, die einen Bedarf an verbesserten Lungenperfusion reagiert und zeigt robuste Neovaskularisation. Pulmonalen vaskulären Ischämie durch Lungenarterie Obstruktion induziert wurde gezeigt, dass im schnellen systemischen arteriellen Angiogenese im Menschen sowie in mehreren Tiermodellen führen. Obwohl die histologische Beurteilung des zeitlichen Verlaufs der bronchialen Arterie Proliferation in Ratten wurde sorgfältig von Weibel ¹ beschrieben, sind Mechanismen, die für diese organisierte Wachstum neuer Gefäße nicht klar. Wir bieten chirurgische Details zu induzieren linken Lungenarterie Ischämie bei der Ratte, die bronchiale Neovaskularisation führt. Quantifizierung des Ausmaßes der Angiogenese stellt eine zusätzliche Herausforderung aufgrund der Anwesenheit der zwei Gefäßbetten innerhalb der Lunge. Methodenum funktionelle Angiogenese von markierten Mikrokügelchen Injektionen zu bestimmen sind.

Einleitung

Systemische Angiogenese in der Lunge ist gut erkannt. Bei Krankheitszuständen wie Asthma ^2, interstitielle Lungenfibrose ^3, Krebs ⁴ und chronischer pulmonaler Thromboembolie ^5, die systemische Gefäßsystem in und rund um die Lunge proliferiert und dringt Lungenparenchym. Allerdings sind Tiermodelle diese differentielle Aktivierung der systemischen anstatt den Lungenkreislauf zu studieren wenige. Vielleicht ist die am besten reproduzierbare Modell systemische Neovaskularisierung in der Lunge des erwachsenen Säuger, was auftritt, nachdem Induzieren chronischer Ischämie Lungenarterie. Die Reaktion auf linken Lungenarterie Obstruktion beim Menschen ^5-7, Hunde ^{8, 9} ist Schweinen, Schafen ^{10, 11} Meerschweinchen, Ratten ^{1, 12, 13, 14} und Mäusen die rasche Vermehrung der Arterie bronchiale sowie interkostalen Arterien. Die Mechanismen, die für die systemische neovascularisierung der Lunge nach pulmonalen Ischämie sind weitgehend unbekannt und wurden nicht umfassend untersucht. Der zeitliche Verlauf der bronchialen Angiogenese in der Ratte nach der linken Lungenarterie Obstruktion wurde sorgfältig in der Arbeit von histologischen Weibel ¹ beschrieben. Erweiterung dieser Arbeit in der Ratte hat sich unser Labor auf beiden Wachstumsfaktoren wichtig in diesem Prozess sowie die physiologischen Ergebnis dieser Neovaskulatur in der Lunge konzentriert. Die Ergebnisse zeigen die CXC-Chemokin CINC-3 früh nach Ischämie und Behandlung von Ratten mit einem neutralisierenden Antikörper gegen CXCR2 erhöht ist, dämpft der Rezeptor für CINC-3, Angiogenese ^13. Die neu eingerichtete bronchiale Vaskulatur 14 Tage nach dem Einsetzen der pulmonalen Ischämie wurde gezeigt, dass abnormale Protein mit erheblich erhöhter Permeabilität ^15. Linken Lungenfunktion nicht normal war showing verringerte Diffusionskapazität und eine Abnahme Lungenvolumen ^15. Obwohl die Neovaskulatur können contributed zum Erhalt von Lungengewebe bei chronischer pulmonaler Ischämie, erscheint es nicht normal zu sein und kann auf eine anhaltende Abnahme der Lungenfunktion bei.

Vielleicht ist einer der merkwürdigsten Aspekte dieses Modells bezieht sich auf die räumliche Verteilung der proliferierenden Blutgefäße. Trotz der Freisetzung von Wachstumsfaktoren im Lungenparenchym durch Ischämie stammt das Neovaskulatur in relativ großen stromaufwärts Bronchialarterien. Die normale bronchiale Arterie entsteht so einem kleinen Zweig aus der Aorta und dringt in die Atemwege Baum am carina. So der Mechanismus, durch den Wachstumsfaktoren induzieren die Anfangsphase der Arteriogenese ist nicht klar. Wir schlagen vor, dass die Ratte mit einem Gefäßanatomie ähnlich wie beim Menschen, bietet eine einzigartige Gelegenheit, um die Mechanismen, die für die systemische Angiogenese während pulmonalen Ischämie zu studieren. Obwohl komplette Obstruktion der linken Lungenarterie ist ein seltenes Ereignis in der menschlichen Subjekte,erhöhte bronchiale Vaskularität scheint ähnlich bei Patienten induziert werden unabhängig von der Lage und Größe der Lungenarterie Behinderung ^16. Somit stellen wir eine detaillierte Beschreibung der chirurgischen Ansatz zur linken Lungenarterie bei Ratten und ein Mittel, um die Größe der Angiogenese quantifizieren ligieren.

Protokoll

Alle Protokolle an Ratten durchgeführt wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Use Committee und im Einklang mit NIH-Richtlinien zugelassen. Wenn möglich, sollte das Tier chirurgisch präpariert in einem Bereich getrennt von dem chirurgischen Gebiet zu Kontamination des chirurgischen Stelle zu minimieren.

Ein. Anästhesie / Schmerztherapie

1. Ort Ratte (Sprague Dawley männlichen Ratten, 125-150 g; Harlan, Indianapolis, IN) in einer Ansaugkammer mit 3% Isofluran infundiert.
2. Zeigen narkotisierten Ratte über Chirurgie Bord an Bugspitze und Ventilator mit 3% Isofluran Narkose. Verwenden Sie sterile Technik für alle Verfahren. Hängen Ratte sterile OP-Feld zu gewährleisten.

2. Intubation

1. Immobilisieren Anhängsel in Rückenlage mit chirurgischen Band.
2. Entfernen Ratte aus Nasenkonus, erweitern Zunge mit gepolsterten Zange.
3. Verwenden Sie 14 gauge intracath mit abgestumpften Metall Stilett als Guide. Schieben hinter denNgue in Luftröhre.
4. Entfernen Metall Stilett verlassen weißem Kunststoff intracath in der Luftröhre. Sicherstellen, dass die Ratte atmet und die Luft wird durch das Rohr fließt.
5. Ersetzen Nasenkonus mit direktem Adapter Katheters verbinden Ratte zu Beatmungsgerät (90 Atemzüge / min; 8 ml / kg Atemzugvolumen; Nager Ventilator Modell 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts).
6. Bewerben Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) Veterinär-Salbe auf die Augen.

3. Thorakotomie

1. Ort rat rechten Seite nach unten, immobilisieren Anhängsel mit chirurgischen Band.
2. Shave linken Brustkorb-Bereich.
3. Entfernen Sie überschüssiges Fell mit kleinen Vakuum.
4. Machen sterilen Bereich durch Abwischen mit Alkohol durch Povidon-Jod swabstick (Dynarex Corporation, Orangebur, NY) gefolgt. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male (für insgesamt drei Peelings).
5. Machen Querinzision mit steriler Präparierscheren oder sterilen Skalpell in der Mitte des Feldes.
6. Blunt sezieren durch layers von Gewebe und Fett auf Rippen (letzte Schicht ist dünn Membran, die Rippen).
7. Graf Rippen 3 ^rd Interkostalraum bestimmen.
8. Mit einer sterilen 45 ° Graefe Pinzette machen stumpfen Schnitt zwischen ^3. und 4 ^th Rippe.
9. Legen Sie Rippe Separatoren, ziehen Sie vorsichtig die Schaffung offener Hohlraum mit voller Visualisierung von Lunge, statt Klebeband auf Nähte offen zu halten.

4. Left Pulmonary Artery Ligation

1. Mit 90 ° Graefe Pinzette bewegen linken Lunge wieder mit der rechten Hand.
2. Mit Dumont Muster # 5 gerade Pinzette greifen linken Lungenarterie und Atemwege mit der linken Hand. Linken Lungenarterie wird auf der Oberseite der Atemwege verlegen. Stellen Sie sicher, dass Pinzette direkt senkrecht auf den Tisch. Zusätzlich ist es am effektivsten, holen die linken Lungenarterie / linken Hauptbronchus am meisten distalen Position (am nächsten an Parenchym). Drücken Sie die Belüftung der linken Lunge beiseite mit dieser linken Hand manövrieren.
3. Verwenden DumontMuster Nr. 5 45 ° gebogenen Pinzette, um den linken Lungenarterie von den linken Hauptbronchus an ihrer natürlichen Grenzen trennen. Diese Trennlinie wird dünn und weiß zwischen den beiden einzelnen Strukturen.
4. Trennen Sie direkt unter Arterie ohne Umweg über das Schiff, sanft gleiten die Pinzettenspitzen zusammengehalten entlang der Trennung.
5. Weiter, bis die Spitzen der Pinzette sichtlich der linken Lungenarterie und die linke Hauptbronchus getrennt haben. Nur ein kleiner Punkt der Spitze muss vollständig durch sein. Wenn Blut auf der Spitze der Zange visualisiert werden, dann ist es nicht vollständig durch und Ligation nicht versucht werden. Sobald durch den Raum, wird die linke Pulmonalarterie auf der Kurve der Zange zu legen. In dieser Stellung halten.
6. Lösen Sie vorsichtig gerade stumpfen Pinzette Griff (links) und greifen Stück von einem Pre-Cut Naht (~ 2-3 Zoll, Polypropylen Nahtgröße 6-0; Myco Medical, Cary, NC).
7. Öffnen gebogenen Pinzette wiegte linken Lungenarterie und grab Naht. Ziehen Nahtmaterial durch den Raum zwischen der linken Lungenarterie und linken Hauptbronchus in einer Aufwärtsbewegung relativ zu der Kurve der Zange.
8. Binden Sie Verschließen der linken Lunge mit einem quadratischen Knoten, sorgfältig snip Rest des Fadens.
9. Schließen Rippen mit stumpfen Pinzette Rippe und Faden zweimal zu halten mit Polypropylen (blau Monofilament) Größe 4-0 an einem 19 mm, 3/8 Kreis umgekehrter Schneiden Nadel (Myco Medical, Cary, NC) in einer Gefäßklemme, man aufpassen, nicht Naht der Haut (nur Rippen).
10. Füllen Sie eine lockere Kreuzknoten, blasen die Lunge, am positiven endexspiratorischen Druck (PEEP; 2-5 cmH ₂ O), hyperinflate Lungenkrebs dann sicher Knoten fest und eine weitere volle Knoten vor Schnippeln Rest des Fadens. Entfernen PEEP und visualisieren für 30 Sek., um sicherzustellen, dass die Lunge nicht zusammenfällt. Bewerben 5 Tropfen Bupivacain (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).
11. Schließen Haut, indem Gewebekleber auf Wunde und drücken Haut zusammen mit Back end Wattestäbchen. Geben Bupivacain (2,0 mg / kg subkutan) an der Stelle des Einschnitts anschließend alle 8 Stunden für 24 Stunden oder bis das Tier wieder in den normalen Aktivität. Da die subkutane Schicht in diesem Bereich sehr dünn ist, ist es nicht einfach auf eigenen vernähen. Wenn der Gewebekleber aufgetragen wird und die Haut wird zusammen schob es schließt auch die subkutane Schicht.
12. Schalten Sie Isofluran-Gas, aber weiterhin die Ratte für 1-2 min bei Raumluft bis freiwillige Bewegung kehrt zu lüften. Trennen Sie das Trachealtubus vom Beatmungsgerät und sicherzustellen, dass die Ratte spontan atmenden bevor Sie sie entfernen.
13. Wischen Sie Puralube von Augen mit Wattestäbchen und Monitor-Bewegung und Erholung. Inject Buprenorphinhydrochlorid (0,05 mg / kg intraperitoneal, Butler Schein, Dublin OH). Weiter Lieferung analgetische alle 12 Stunden für 48 Stunden nach der Operation.

5. Linke Halsschlagader Kanülierung

Um die Größe der bronchialen perfus beurteilenIonen des ischämischen linken Lungenflügel an gewünschten Zeitpunkten nach linken Lungenarterie Ligation injizieren markierten Mikrokügelchen durch die linke Arteria Carotis in den Aortenbogen. Bereiten Ratten wie oben 1-2.

1. Cut Mittellinie entlang Hals, stumpf sezieren Luftröhre und linke Halsschlagader (Mikrosphären an der Injektionsstelle) offenbaren.
2. Legen Katheter mit heparinisierter Kochsalzlösung, stumpfen Spitze PE20-Schlauch (Becton Dickinson, Sparks MD) in den Behälter verbunden zu 25 g Nadel, 4-Wege-Hahn, 1 ml Spritze gefüllt.
3. Ort Flasche Mikrokugeln (15 um hochrot Polystyrol fluoreszierenden Mikrokugeln, 1 x 10 ⁶ Kügelchen / ml; Invitrogen, Eugene, OR) in Wasser Sonicator während 30 sek.
4. Entfernen Flasche, Wirbel und erarbeiten 0,5 ml (500.000 Mikrosphären) in eine 1 ml Hamilton Glasspritze (Hamilton Company, Reno, NV) durch eine 20 g Nadel.
5. Bringen Hamilton Spritze 4-Wege-Hahn und ziehen Mikrosphären mit Spritzenpumpe (Rate: 500 ul / min; Genie Plus, Kent Scientific, Torringtauf, CT).
6. Entfernen Hamilton-Spritze und Spülvorrichtung mit 1 ml Kochsalzlösung heparized bei 500 pl / min.
7. Führen voller Brust Thorakotomie und exsanguinate die Ratte durch Abtrennen der unteren Hohlvene.
8. Entfernen Sie die linke Lunge und anderen Geweben von Interesse.
9. Um Mikrosphären aus Gewebe extrahiert, nehmen die gesamte linke Lunge der Ratte nach Ausbluten und es in 2 M KOH (4-6 ml). In einem 55 ° C Wasserbad und lassen Sie über Nacht für Tissue Verdauung. Fügen Tween 80 (0,25%), um die Perlen zu waschen, Vortex (10 sec) und Zentrifuge (2.000 UpM, 20 ° C für 10 min). Entfernen Sie den Überstand, fügen 2-Ethoxyethylacetat (1 ml), Vortex und lassen Sie stehen für 1 Stunde. Vortex die Suspension und dann zentrifugiert (2000 rpm; (20 ° C für 10 min) Entfernen Sie die 2-Ethoxyethylacetat wässrige Schicht, die die Fluoreszenz in einer Küvette und messen unter Verwendung eines Hitachi F-2500 Fluoreszenz-Spektralphotometer (Anregung 612/emission 618. ; Digilab, Holliston, MA).

Ergebnisse

Vaskuläre Druckguss: Ergebnisse der Wirkungen der linken Lungenarterie Ischämie in der Ratte sind in Abbildung 1 dargestellt. Dargestellt ist ein Methacrylat Besetzung der Bronchien Gefäßsystem und das umfangreiche Vaskularität des linken Atemwege Baum 28 Tage nach lpal. Um dieses gegossenen erhalten, wurde die systemische Gefäßsystem mit einer Methacrylat-Gemisch (rot) injiziert, retrograd in der absteigenden Aorta und die Trachea kanüliert wurde injiziert und mit einem weißen Silizium basierendes Mate...

Diskussion

Linken Lungenarterie Ligation in allen untersuchten Spezies führt zu robusten systemische Neovaskularisation des ischämischen Lunge. Wir haben die Details des chirurgischen Ansatz in einem Ratten-Modell dargestellt. Unsere Ergebnisse durch vaskuläre Gießen, Histopathologie produziert und in vivo-Markierung zeigen, dass Bronchialarterien proliferieren und die Lungenparenchym perfundieren. Somit können die Mechanismen der bronchialen Angiogenese in einem Tiermodell, das den menschlichen Zustand chronischer pulmon...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien:	Firma
Buprenorphinhydrochlorid, Puralube	Butler Schein
Bupivacain	APP Pharmaceuticals
Povidon-Iod swabstick	Dynarex Konzern
Polypropylen Nahtgröße 6-0, 3/8 Kreis schneidender Nadelkörper	Myco Medical
PE20 Schlauch	Becton Dickinson
15 um Crimson Polystyrol Fluorospheres	Invitrogen
1 ml Hamilton Glasspritze	Hamilton Company
Ausstattung:
Genie Plus-Spritzenpumpe	Kent Scientific
Fluoreszenz-Spektralphotometer	Digilab
Rodent Ventilator Modell 683	Harvard Apparatus
			Tabelle 1. Tabelle spezifische Reagenzien und Ausrüstung.