Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

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Methodenartikel

Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis

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DOI:

10.3791/50305

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18. März 2013

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Technik, die von Mikrodissektion Fluoreszenzfarbstoff Injektion in den akustischen Ganglion frühen Hühnerembryonen zur selektiven Rückverfolgung von auditorischen Axon Fasern im Nerv und Rautenhirn gefolgt.

Zusammenfassung

Die embryonale Küken ist ein weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der peripheren und zentralen Ganglienzellen Projektionen. Im auditorischen System würde selektive Markierung von auditiven Axone innerhalb des VIII. Hirnnerven verbessern das Studium der zentralen auditorischen Schaltungsentwicklung. Dieser Ansatz ist schwierig, weil mehrere Sinnesorgane des Innenohrs der VIII. Nerven ¹ beitragen. Darüber hinaus haben Markern, die zuverlässig unterscheiden auditive gegenüber vestibulären Gruppen von Axonen innerhalb der Vogelgrippe VIII. Nerven noch nicht identifiziert werden. Auditive und vestibulären Wege nicht funktional in frühen Embryonen unterschieden werden, als sensorische hervorgerufenen Reaktionen nicht vorhanden sind, bevor die Schaltungen ausgebildet sind. Zentral vorstehenden VIII. Nervenaxone haben in einigen Studien verfolgt worden, aber auditiven Axon Markierung wurde durch Markierung von anderen VIII. Nerven Bauteile ^2,3 begleitet. Hier beschreiben wir eine Methode zur anterograde Tracing von der akustischen ganglion selektiv label auditiven Axone innerhalb des sich entwickelnden VIII. Nerven. Erste, nach teilweiser Durchtrennung des vorderen Schädelbereich des 8-tägiger Hühnerembryos in sauerstoffhaltigen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit eingetaucht wird der Kanal durch Cochlea anatomischen Landmarken identifiziert. Als Nächstes wird ein feiner gezogen Glasmikropipette positioniert, um eine kleine Menge an Rhodamin Dextran Amin in den Kanal und benachbart tiefen Bereich, wo die akustischen Ganglienzellen befinden injizieren. Innerhalb 30 Minuten nach der Injektion werden auditive Axone zentral in den Hinterhirn zurückverfolgt und können später visualisiert werden nach histologischen Vorbereitung. Diese Methode liefert ein nützliches Werkzeug für Entwicklungsstudien der peripheren zum zentralen auditorischen Schaltung Bildung.

Protokoll

Ein. Bereiten Sie die folgenden Dissection Tools und Reagenzien

Künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF; 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM NaHCO _{3, 3} mM HEPES, 10 mM Glucose, 2 mM CaCl _2, 1,3 mM MgSO ₄₎ kontinuierlich mit 95% O infundiert _2/5% CO ₂ bei Raumtemperatur. Infusionslösung, zu 2/3 eine 500 ml Nalgene Weithals-Glas mit einem Loch im Deckel gebohrt füllen. Tank wird über einen Schlauch zu einem Glasfuß Gasspüler, der die aCSF dringt durch das Loch im Glas Deckel befestigt werden. Passen Druck, um einen konstanten Strom von Blasen, die etwa 1/3 der Flüssigkeit zu erreichen, sind aber nicht stark genug, um zu bewirken spritzt über die Felge zu erhalten. Submerge 5 ml Glasampullen (bis 6) in das Glas zu Nalgene einzelnen Proben voneinander und aus dem Gasstrom Turbulenzen zu trennen. ACSF sollte mindestens 20 Minuten vor jedem Gewebe Inkubationszeit Sauerstoff versorgt werden.
Kleine Silikon-Dissektion Teller (35 mm x 10mm Petri beschichtet mit Sylgard Elastomere Kit) mit zwei Dissektion Stifte in kleine sechseckige Polystyrol gelegt (47 mm unten) Wiegeschiffchen.
Zwei feinen Spitze-Zange, eine gekrümmte Spitze-Zange, einer 50 ml-Becher, und einen Behälter für das Tissue Abfall.
Gezogen Glasmikropipette (1,2 OD / 0,9 ID) zerbrochen zu etwa 20-50 um die Öffnung an der Spitze und mit Rhodamin Dextran Amin (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) in einer 6,25% igen Lösung mit 0,4% Triton X-100 in PBS . Bringen Sie durch feine Schlauch an picospritzer und Mikromanipulator stabilisieren.

2. Micro-Dissektion Basilar Papilla am E8 ^4,5 Reveal

Mit gebogenen Pinzette, schneiden E8 Embryo direkt unter dem Hirnstamm, indem Kopf direkt auf silikonbeschichteten Dissektion Gericht in Wiegeschiffchen.
Mit Dissektion Stifte, positionieren Sie den Kopf mit einem ventral so das Ohr auf der Seite von Interesse ist leicht sichtbar, geneigt der Kopf leicht nach dorsal und zeigt 10-30 Grad weg von center (Abbildung 2A). Unmittelbar sichern den Kopf mit Stiften. Wenn bilateralen Ablaufverfolgung gewünscht wird, in der Mitte der Kopf bei 0 Grad, oder eine vollständige ventral, so dass beide Seiten zugegriffen werden kann. Ähnliches gilt bei einer linksseitigen Injektion, sichern den Kopf bei -10 bis -30 Grad von der Mitte, so dass die linke Seite zugänglich ist.
Mit dem 50-ml-Becher, übertragen 30 ml des oxygenierten aCSF in die Schüssel, voll Eintauchen des Gewebes.
Fassen und schälen sich den Unterkiefer mit feiner Spitze Pinzette, dann entfernen Sie das untere Augenlid auf der Seite von Interesse.
Entfernen Sie den darüberliegenden Gefäßgewebe, einschließlich aller übrigen Gaumen und Kehle. Diese weichen Geweben sollte abzuschälen enthüllt die glatte Oberfläche zu entwickeln Chondrocranium mit den unverwechselbaren Vertebralarterien an seiner Oberfläche. Zu diesem Zeitpunkt sollte die charakteristischen weißen otoconial Masse sichtbar sein.
Vorsichtig zu sezieren die Haut um den äußeren Gehörgang, Knorpel des Kiefergelenks und des Mittelohrs, während die inner Ohr intakt. Verwenden Sie die Pinzette vorsichtig weggeschnitten diese knorpeligen Strukturen.
Entfernen Vertebralarterien und Bündelung Blut mit einem sanften Kehrbewegung mit den feinen Pinzette Tipps. Blut kann darüber hinwegtäuschen, Ansicht und Koagulation kann die Injektionspipette Öffnung stecken.
Das Cochlea Kanal mit benachbarten Sinnesepithel (basilaris Papilla) und akustische Ganglion liegt direkt unterhalb der Chondrocranium ⁶ und kann als länglicher fingerartigen Vorsprung aus dem Innenohr ventral, mit der am weitesten distalen Spitze (Apex) in der Nähe des vorderen visualisiert Mittellinie ^5. Es kann eine kleine Ansammlung von Blut (rote) werden aus der Dissektion und / oder otolithic Verkalkungen (weiß) im Scheitelpunkt des Cochlea Kanal (2B), die in Visualisierung unterstützen kann. An der Spitze ist die lagenar Makula, dachte eine sensorische Patch der vestibulären Funktion ^7,8 sein.

3. Selektive Markierung von CN VIII Auditory Fibers

Legen Sie die Injektionspipette in der Nähe des Embryos Fläche an der Ductus cochlearis und basiläre Papille Region.
Langsam senken die Mikropipette zum ersten Punktion der Schädel. Diese Oberkopf ist dünner als die Umgebung und erfordert weniger Kraftaufwand zu durchdringen. Die Mikropipette sollte nun im Inneren des Ductus cochlearis sein. Optional: eine kleine Injektion von Tracing Farbstoff kann hier gemacht werden, um in die Visualisierung der basilaris Papilla unterstützen.
Ohne Neupositionierung der Mikropipette weiter senken, bis es nur Verstöße gegen die tief Rand des Ductus cochlearis (Abbildung 1). Durchführen einer Injektion und wiederholen hier in mehreren Bereichen entlang der Länge des basilaren Papille (2C, 2D) mit Ausnahme des am meisten proximalen Spitze, wo der vestibulären Lagena befindet. Mit dem picospritzer zwischen 10-30 psi eingestellt ist, werden mehrere Injektionen gemacht. Das Volumen des injizierten Farbstoff Fluids variiert und hängt von dem Ausmaß der gewünschten Etikettierung. Jede Injektion sollte in einem Fluoreszenzfarbstoff-la führenBeled Ort von etwa 200 bis 400 Mikrometer Durchmesser (2D).
Sobald die Injektion abgeschlossen ist, verwenden Pinzette, um die Probe oberhalb des Hirnstamms durchschneiden und verwenden Sie eine Pipette, um den kaudalen Teil in einen kleinen Topf legen im Behälter aCSF kontinuierlich mit 95% O _2/5% CO ₂ durchströmt.
Für jedes Embryo erlauben 20-30 min zur Farbstoffübertragung, abhängig vom Abstand der zentralen Tracing gewünscht.
Entfernen Gewebe und die Vorbereitungen für histologische Schnitte. In dem hier gezeigten Beispiel wird Gewebe in 4% Paraformaldehyd (in 1X PBS) über Nacht, 30% Saccharose (in 1X PBS) über Nacht eingetaucht.

4. Gegenfärbung und Analyse

Gegenfärbung ist nützlich, um zu helfen orient der Beobachter an anatomische Lage sowie zu identifizieren bestimmte Regionen von Interesse. Eine wirksame Gegenfärbung in dieser Zubereitung ist Neurofilament Immunmarkierung (Figuren 1, 3B, 3E), die stark l MitAbels Axonen und ermöglicht Abgrenzung der axonalen Bahnen im ZNS.
Analyse sollte während der markierten Region durchgeführt werden, wie die Vorsprünge können mehrere hundert Mikrometer oder mehr entlang der Achse rostrokaudalen erstrecken. Einige Beispiele für grundlegende Untersuchungen sind: Targeting Fehlerraten, Timing und / oder Veränderungen der Divergenz der Projektionsmuster. RDA-markierte Axone visualisiert im peripheren und zentralen Nervensystems mit hoher Auflösung (3A, 3D).