Methodenartikel

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

DOI:

10.3791/50312

⸱

30. April 2013

 , 
1Department of Physiology, University of California, Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die elektrische Aktivität von einzelnen Neuronen identifiziert in einer ganzen Gehirn Vorbereitung, die komplexe neuronale Schaltkreise bewahrt aufzeichnen. Wir verwenden transgene Fische in der Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit einem fluoreszierenden Protein zur Identifikation der intakten Zubereitung markiert sind.

Zusammenfassung

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Das Verständnis der Zellphysiologie von neuronalen Schaltkreise, die komplexe Verhalten regulieren stark verbessert, indem Modellsystemen in denen diese Arbeiten in einer intakten Zubereitung bei der neuronalen Schaltkreise des ZNS intakt durchgeführt werden kann. Wir verwenden transgene Fische in dem Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit dem grün fluoreszierenden Protein für die Identifizierung im intakten Gehirn sind verschlagwortet. Fische haben mehrere Populationen von GnRH Neuronen und ihre Funktionen sind abhängig von ihrer Lage im Gehirn und dem GnRH-Gen, dass sie 1 auszudrücken. Wir haben unsere Demonstration am GnRH3 Neuronen in den Terminal Nerven (TN) mit den Riechkolben mit dem intakten Gehirn von transgenen Medaka Fisch (Abbildung 1B und C) verbunden befindet konzentriert. Studien zeigen, dass Medaka TN-GnRH3 Neuronen neuromodulatory sind, als ein Sender von der externen Umgebung des zentralen Nervensystems; they spielen keine direkte Rolle bei der Regulierung der Hypophysen-Gonaden-Funktionen, wie auch die bekannte Hypothalamus GNRH1 Neuronen 2, 3. Das Tonikum Muster der spontanen Aktionspotentiale Abfeuern von TN-GnRH3 Neuronen eine intrinsische Eigenschaft 4-6, die Frequenz von denen durch visuelle Hinweise von Artgenossen 2 und dem Neuropeptid kisspeptin 1 5 moduliert. In diesem Video, verwenden wir eine stabile Linie von transgenen Medaka in dem TN-GnRH3 Neuronen exprimieren ein Transgen enthält die Promotor-Region des Gnrh3 verknüpft enhanced green fluorescent protein 7, Ihnen zu zeigen, wie man Neuronen identifizieren und überwachen ihre elektrische Aktivität im gesamten Gehirns Zubereitung 6.

Protokoll

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1. Präparation der Gehirne von Adult Medaka

  1. Anesthetize erwachsenen männlichen oder weiblichen (Abbildung 1A) durch Eintauchen in 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4); warten Sie ein paar Minuten nach der Kiemen Bewegungen vor enthaupten aufgehört. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of California-Los Angeles genehmigt.
  2. Enthaupte den Fisch in Fisch Kochsalzlösung am kaudalen Ende des Verschlusses mit einer Schere in einer 60-mm-Petrischale.
  3. Übertragen Fischkopf zu einer 35-mm-Durchmesser Petrischale, halb Fisch mit Kochsalzlösung gefüllt und innen mit Sylgard, die eine Vertiefung in sie zu positionieren und sichern den Kopf für Gehirnsezierung hat. Position und sichern Sie den Kopf dorsal-Seite mit Insekten Pins.
  4. Schneiden Sie vorsichtig die dorsale Teil des Schädels um ihren Umfang mit einer feinen Schere und entfernen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette, Aussetzen der dorsale Teil des Gehirns vollständig einschließlich der vordere Teil des Rückenmarks.
  5. Heben Sie das Rückenmark vorsichtig mit feinen Spitze Zange durchtrennen und die bilateralen Binde Nerven mit spitzen Schere: Hirnnerven, Spinalnerven und Sehnerven an der Bauchseite des Gehirns, und die olfaktorischen Nerven am vorderen Teil des das Gehirn.
  6. Setzen Sie den vollständig seziert Gehirn in einer frischen Petrischale mit Fisch Kochsalzlösung gefüllt, und überprüfen Sie sorgfältig unter die Lupe, um sicherzustellen, das ganze Gehirn intakt ist (einschließlich der Hypophyse) ohne Schnitte oder Einstiche. Beschädigte Gehirne sind nicht für Experimente verwendet.

2. Montage des Gehirn in einem Recording Kammer

  1. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber oder andere schnell wirkende Kleber mit einer Nadel in der Mitte der Aufnahme Kammer und verteilt den Kleber etwa 1 cm 2.
  2. Schnell das Gehirn übertragen und kleben Sie es in einem ventral-Seite nach oben.
  3. 1 ml Kochsalzlösung Fisch so dass sie die Aufnahme Kammer füllt und deckt das Gehirn. Kontinuierlich perfundierendas Gehirn mit belüfteten Fisch Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von mindestens 200 ml / min.
  4. Mit der feinen Spitze-Pinzette vorsichtig die Hirnhäute über die Oberfläche der Aufnahme Bereich des Gehirns.

3. Elektrophysiologie

  1. Lose Patch Aufnahme von Aktionspotential Brennen
    1. Glas-Mikroelektroden (6-10 MQ) werden aus Borosilikatglas Pipetten (1B150F-4, World Precision Instruments) unter Verwendung einer Elektrode Abzieher (z. B. Sutter P-87) gebaut, und zurück mit dem losen-patch Recording-Lösung auf halber Höhe der gefüllte Elektrode.
    2. Verwendung eines aufrecht Fluoreszenzmikroskop mit einem gekühlten charge-coupled device (CCD)-Kamera, um den GFP-exprimierenden TN-GnRH3 Neuronen durch 10x (1B), dann 40x Wasserimmersionsobjektiven (Abbildung 1C). Sie werden an oder nahe der ventralen Oberfläche der Riechkolben, knapp vor dem telencephalon entfernt.
    3. Wechseln Sie zu einem Video-Monitor, bietetEchtzeit-Bilder aus dem Mikroskop, um den TN-GnRH3 Neuron Cluster (Abbildung 1C) zu lokalisieren.
    4. Positionieren der Mikroelektrode in das Bad, so daß die Spitze der Elektrode über dem Neuron Ziel ist. Bewerben konstanten leichten Überdruck der Mikroelektroden, so dass sie nicht verstopft werden, und sanft nähern sich dem Ziel Neuron mit der Spitze der Elektrode.
    5. Überprüfen und überwachen die Elektrode Widerstand in Voltage-Clamp-Modus mit AxoGraph Software und Verstärker Axoclamp 200B mit Axograph Software (Axon Instruments). Wenn man von dem Videomonitor, dass die Spitze der Elektrode auf der Oberfläche des Neurons und der AxoGraph Anzeige, dass der Widerstand leicht ändert, lassen Sie die Überdruck und mit leichtem Unterdruck, wenn notwendig, einen niedrigen Widerstand Siegel machen das Neuron (<100 M).
    6. Wechseln Sie zu Current-Clamp-Modus, und notieren Sie die Membran Spannung kontinuierlich ohne Strom-Eingang, Einstellung der Waageder Spannung und der Geschwindigkeit der Aufnahme, wenn nötig. Die Daten werden gesammelt und durch Powerlab Software (ADInstruments Inc.) analysiert.
    7. Nimm Baseline elektrische Aktivität in normalen Fisch Kochsalzlösung für ca. 5 min vor jeder Behandlung (Abbildung 2A). Bath Perfusion von Arzneimitteln, Hormonen, Peptiden, etc. zugegeben, um Fisch Kochsalzlösung weiterhin mit einer Rate von 200 ml / min, durch eine Auswaschung in normale Fische Kochsalzlösung 5, 6, 11 gefolgt.
  2. Whole cell recording des Membranpotentials
    Die gesamte Patch-Clamp-Elektrophysiologie Verfahren ist das gleiche wie das der extrazellulären lose Patch Aufnahme oben beschriebenen Verfahren aus den Schritten 3.1.1 - 3.1.4. Dann werden die Verfahren entsprechend abweichen:
    1. Überprüfen und überwachen die Elektrode Widerstand in Voltage-Clamp-Modus. Wenn man von dem Videomonitor, dass die Spitze der Elektrode auf der Oberfläche des Neurons und der auf dem Oszilloskop ist, dass sich der Widerstand leicht freigeben positiveDruck und gelten ein wenig Unterdruck auf einen hohen Widerstand Siegel auf dem Neuron (~ 3 Giga Ω) zu machen. Bewerben sanfte Saugwirkung durch den Mund zu zerreißen die gepatchte Membran, du wirst einen plötzlichen Abfall des Widerstandes auf etwa 120-250 MOhm sehen.
    2. Wechseln Sie zu Current-Clamp-Modus, und notieren Sie die Membran Spannung kontinuierlich ohne Stromaufnahme, die Anpassung der Skala von Spannung und Geschwindigkeit der Aufnahme, wenn nötig.
    3. Nimm Baseline elektrische Aktivität in normalen Fisch Kochsalzlösung für ca. 5 min vor jeder Behandlung, wie oben in 3.1.7 (2B) beschrieben.

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Ergebnisse

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Ein Beispiel für bilaterale Cluster von GFP-markierten TN-GnRH3 Neuronen aus dem Gehirn herausgeschnitten Medakafisches sind in den 1B und 1C gezeigt. Jeder Cluster enthält etwa 8-10 GnRH Neuronen. Die spontanen neuronalen Aktivitäten des Ziel-TN-GnRH3 wurden in Current-Clamp-Modus (I = 0) mit typischen Feuerraten von 0,5-6 Hz aufgezeichnet. Das Muster der Aktionspotential Brennen ist typischerweise ein Tonic oder gegen Muster, mit einer ziemlich regelmäßigen Interspike Intervall. Probe...

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Diskussion

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GnRH 3: GFP transgenen Fische bieten einzigartige Modelle, die neurophysiologischen Mechanismen neuronaler Integration und Regulierung in zentralen Steuerung von Verhaltensweisen, die sowohl direkt als auch indirekt in der Reproduktion 3, 8-10 beteiligt sind studieren. Einer der wesentlichen Vorteile dieses Modells besteht darin, dass viele GnRH3 Neuronen, die GFP in der Nähe der ventralen Oberfläche des Gehirns sind, so dass für relativ einfachen Zugang zu den Neuronen für elektrophysiologische Aufz...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Wir danken Herrn Dr. Meng-Chin Lin und Frau Yuan Dong für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health HD053767 (Unterauftrag NLW) und durch Mittel aus dem Institut für Physiologie und Büro des Vizekanzlers für Forschung, University of California-Los Angeles (NLW) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MikroskopOlympusBX50W (aufrecht)
VerstärkerAxon InstrumentsAxoclamp 200B
A-D-WandlerComputer Interference Corp.Digidata ITC-18
Gekühlte CCD-KameraPCO Computer OpticsSensicam
XenonlampeSutter Instruments Co.
GFP-FiltersetChroma Technologies
Imaging SoftwareIntelligent Imaging InnovationsSlidebook-Software
Elektrophysiologie-DatenerfassungssoftwareAxon InstrumentsAxograph-Software
Elektrophysiologie-DatenerfassungssoftwareAD Instruments Inc.PowerLab
Headstage für ElektrophysiologieAxon InstrumentsCV 203BU
MikromanipulatorSutter Instrument CoMP-285
Recording Chamber PlatformWarner Instrument Corp.P1
AufnahmekammerWarner Instrument Corp.RC-26G
ElektrodenabzieherSutter InstrumentsP87
Filament für ElektrodenabzieherSutter InstrumentsFB330B3,0 mm breites Trogfilament
1,5 mm GlaskapillarenWorld Precision Instruments1B150-4Micr– Lektrode zur Aufzeichnung
SpritzeBecton Dickinson3095863 ml
MS-222 SigmaE10521-10GEthyl-3-aminobenzoat Methansulfonat Salz
Kochsalzlösung Fisch KochsalzlösungmM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES
Elektrodenlösung (Loose-Patch) mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 Glukose
Elektrodenlösung (Ganzzellpflaster) mM: 112,5 K-Gluconat; NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 Leupeptin; 10 Phospho-Kreatin

Referenzen

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  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909(2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).

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Schlagwörter

GnRH Neuronenelektrophysiologische AbleitungGFP MarkierungPatch ClampFluoreszenzmikroskopieAktionspotenzialMembranpotenzialGehirnpr paration

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