Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

Zusammenfassung

Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard für die Beurteilung der Nierenfunktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit hohem Durchsatz, die die Bestimmung der GFR bei wachen Mäusen unter Verwendung einer einzigen Bolusinjektion Bestimmung Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Inulin in Plasma und Berechnung der GFR durch eine Zwei-Phasen-exponentiellen Modell ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard in der Nierenfunktion Einschätzung. Zurzeit bestimmen Ermittler GFR durch Messen des Pegels des endogenen Biomarker Kreatinin oder exogen applizierten radioaktiv markierten Inulin ⁽³ H oder ¹⁴ C). Kreatinin hat den wesentlichen Nachteil, dass proximalen tubulären Sekretion Konten für ~ 50% der gesamten Kreatinin-Ausscheidung und damit Kreatinin kein verlässlicher Marker GFR. Je nach Experiment durchgeführt, kann Inulin-Clearance durch eine intravenöse einzigen Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion (intravenös oder osmotische Minipumpe) bestimmt werden. Beide Ansätze erfordern die Sammlung von Plasma oder Plasma und Urin sind. Andere Nachteile von radioaktiv markierten Inulin enthalten sind die Nutzung von Isotopen, zeitaufwendig chirurgische Vorbereitung der Tiere, und die Forderung nach einer Terminal Experiment. Hier beschreiben wir eine Methode, die einen einzigen Bolus-Injektion von verwendetFluoreszeinisothiocyanat-(FITC) markiert Inulin und die Messung der Fluoreszenz in 1-2 ul verdünntem Plasma. Durch die Anwendung eines Zwei-Kammer-Modell mit 8 Blutsammlungen pro Maus, ist es möglich, in GFR messen bis zu 24 Mäuse pro Tag mit einem speziellen Workflow-Protokoll. Diese Methode erfordert nur kurze Isofluran-Narkose mit allen Blutproben in einer nicht-zurückhaltend und wach Maus gesammelt. Ein weiterer Vorteil ist, dass es möglich ist, Mäusen über einen Zeitraum von mehreren Monaten und Behandlungen (dh tun gepaart Experimente mit Veränderungen in der Ernährung oder medikamentöse Anwendungen) folgen. Wir hoffen, dass diese Technik von Mess-GFR nützlich für andere Forscher studieren Maus Nierenfunktion und weniger genaue Methoden zur Schätzung der Nierenfunktion, wie Plasma-Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff zu ersetzen.

Einleitung

Die Geschwindigkeit der Bildung von Plasma-Ultrafiltrat am Glomerulus hat sich die Grundlage für die Beurteilung der Nierenfunktion (glomeruläre Filtrationsrate, GFR). Der ideale Marker GFR bestimmen sollte frei gefiltert werden, weder sezerniert oder resorbiert und nicht metabolisiert. Ein solches Verhalten wurde festgestellt, dass für Inulin wahr, und Inulin-Clearance hat sich eine Gold-Standard zur Bestimmung der GFR ^3. Während die Clearance von Kreatinin wird weitgehend als ein Maß der GFR bei Menschen und Tieren eingesetzt werden, stellt Kreatinin erfüllen nicht die Anforderungen an ein ideales GFR-Marker. Rund 10 - 40% der Kreatinin-Clearance beim Menschen ist die Folge der aktive tubuläre Sekretion ^{1, 11,} und die renale Sekretion von Kreatinin ist auch prominent in Mäusen und Ratten ^{4, 7, 9, 22.} Nierenfunktionsstörung ist bekannt, dass die röhrenförmige Sekretion von Kreatinin, was deren Wert begrenzt als Marker der GFR ^{1, 2} erhöhen. Wir haben bereits, dass organisches Anion Transporter Isoform gezeigt3 (OAT3) trägt zur Maus Kreatinin-Sekretion ^22. Jedoch Inulin-Clearance erfordert typischerweise die Verwendung von radioaktiv markierten Inulin ⁽³ H oder ¹⁴ C). Die radioaktive Bestimmung von Inulin kann sowohl betäubt und wachen Mäusen verwendet werden, sondern birgt den Nachteil zahlreicher Sicherheitsvorschriften und Handhabung strenge Fragen bei der Verwendung radioaktiver Isotope. Entlang dieser Linien, sind chirurgische Clearance Vorbereitungen zur Bestimmung der GFR zeitaufwendig sowie Terminal in der Natur. 1999 Lorenz et al. ¹² eingeführt FITC-Inulin als Marker der einzige Nephron GFR bei narkotisierten Mäusen. Fünf Jahre später Qi et al. Bestimmt ganze ¹⁵ GFR in wachen Mäusen mit FITC-Inulin. Alternative Protokolle sind jetzt mit FITC-Inulin als exogene Marker GFR in bewusste und narkotisierten Mäusen messen. Diese Protokolle behalten die Empfindlichkeit des radioaktiven Inulin mit Fluoreszenz DETECTIauf und umgeht die Nachteile der Zusammenarbeit mit einem radioaktiv markierten Marker. Die FITC-Inulin Assay wurde von anderen ^{7, 8} und uns ^{22, 23} modifiziert werden, um die Vorteile der Mikrovolumen Fähigkeit des NanoDrop 3300 Fluorospektrometer nehmen. Dies ermöglicht die Verringerung der gesamten Probenmenge benötigt, um <100 ul Blut pro GFR-Messung.

Mit dem Verfahren und Hochdurchsatz-Protokoll in dieser Veröffentlichung zeigen wir die Machbarkeit von Mess-GFR in bis zu 24 Mäuse pro Tag bewusst. Diese Technik könnte nützlich sein, um andere Forscher studieren Maus GFR und wir hoffen, dass es weniger genaue Methoden als Indizes für die Nierenfunktion, wie Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff zu ersetzen.

Protokoll

1. Lösungen

1. 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l ddH ₂ O (8,5 g / L).
2. 0,5 mol / l HEPES pH 7,4 (59,6 g gelöst in 0,5 L HEPES ddH ₂ 0 und pH-Wert auf 7,4 mit 10 N NaOH).

2. Herstellung von FITC-Inulin Injektionslösung

1. Wiegen FITC-Inulin eine 5% ige Lösung herzustellen und in 0,85% NaCl (in der Regel 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) aufgelöst durch Erwärmen auf 90 ° C bis zur vollständigen Auflösung.
2. Wiegen Sie gelösten FITC-Inulin-Lösung und Gewichtsangaben beachten.
3. Schneiden Sie ein 20 cm Stück Dialysemembran (molecular weight cut-off: 1.000) und in _ddH2O für 30 min, um das restliche NaN ₃ von der Membran zu entfernen und bündig ein paar Mal danach.
4. Füllen gelöst FITC-Inulin in Dialysemembran und Dichtung richtig mit Verschlüssen.
5. Wiegen gesamte Dialysemembran.
6. Legen Sie die Dialysemembran in 1 L 0,85% NaCl-Lösung und langsam rühren für 24 h bei ro-Licht geschütztom Temperatur.
7. Wiegen gesamte Dialysemembran wieder und berechnen Sie die neue Konzentration (Wasser osmotisch in die Membran und ungebundenen FITC verschieben oder gebunden FITC-Inulin <1.000 Molekulargewicht bewegen wird aus der Membran, damit die Konzentration von FITC-Inulin wird erheblich verringern) .
8. Die neue FITC-Inulin-Konzentration (c) berechnet sich nach folgender Formel: c = n / V, wobei n = initial FITC-Inulin Menge, V = new Volumen (Unterschied im Gewicht von Dialyseschlauch vor und nach der Dialyse sowie Volumen der anfänglichen FITC-Inulin-Lösung).
9. Vor dem Gebrauch sterilisieren dialysierten FITC-Inulin Lösung durch Filtration durch ein 0,22 um Filter Spritze.
10. FITC-Inulin aus Licht (Aluminiumfolie) Halten bei 4 ° C geschützt Dialysiert und sterilisiert FITC-Inulin kann für bis zu 2 Wochen verwendet werden. Teilgenommen FITC-Inulin durch erneutes Erwärmen kann bei 90 ° C werden für ein paar Minuten gelöst.

Hinweis: Wenn SieFITC-Sinistrin ^16-18, die keine Dialyse können alle Schritte für die Dialyse erforderlichen übersprungen.

3. Injektions-und Blutentnahme

1. Nehmen Körpergewicht (KG) der Mäuse vor dem Experiment.
2. Anesthetize Mäuse kurz mit Isofluran.
3. Für hohen Durchsatz von 6 Mäusen folgen Sie bitte Protokoll in Abbildung 3 vorgesehen.
4. Spritzen 2 ul / g bw dialysiertes FITC-Inulin in den Plexus retroorbitalen ²⁴ durch die Verwendung eines G30 ½ in Nadel (entfernen Luftblasen aus 100 ul Hamilton Spritze indem Sie zuerst eine G26 ½ in Nadel-und dann der Wechsel zu einem G30 ½ in Nadel für Injektion).
5. Cut 1 mm von Maus Schwanz mit einer Schere einmal sammeln und Blut bei 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 und 75 min nach der Injektion in Na-Heparin minicapillaries. Seal minicapillaries nach der Blutentnahme mit Cha-Siegel.
6. Die Proben vor Licht geschützt.
7. Setzen versiegelten minicapillaries innerhalb Hämatocrit Kapillaren und Zentrifuge für 5 min.
8. Brechen minicapillaries mithilfe eines Diamantschneiders und Transfer gesamte Plasma durch Pipettieren in einer 0,2-ml-Tube.
9. Machen Sie eine 1:10-Verdünnung mit 2 ul Plasma und 18 ul 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4) in neuen 0,2 ml Röhrchen (Proben konnten über Nacht bei 4 ° C gelagert werden für die Fluoreszenz-Messungen).
10. Maßnahme 2 ul verdünnte Probe mit NanoDrop 3300 in Duplikate. Die Beschreibung und die Nutzung des Instruments ist hier ⁵ beschrieben.

4. Herstellung von Standards

1. Sammle Blut von Mäusen aus dem gleichen Hintergrund Stamm in Heparin beschichtet Hämatokritkapillaren, Spin-down und 1:10 verdünnen mit 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), in der Regel 80 ul Plasma + 720 ul HEPES.
2. Verdünnen FITC-Inulin Injektionslösung mit verdünnter Mäuseplasma folgende Standardverdünnungen erhalten:
   01.10: 10 ul unverdünnt FITC-Inulin-Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma
   1:100: 10 & mu; L (1:10) Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma
   1:1000: 10 ul (1:100) Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma
   1:2.000: 30 ul (1:1)-Lösung + 30 ul verdünnte Mäuseplasma
   1:10.000: 10 ul (1:5)-Lösung + 40 ul verdünnte Mäuseplasma
   1:20.000: 20 ul (1:1)-Lösung + 20 ul verdünnte Mäuseplasma
   1:100.000: 10 ul (1:5)-Lösung + 40 ul verdünnte Mäuseplasma
   Die Konzentration der Standards auf der Dialyse abhängig und wird immer für jede Zubereitung von FITC-Inulin. Es ist notwendig, die Konzentration des Standard-Kurve immer wieder neu ein.
3. Analysieren von Daten zu GFR mit der entsprechenden Software (zB GraphPad Prism) berechnen durch Verwendung eines Zwei-Phasen-exponentiellen Funktion wie in hier ^{15, 20} beschrieben und in Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.

Ergebnisse

GFR wird anhand der folgenden Formel berechnet werden:

GFR = n / (A/K1 + B/K2), wo

n = eingespritzte Menge (n = c • V, wobei c = FITC-Inulin Konzentration, V = injizierte Volumen)
A = span1, der Beseitigung y-Achsenabschnitt
K1 = Abklingkonstante zur Beseitigung
B = span2, y-Achsenabschnitt der Verteilung
K2 = Zerfallskonstante für den Vertrieb

Hinweis: A, K1, K2 und B Abkürzungen von GraphPad Prism, jede Software geeignet zur Analyse von zwei Phase exponentiellen Abfall gegeben genutzt werden kann, aber auch andere wissenschaftliche Software können unterschiedliche Abkürzungen verwenden.

Durch die Verwendung eines Zwei-Phasen-exponentiellen Kurvenanpassung, die auf Plasma FITC-Inulin-Konzentrationen basiert, sollte eine Kurve vergleichbar mit der in Fig. 1 gezeigt ist, erhalten werden. Berechnung GFR durch die oben gezeigte Formel (und, wie hier beschrieben ^{20) ermöglicht eine Beeinträchtigung der Nierenfunktion 15 oder glomeruläre Hyperfiltration 8, 23 zu erkennen als bei Mäusen mit Diabetes mellitus Typ 1 (Abbildung 2).}

Abbildung 1. Um GFR in wachen Mäusen messen, Plasmakinetik von FITC-Inulin nach einer Einzel-Dosis intravenöse Injektion verwendet wird. Für die Berechnung der GFR wird ein Zwei-Kammer-Modell eingesetzt. In dem Zwei-Kammer-Modell stellt die anfänglichen schnellen Abklingphase Umverteilung von FITC-Inulin aus der intravaskulären Abteil der extrazellulären Flüssigkeit. Die späteren Phase mit langsamer Zerfall in FITC-Inulin Konzentration, vorherrschend spiegelt systemische Clearance aus dem Plasma.

Abbildung 2. Detection der diabetischen Hyperfiltration in Wildtyp-Mäusen. Typ I-Diabetes mellitus wurde durch intraperitoneale Anwendung von Streptozotocin (STZ, 50 mg / kg an 5 aufeinanderfolgenden Tagen). GFR wurde vor (basal) und 5 Wochen nach Induktion des Diabetes bestimmt. Aufgrund tubuloglomerulären Feedback bewirkt eine Zunahme der primären proximalen Resorption frühen diabetischen Hyperfiltration ²¹ ein Befund, der reproduzierbar ist in Wildtyp-Mäusen (n = 10, p <0,01 vs basale gleichen Maus).

Abbildung 3. Flussdiagramm für die Messung der GFR in einem Satz von 6 Mäusen. Um ganze GFR durch den einzigen Bolus-Injektion Verfahren zu messen, muss 8 Blutproben bei 3, 5 gesammelt werden, 7, 10, 15, 35, 56 und 75 min nach FITC-Inulin Injektion. Die Zahlen geben Zeitpunkten. Die Zahlen in Klammern geben Stichprobengröße. Die Zeitpunkte der vertikale rote Linie links zeigen InjektionZeitpunkten (bei 0, 11, 22, 33, 44 und 55 min). Jede Maus wird mit einer anderen Farbe markiert. Um sequentielle Blutsammlungen bekommen folgen Sie den Pfeilen. Graue Felder zeigen an, wann die nächste Maus für Isofluran-Narkose vor der Injektion muss vorbereitet werden. Über dieses Protokoll die minimale Zeit zwischen 2 Blutentnahmen aus verschiedenen Mäusen ist 1 min.

Diskussion

Die vorliegende Studie beschreibt eine Technik zur Bestimmung der GFR in wachen Mäusen durch Single-Bolus-Injektion und Analyse von Fluoreszenz in 8 Blutproben mittels Zweiphasen-exponentiellen Abfall. Eine GFR Messung in 1 Maus dauert 75 min. Durch Verwendung eines speziellen Flussdiagramm, ist es möglich, die GFR von 6 Mäusen in 130 min zu messen. Es ist möglich, dieses Flussdiagramm-Protokoll bis zu 4 Mal pro Tag wiederholen und messen GFR in 24 Mäuse. Wir modifizierten diese Methode, so dass es möglich ist, Blut aus einem kleinen Schwanz snip anstatt Schwanzvene Punktion, die schneller und einfacher für Ermittler im Vergleich zu Schwanzvene Punktion durchzuführen sammeln. Durch die Verwendung von 10 ul Hämatokritkapillaren und einer 1:10-Verdünnung, ist es möglich, die gesamte Menge des Blutes benötigt, um <100 ul zu reduzieren. Schließlich wird die Fluoreszenz gemessen mit einem NanoDrop 3300 Fluorospektrometer, die Bestimmung der Fluoreszenz ermöglicht in 1-2 ul verdünnten Probe. Diese Methode wird dem interessierten investigatora wahre GFR Wert. Im Gegensatz dazu haben Kreatinin-Messungen bei Mäusen mehrere Schwachstellen, darunter "Kreatinin-blinden Bereich" und Schwierigkeiten im Zusammenhang mit spezifischen und sensitiven Bestimmung. Die "Kreatinin-blinden Bereich" schränkt seine Funktion als Marker für GFR weil Serum-Kreatinin bleibt im normalen Bereich bis 50% der Nierenfunktion ¹⁹ verloren. Da mehrere Forscher genetisch veränderte Mäuse in ihrer Forschung zu Nieren-Physiologie und Pathophysiologie studieren nutzen, trägt dies folgendes Problem: Annahme einer Knockout-Maus von Gen-X würde eine deutlich geringere GFR (um 40%) im Vergleich zu einer Wildtyp-Maus, eine haben einfache Screening durch Vergleich Plasma-Kreatinin würde nicht erkennen diesen Unterschied. Die Notwendigkeit für eine gute genaue Methode zur Bestimmung GFR wird immer kritischer, je kleiner die Unterschiede in GFR geworden.

Mäuse haben hohe Konzentrationen von nicht-Kreatinin Chromagene in ihrem Plasma und Urin, die mit kommerziell störenverfügbar Kreatinin-Assays. Als Folge Assays, die auf der alkalischen picrate Jaffé Reaktion Überschätzung Kreatinin-Konzentration im Plasma bezogen sind mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Bestimmung ^{6, 13} verglichen. Eine weitere Einschränkung ist, dass Serum-Kreatinin ist unterhalb der Nachweisgrenze von mehreren kommerziell erhältlichen Assays im Vergleich zu HPLC-Bestimmung. Durch Verwendung von enzymatischen Reaktionen Ermittler konnten Plasma Kreatinin in Mäusen ^{10, 22} zu bestimmen.

GFR in einem ähnlichen Bereich wurden in wachen Mäusen mit einem vergleichbaren Single-Bolus-Injektion Verfahren sowie Harn-FITC-Inulin-Clearance ¹⁴ gefunden. Im Gegensatz zu ihr Protokoll, unser Protokoll mit Schwanz snip erfordern keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen, um das Gefäß Integrität gegenüber Schwanzvene oder Vena saphena Punktion zu bewahren. Für den Harn / Plasma basierend FITC-Inulin-Clearance ist es notwendig, chirurgisch Implantat zwei osmotischen minipumps. Zwei Pumpen sind notwendig, um hoch genug Steady-State-Plasmaspiegel FITC-Inulin-Konzentrationen, die deutlich vom Hintergrund zu erzielen. Dies erfordert auch die Nutzung der metabolischen Käfigen für eine vollständige und zeitlich Urinsammlung. Die Käfige müssen zur Rechenschaft für einen Verlust von 25-37% des FITC-Inulin, die sonst tritt ohne Spülung gespült werden.

Die Fallstricke der Verwendung dieses FITC-Inulin Verfahren sind begrenzt. Die Ermittler sollten Sie Folgendes beachten: (i) zu gewährleisten, dass es keine Luftblasen in der Spritze für die Injektion des FITC-Lösung verwendet wird, muss (ii) vollständige retrobulbären Injektion erreicht werden, weil die Menge eingespritzt bestimmt die GFR berechnet werden, und ( iii) Mäusen wird höchstwahrscheinlich urinieren während der 75 min GFR Experiment, so dass eine Verschmutzung Blutproben mit Urin, die eine sehr hohe FITC-Inulin Konzentration als Folge der Nieren Konzentrationsfähigkeit haben.

Allgemeine Vorteile of diese FITC-Inulin Verfahren umfassen die folgenden: (i) es ist ein nicht-radioaktives Technik, (ii) es möglich ist, wiederholt Messungen mehrfach in der gleichen Maus, (iii) kann der Assay in wachen Mäusen durchgeführt werden ( iv) keine Urinsammlung erforderlich ist, und (v) eine Hochdurchsatz-Option verwendet werden. Nachteile für die einzelnen Bolus-Injektion sind die Notwendigkeit zur Dialyse von FITC-Inulin, das durch die Verwendung eines besser FITC-Marker, FITC-Sinistrin, die jetzt zur Verfügung steht und kann transkutan gemessen werden unter Verwendung eines speziellen miniaturisierten ¹⁸ überwunden werden können. Obwohl GFR gemessen wird, ist es nicht möglich, fraktionierte Ausscheidungen von Flüssigkeit oder Ionen mit dieser Methode zu messen.

Zusammengenommen bietet dieses Verfahren die Machbarkeit eines High-Throughput-Verfahren zur Messung der GFR in wachen Mäusen. Daher könnte diese Technik von Interesse für andere Forscher, die daran interessiert bei der Bestimmung der Nierenfunktion bei Mäusen sein.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-Inulin	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isofluran	Webster Veterinär-	78366551
Dialysemembran (MWCO 1000)	Spectrum Laboratories	132636
Membranverschluss	Spectrum Laboratorien	132736
80 μ l Hämatokrit-Kapillaren	Drummond Scientific	22362566
Hämatokrit-Zentrifuge	IEC	Micro-MB
10 μ l Na+-Heparin Minicaps	Hirschmann	9000210
Spritze (100 μ l)	Hamilton	80601
Fluorspektrometer	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
Filter (0,22 μ m)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Dichtstoff	Châ-Dichtung	510
Nadeln (G26 ½ und G30 ½)	Becton Dickinson	305111 & 305106